盐酸法舒地尔注射液细菌内毒素检查方法学研究

盐酸法舒地尔注射液细菌内毒素检查方法学研究
发表时间：
2013-11-07T14:29:32.030Z 来源：《医学与法学》2013年第3期供稿 作者： 权晓丹 刘丽英
[导读] 改善及预防蛛网膜 下腔出血术后的脑血管痉挛及随之引起的脑缺血症状。

权晓丹
刘丽英
(
黑龙江三元阳普医药有限公司)

【摘 要】目的：建立盐酸法舒地尔注射液细菌内毒素检查的方法学研究。方法：参照2010 年版《中国药典(二部)》细菌内毒素检查法
进行试验。结果：样品经稀释后对
内毒素检查无干扰，将细菌内毒素限值定为0.5EU/ml，可以选择灵敏度0.25Eu/ml 的鲎试剂进行内毒素
检查。结论：样品在最大稀释倍数内对内毒素检查无干扰。

【关键词】盐酸法舒地尔注射液；细菌内毒素检查法干扰试验

盐酸法舒地尔是一种蛋白激酶抑制剂即细胞内钙离子拮抗剂。改善及预防蛛网膜 下腔出血术后的脑血管痉挛及随之引起的脑缺血症
状。

国际医学专家在病理研究中发现，抑制患者组织内的Rho 激酶异常活跃是治疗心 脑血管疾病的关键，成为国际上的研究热点，盐酸法
舒地尔注射液是国际上唯一一个
已经上市的Rho 激酶抑制剂，由日本旭化成制药株式会社研制成功，1995 年6 月在日 本上市，商品名为

“
依立卢”，规格2ml:30mg。

盐酸法舒地尔注射液在我国研究起步于1997 年，天津市药物研究院和天津红日药 业公司合作研究，并获得国家科技部科技型企业创
新基金支持，于
2004 年获得了国家 二类新药证书，商品名“川威”。目前国内标准[1]采用家兔法进行热原检查，由于细菌 内毒素检查法具
有灵敏、快速、操作简便、结果准确等优点。因此我们参考《中国药
典(二部)》细菌内毒素检查法[2]，对盐酸法舒地尔注射液进行细菌内
毒素检查的可行
性进行研究，报道如下。
1.
实验材料及仪器

鲎试剂：湛江安度斯生物有限公司生产，批号：1010112(灵敏度0.25EU/ml，规 格0.1ml)、批号：1008202(灵敏度0.125EU/ml，规格
0.1ml)
。

细菌内毒素检查用水：湛江安度斯生物有限公司生产，批号1005240，规格5ml。 细菌内毒素工作标准品：批号201070，效价120EU/
支，中国药品生物制品检定
所生产。

旋涡混合器：XW-80A 型，厂家：上海医大仪器厂。 电热恒温水浴锅：DK-98-Z 型，厂家：天津泰斯特仪器有限公司。
2.
试验方法和结果
2.1
灵敏度复核试验 将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，轻摇，然后制成2.0λ、1.0λ、 0.5λ 和0.25λ 的细菌内毒素
工作标准品系列溶液
(每次稀释在旋涡混合器上混合30s)。 用细菌内毒素检查用水将内毒素稀释具体过程如下：

120EU+1ml
水—→120EU/ml—→2EU/ml—→1.0EU/ml(4λ)—→0.5EU/ml —→0.25EU/ml—→0.125EU/ml—→0.0625EU/ml 每一浓度
平行做
4 管，每管加入内毒素标准溶液0.1ml(同时用细菌内毒素检查用 水做2 支阴性对照管)，轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入(37±1)℃

恒温水浴箱中，
保温(60±2)min 后观察。

结果：根据公式λc=lg-1(ΣX/4)，计算出λc=0.210 EU/ml，λc 在0.5λ～2.0λ 范围 内。因此该批号的鲎试剂灵敏度符合要求。根据公式
λc=lg-1(ΣX/4)
，计算出λc=0.105 EU/ml。λc 在0.5λ～2.0λ 范围内。

以上实验说明，批号：1010112(规格0.1ml，灵敏度0.25EU/ml)、批号：1008202(规 格0.1ml，灵敏度0.125EU/ml)的鲎试剂灵敏度符
合要求，可以进行下步试验。

