实验十一 蛋白质脱盐
蛋白质脱盐
蛋白质脱盐——凝胶过滤法【实验目的】了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液【实验原理】目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。
常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。
透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。
凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。
用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。
样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。
一般来就，样品体积不超过床体积的30%。
这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep）决定的。
两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。
它在数值上等于：Vsep=V eB-V eAC1/2 V由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。
如果上柱用的样品体积等于Vsep时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。
为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。
一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。
用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。
在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。
蛋白质透析除盐实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质透析除盐的原理和方法；2. 掌握蛋白质透析除盐的实验操作步骤；3. 熟悉透析袋的使用方法；4. 分析实验结果，探讨影响蛋白质透析除盐效果的因素。
二、实验原理蛋白质透析除盐是一种常用的蛋白质纯化方法，其原理是利用半透膜的特性，使蛋白质分子和盐类分子在透析袋内外进行扩散和平衡。
由于蛋白质分子较大，无法透过半透膜，而盐类分子较小，可以透过半透膜，从而达到去除盐分的目的。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白质样品：猪肝匀浆蛋白溶液；（2）盐溶液：0.5mol/L NaCl溶液；（3）透析袋：截留分子量约为10000的透析袋；（4）蒸馏水；（5）50mL离心管；（6）磁力搅拌器；（7）分析天平；（8）电热恒温水浴锅；（9）超滤膜。
2. 实验仪器：（1）实验材料同上；（2）50mL离心管；（3）磁力搅拌器；（4）分析天平；（5）电热恒温水浴锅；（6）超滤膜。
四、实验步骤1. 配制蛋白质样品：取猪肝匀浆蛋白溶液适量，用0.5mol/L NaCl溶液稀释至10mg/mL。
2. 配制盐溶液：取0.5mol/L NaCl溶液适量，用蒸馏水稀释至1mol/L。
3. 将蛋白质样品转移至透析袋中，并将透析袋放入50mL离心管中。
4. 将透析袋与盐溶液连接，确保透析袋内外液体充分接触。
5. 将离心管放入电热恒温水浴锅中，维持水温在37℃，透析时间为12小时。
6. 透析结束后，将透析袋中的蛋白质样品转移至新的离心管中，用分析天平称量蛋白质样品的质量。
7. 对透析前后的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质的纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质样品质量变化：透析前蛋白质样品质量为2.0g，透析后蛋白质样品质量为1.5g。
2. SDS-PAGE电泳分析：透析前蛋白质样品在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条明显的蛋白质条带，透析后蛋白质条带仍然清晰，说明蛋白质在透析过程中未发生变性。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。
该方法广泛用于生物大分子的分离、纯 化、浓缩等。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
【实验操作】
（一）凝胶的溶胀
取Sephadex G－25， 加入去离子水置室
温溶胀 24小时
以上，反复倾
泻去掉细颗粒，
或沸水浴中煮沸
2～3小时，可去
除颗粒内部的空
气及灭菌。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
（二）连接层析装置
1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。
பைடு நூலகம்
3.加样与洗脱
用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质－硫酸 铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面 之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动 床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间 有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入 凝胶柱中, 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出 液。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
4.收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层
析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般
蛋白质的盐析实验现象及结论
蛋白质的盐析实验现象及结论1. 盐析实验概述说到蛋白质的盐析实验，大家可能会想：“这又是什么鬼？”其实，这个实验简单来说就是用盐来“调戏”蛋白质，让它们变得有趣起来。
就像在聚会上，有些人喝多了就开始跳舞一样，蛋白质在盐的影响下也会发生变化。
那么，盐析到底是怎么回事呢？别着急，我们慢慢来。
1.1 盐析的原理盐析，顾名思义，就是用盐来分离蛋白质。
这个过程就像是给蛋白质下了一场雨，让它们从“聚会”中散开。
盐分的加入会改变溶液的离子环境，让蛋白质的溶解度降低。
就好比一个热闹的聚会，突然来了一个喜欢安静的人，大家就纷纷溜了，最后只剩下他一个。
盐的加入，降低了蛋白质在水中的“活跃度”，使它们聚集在一起，形成沉淀。
1.2 实验步骤要进行这个实验，首先得准备一些纯净的蛋白质溶液。
然后，慢慢加入盐，看看会发生什么变化。
就像给咖啡加糖，慢慢地搅拌，观察变化。
你会发现，随着盐的增加，蛋白质开始逐渐沉淀，形成小团块。
这时候，如果你像个小科学家，认真观察的话，简直就像在看一场魔术秀，惊奇又有趣。
2. 实验现象观察接下来，我们来聊聊这个实验的现象。
真的是“不可思议”啊！你会看到，随着盐的不断加入，溶液的颜色和状态都在发生变化。
就像天气变了，云彩开始聚集一样，蛋白质也开始成团。
此时，别忘了记录下这些有趣的变化，这可是你未来向朋友们炫耀的资本！2.1 沉淀的形成首先，刚开始加入盐的时候，溶液可能看起来还是很清澈，像小溪一样流畅。
但是随着盐的增加，蛋白质就像被施了魔法，慢慢地开始聚集，沉淀下去。
那一瞬间，你会感觉自己仿佛在看一场壮观的水上表演，真的是“美不胜收”。
2.2 变化的色彩此外，盐的加入还会导致溶液的颜色变化。
有时候，颜色会变得更加浓郁，仿佛是在给蛋白质穿上了华丽的舞衣。
简直就是“华丽转身”，让人忍不住想多看几眼。
这些现象不仅好玩，还能帮助我们理解蛋白质的特性，简直是“一举两得”。
3. 实验结论及意义经过一番实验观察，咱们终于可以得出一些结论啦。
实训 透析法去除蛋白质溶液中的无机盐
实训透析法去除蛋白质溶液中的无机盐［任务描述］透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。
例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。
反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。
本工作任务据此采用搅拌透析法去除蛋白质溶液中的无机盐。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集透析法去除蛋白质溶液中的无机盐的文献资料，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备①蛋白质的氯化钠溶液制备用3个除去卵黄的鸡卵蛋清与700mL水及300mL饱和氯化钠溶液混合后，用数层干纱布过滤。
②透析袋的前处理戴手套把透析袋剪成适当长度（通常长度为10cm、20cm和30cm）的小段。
用沸水煮5～10min，再用60℃蒸馏水洗冲2min，然后置于4℃蒸馏水中待用。
若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
（2）试剂双缩脲试剂、10%HNO3溶液，1%AgNO3溶液（3）实训装置如图1所示。
图1透析操作装置示意图二、操作过程（一）操作流程 见图2。
（二）操作步骤（1）将蛋白质溶液做双缩脲反应（若有紫兰色出现，说明有蛋白质）。
（2）取出透析袋，用蒸馏水清洗袋内外。
然后一端用线绳扎紧，或使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液。
（3）取8ml 蛋白质溶液放入透析袋中，并将开口端同样用线绑住并放入盛有蒸馏水的烧杯中。
透析袋装液时应留1/3～1/2空间，以防透析过程中，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破（4）每30min 从烧杯中取水1ml ，用10%HNO 3酸化溶液，再加入1%AgNO 3 1～2d ，检查Cl -的存在。
蛋白质质谱如何脱盐？
蛋白质质谱如何脱盐？蛋白质质谱是一种常用的生物分析技术，可以帮助科学家研究蛋白质的结构和功能。
然而，在进行蛋白质质谱分析之前，通常需要将样品中的盐类去除，以避免干扰质谱信号。
本文将介绍蛋白质质谱脱盐的方法步骤，帮助读者更好地理解这一过程。
1. 胶束吸附法胶束吸附法是一种常见的蛋白质脱盐方法。
该方法利用胶束的特性，将盐类吸附在胶束表面，从而实现蛋白质的脱盐。
具体步骤如下：准备一种适当的胶束溶液，如十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
将待脱盐的蛋白质样品与胶束溶液混合，并充分搅拌。
离心样品，使胶束与蛋白质沉淀。
将上清液转移至新的离心管中，即可得到脱盐后的蛋白质样品。
胶束吸附法的优点是操作简单，适用于大多数蛋白质样品。
然而，该方法可能会引入胶束残留物，对后续实验产生干扰。
2. 水合剂沉淀法水合剂沉淀法是另一种常用的蛋白质脱盐方法。