2.2
限度的确定

采用公式L＝K/M(M：以成人每公斤体重每小时给药的最大剂量来计算)，本品 为注射剂，根据用法用量，成人一日2～3 次，每次
30mg
，以50～100ml 的生理盐水 或葡萄糖注射液稀释后静脉滴注，每次静滴时间约为30 分钟，注射时间不足1 小时， 按1 小时计算。

按最大静滴量100ml/ 小时计算， 中国人平均体重60kg 计算， 则M＝ 100÷60÷1=1.67ml/kg/h，故本品的细菌内毒素的理论限值：L＝
5÷1.67=3 Eu/ml
。为保 障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的 药品，可根据计算值适当调
整，严格控制本品内毒素，规定本品的细菌内毒素的限值
L 定为：0.5Eu/ml。

2.3
预干扰试验
2.3.1
供试品溶液的制备

以鲎试剂灵敏度0.125Eu/ml 为基准，按MVD＝LC/λ＝0.5/0.125＝4 倍(C 按 1.0ml/ml 计算)，当灵敏度为λ=0.25EU/ml 时，供试品溶
液的最大稀释倍数为：
2 倍。 供试品溶液15mg/ml—→7.5mg/ml

2.3.2
内毒素溶液的稀释浓度

用细菌内毒素检查用水将内毒素稀释具体过程如下： 120EU+1ml 水—→120EU/ml—→2.0EU/ml —→1.0EU/ml—→0.5EU/ml —
→0.25EU/ml
2.3.3
含供试品及内毒素混合溶液的制备

鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml：取供试品溶液0.1ml 与1.0 EU/ml 内毒素溶液0.1ml 以1:1 比例混合；依此方法依次制成供试品稀释倍数为
1
、2、4、8 分别与1.0EU/ml 内毒素1:1 的混合溶液作为供试品阳性对照溶液。

鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml：取供试品溶液0.1ml 与0.5 EU/ml 内毒素溶液0.1ml 以1:1 比例混合；依此方法依次制成供试品稀释倍数
为
1、2、4、8 分别与0.5EU/ml 内毒素1:1 的混合溶液作为供试品阳性对照溶液。

2.4
样品测定

根据上述确定的稀释浓度，分别取供试品阳性对照溶液、供试品溶液、同时分别 以细菌内毒素浓度0.5 EU/ml 和0.25 EU/ml 为阳性对
照，检查用水做阴性对照。每一
个样品平行做两管，分别向上述测试溶液中加入两个不同灵敏度的鲎试剂，轻轻混匀， 37℃±1℃保温1 小

时，
1 小时后记录试验结果。

结果：依据以上实验结果，在样品稀释倍数为１倍时供试品阳性均为阳性，在稀 释倍数为4 倍(MVD)处也出现全阳性结果，表明此样
品对鲎试剂无干扰，在有效稀释
倍数范围内，可以选择灵敏度高于0.5Eu/ml 的鲎试剂对相应的样品稀释倍数做干扰试 验。

2.5
干扰试验 按中国药典2010 年版二部附录 XI E-细菌内毒素检查法进行干扰试验。 选λ=0.125EU/ml 和λ=0.25EU/ml 鲎试剂。将细
菌内毒素工作标准品分别用细菌内
毒素检查用水稀释至4λ、2λ、1λ、0.5λ 内毒素标准对照溶液(Es)。分取细菌内毒素系 列浓度分别与供试
品溶液
(稀释倍数分别为4 倍、2 倍)按1:1 的比例混合制成2λ、1λ、 0.5λ、0.25λ 的含内毒素的供试品溶液(Et)，并同时进行阴性对照及阳性
对照，
37℃±1 ℃保温1 小时，1 小时后记录试验结果。

供试品稀释过程：1 支供试品(2ml:30mg)—→15mg/ml—→7.5mg/ml 内毒素溶液的稀释浓度：120EU+1ml 水—→120 EU/ml—
→2.0EU/ml—→1.0EU/ml —→0.5EU/ml—→0.25EU/ml—→0.125EU/ml

结果：ES 在0.5λ-2λ 范围内，且Et 也在0.5ES-2λES 之间，说明供试品稀释2 倍、4 倍对检测均没有干扰。
3.
结论：

样品在最大稀释倍数内对内毒素检查无干扰，将细菌内毒素限值定为0.5EU/ml， 可以选择灵敏度高于0.5Eu/ml 的鲎试剂进行内毒素
检查。

参考文献
[1]
盐酸法舒地尔国家药品标准.WS1-(X-110)-2006Z
[2]
国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010 年版二部.北京：化学工业出版社，附 录99.