该方法利用水合剂与盐类形成复合物，从而使蛋白质与盐类分离。
具体步骤如下：准备一种适当的水合剂，如聚乙二醇（PEG）溶液。
将待脱盐的蛋白质样品与水合剂溶液混合，并充分搅拌。
将混合物置于低温环境中，使水合剂与盐类结合形成沉淀。
离心样品，将上清液转移至新的离心管中，即可得到脱盐后的蛋白质样品。
水合剂沉淀法的优点是能够有效去除大部分盐类，适用于对盐敏感的蛋白质样品。
然而，该方法可能会引入水合剂残留物，需要进一步的处理步骤。
3. 水质谱法水质谱法是一种高效的蛋白质脱盐方法，利用质谱仪的特性将盐类与蛋白质分离。
具体步骤如下：将待脱盐的蛋白质样品溶解于适当的溶剂中，如水或有机溶剂。
将样品注入质谱仪中，利用质谱仪的分离功能将盐类与蛋白质分离。
收集质谱仪输出的蛋白质信号，即可得到脱盐后的蛋白质样品。
水质谱法的优点是操作简单、高效，并且不引入任何残留物。
然而，该方法需要使用质谱仪设备，成本较高，不适用于所有实验室。
4. 离子交换法离子交换法是一种常用的蛋白质脱盐方法，利用离子交换树脂将盐类与蛋白质分离。
蛋白质盐析实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质盐析的原理和过程。
2. 掌握蛋白质盐析实验的操作步骤。
3. 通过实验观察蛋白质盐析现象，验证盐析对蛋白质溶解度的影响。
二、实验原理蛋白质盐析是指在高浓度的中性盐溶液中，由于盐离子与蛋白质争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低，从而从溶液中沉淀出来的现象。
实验中常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠等。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、硫酸铵、蒸馏水、试管、试管架、磁力搅拌器等。
2. 试剂：硫酸铵饱和溶液、蒸馏水。
四、实验步骤1. 取一个干净的试管，加入2ml鸡蛋清溶液。
2. 向试管中加入2ml蒸馏水，充分混合。
3. 向试管中加入1ml硫酸铵饱和溶液，用磁力搅拌器搅拌，观察蛋白质沉淀现象。
4. 继续加入硫酸铵饱和溶液，观察蛋白质沉淀量的变化。
5. 记录实验现象，包括沉淀的形态、颜色、溶解度等。
五、实验结果与分析1. 实验现象：随着硫酸铵饱和溶液的加入，蛋白质逐渐沉淀，形成白色絮状沉淀。
继续加入硫酸铵饱和溶液，沉淀量逐渐增多，但沉淀的形态和颜色没有明显变化。
2. 分析：蛋白质盐析现象的发生是由于硫酸铵饱和溶液中的盐离子与蛋白质争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低。
实验结果验证了盐析对蛋白质溶解度的影响。
六、实验结论1. 盐析是蛋白质分离纯化的一种常用方法，通过调节盐浓度，可以使蛋白质从溶液中沉淀出来。
2. 盐析过程中，盐离子与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低。
3. 实验结果验证了盐析对蛋白质溶解度的影响，为蛋白质分离纯化提供了理论依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制硫酸铵饱和溶液的加入量，以免影响实验结果。
2. 实验操作要规范，避免污染。
3. 实验过程中要注意观察现象，及时记录实验数据。
八、实验拓展1. 探究不同盐离子对蛋白质盐析的影响。
2. 研究蛋白质盐析过程中，盐浓度与蛋白质沉淀量的关系。
3. 利用蛋白质盐析技术进行蛋白质分离纯化实验。
蛋白质脱盐方法
蛋白质脱盐方法蛋白质是生物体中重要的分子，对于研究其结构和功能具有重要意义。
然而，在进行蛋白质研究时，常常需要将蛋白质从混合物中分离出来，并去除其中的盐类。
这就需要采用蛋白质脱盐方法。
蛋白质脱盐是指通过一系列的操作步骤将蛋白质样品中的盐类去除，以便于后续的实验操作。
下面将介绍几种常用的蛋白质脱盐方法。
一、盐析法盐析法是一种常用的蛋白质脱盐方法。
它利用蛋白质在高盐浓度下溶解度降低的特点，通过控制溶液中的盐浓度，使蛋白质从溶液中沉淀出来。
盐析法操作简单，适用于大多数蛋白质。
盐析法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液加入适量的高盐缓冲液中，使蛋白质溶解。
2. 缓慢加入低盐缓冲液，使盐浓度逐渐降低。
3. 盐浓度降低到一定程度后，蛋白质会出现沉淀，可以通过离心将沉淀物和上清液分离。
4. 将沉淀物溶解在适量的低盐缓冲液中，即可得到脱盐后的蛋白质溶液。
二、透析法透析法是一种利用半透膜将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。
透析法操作简单，适用于大分子量的蛋白质。
透析法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液装入透析袋中，封闭袋口。
2. 将封闭的透析袋放入含有低盐缓冲液的容器中。
3. 通过半透膜的作用，蛋白质会逐渐从高盐浓度的溶液中透析到低盐浓度的溶液中。
4. 定期更换低盐缓冲液，直到蛋白质完全脱盐。
三、离子交换层析法离子交换层析法是一种利用离子交换树脂将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。
离子交换层析法操作相对复杂，但可以实现高效的蛋白质脱盐。
离子交换层析法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液加载到预先平衡的离子交换树脂柱上。
2. 通过适当的缓冲液进行洗脱，将蛋白质与盐类分离。
3. 收集洗脱液中的蛋白质溶液，即可得到脱盐后的蛋白质。
四、超滤法超滤法是一种利用超滤膜将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。
超滤法操作相对简单，适用于小分子量的蛋白质。
超滤法的步骤如下：1. 将蛋白质溶液加入超滤装置中。
2. 施加适当的压力，使溶液通过超滤膜。
3. 盐类和其他小分子量物质会通过超滤膜排除，蛋白质则被滞留在超滤膜上。
【初中化学】蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤
【初中化学】蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤一、注意事项：1.盐析的成败决定于溶液的ph值与离子强度，溶液ph值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。
2.通常用于盐析的硫酸铵容易吸收水分。
因此，在使用前，通常将其研磨、铺好瓷砖，放入烤箱中，在60℃下干燥，然后称重，这样更准确。
3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。
4.盐析后，最好搅拌40分钟至一小时，并将其放在冰浴中一段时间。
3.5为了避免盐对酶的影响，通常在脱盐后测量酶活性。
5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者g-25，g-50处理。
6.一般来说，当硫酸铵浓度为70%左右时，粗提物中的蛋白质完全沉淀。
二、实验步骤：蛋白质盐析常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、，从下表中可以看出，使用最广泛的硫酸铵的优点是温度系数低，溶解度高（20度时饱和溶液为754 g/L；0度时饱和溶液为706 g/L）。
在这个溶解度范围内，许多蛋白质和酶可以盐析出来；此外，硫酸铵的分段盐析效果也优于其他盐类，不易引起蛋白质变性。
硫酸铵溶液的pH值通常在4.5-5.5之间。
当与其他pH值盐析时，需要用硫酸或氨进行调整。
表1几种盐在不同温度下的溶解度(克/100毫升水)0℃20℃80℃100℃（nh4）2so470.6七十五点四95.3一百零三na2so4四点九18.9四十三点三42.2nah2po41.6七点八93.8一百零一饱和硫酸铵法：1.取XML血清，加入XML生理盐水，搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，最终硫酸铵饱和度为50%。
2.4℃，3h以上，使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
蛋白质的盐析实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质盐析的原理和方法。
2. 掌握蛋白质盐析实验的基本操作步骤。
3. 分析蛋白质盐析过程中可能出现的现象及其原因。
二、实验原理蛋白质盐析是指在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程。
这是因为中性盐中的离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低，从而发生沉淀。
蛋白质盐析是一个可逆过程，当降低盐浓度或去除盐离子时，蛋白质可以重新溶解。
盐析过程中，蛋白质的沉淀和溶解受多种因素影响，如盐的种类、浓度、pH值、温度等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋清、硫酸铵、蒸馏水、pH试纸、移液器、试管、烧杯、搅拌器等。
2. 实验仪器：电子天平、恒温水浴锅、显微镜等。
四、实验步骤1. 准备蛋清溶液：取新鲜鸡蛋，轻轻敲破蛋壳，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1份，九份0.9%NaCl溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。
2. 配制硫酸铵溶液：称取适量硫酸铵，溶于适量蒸馏水中，配制成所需浓度的硫酸铵溶液。
3. 盐析实验：将蛋清溶液分为若干份，分别加入不同浓度的硫酸铵溶液，充分搅拌，观察蛋白质沉淀情况。
4. 沉淀与溶解实验：将沉淀的蛋白质用蒸馏水洗涤，观察蛋白质是否能够重新溶解。
5. 分析实验现象：记录蛋白质沉淀和溶解的情况，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 实验现象（1）随着硫酸铵浓度的增加，蛋清溶液中蛋白质沉淀逐渐增多。
（2）当硫酸铵浓度达到一定值时，蛋白质沉淀量达到最大。
（3）继续增加硫酸铵浓度，蛋白质沉淀量不再增加。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀后的蛋白质，部分蛋白质重新溶解。
2. 实验分析（1）蛋白质盐析过程中，随着硫酸铵浓度的增加，蛋白质溶解度降低，导致蛋白质沉淀。
（2）当硫酸铵浓度达到一定值时，蛋白质沉淀量达到最大，说明此时蛋白质溶解度最低。
（3）继续增加硫酸铵浓度，蛋白质沉淀量不再增加，说明蛋白质已经达到饱和状态。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀后的蛋白质，部分蛋白质重新溶解，说明盐析是一个可逆过程。
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实验十一蛋白质脱盐
(透析和凝胶过滤)
在蛋白质的研究中，经常要进行蛋白质脱盐，即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。
蛋白质脱盐的方法很多，各有优缺点。
以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法，可根据实验条件和要求选用。
（一）蛋白质透析
一.目的
学习透析的基本原理和操作。
二.原理
蛋白质是大分子物质，不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。
在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。
三.仪器、试剂、材料
1.仪器
烧杯；玻棒；离心机；离心管；冰箱；电炉。
2.试剂
1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；1mol/L EDTA；2%NaHCO3。
3.材料
透析管（宽约2.5cm，长12－15cm）或玻璃纸;皮筋；鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。
四.操作方法
1.透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/L EDTA溶液中，煮
沸10分钟，再在2％NaHCO3溶液中煮沸10分钟，然后再在蒸馏水中煮沸10分
钟即可。
2.取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。
然后在4℃下静
置20分钟，出现絮状沉淀。
3.离心：将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。
4.装透析管：离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中，
扎紧上口。
5.将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。
6.每隔适当时间（5－10分钟），用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。
五.结果处理
记录并解释实验现象。
六.注意事项
1. 硫酸铵盐一定要充分溶解，才能使蛋白质沉淀下来。
七.思考题
在透析袋处理过程中，EDTA和NaHCO3起何作用？
（二）凝胶过滤
一.目的
学习凝胶过滤的基本操作技术，了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。
二.原理
凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。
目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）等。
这些多聚高分子材料,通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联，形成具有一定孔径的网络结构。
当用这类材料制成粒状凝胶颗粒后，颗粒内部就形成一种三维网状结构。
这些凝胶材料是高度亲水的，在水溶液里吸水显著膨胀。
实际工作中常用每克干胶吸水量（ml）的10倍（G值）表示凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。
当在柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透的小分子可以进入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。
二者在洗脱过程中走过的路程差别较大，大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。
而渗入胶粒内部的小分子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。
通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。
凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因而溶质回收率接近100％，而且设备简单、分离效果好、重现性好，凝胶柱可反复使用，所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化、分子量测定、浓缩、脱盐等用途。
本实验利用凝胶过滤的特点，将(NH4)2SO4盐同蛋白质分子分离开。
三.仪器、试剂、材料
1.仪器
层析柱（ф2cm×15cm）;真空泵；真空干燥器；恒流泵；核酸蛋白检测仪；部分收集器；记录仪。
2.试剂
1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；Sephadex G-25。
3.材料
鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。
四.操作方法
1.凝胶溶胀：取5 g Sephadex G-25, 加200ml蒸馏水充分溶胀（在室温下约需6小时
或在沸水浴中溶胀5小时）。
待溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，在加入与凝胶等体积的蒸馏水，在真空干燥器中减压除气，准备装柱。
2.装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，加入1/4柱长的蒸馏水。
把处理
好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中，同时开启螺旋夹控制一定流量。
最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅
动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。
最后放入略小于层析柱内径的滤纸片保护凝胶床面。
3.平衡：继续用蒸馏水洗脱，调整流量使胶床表面保持2cm液层，平衡20分钟。
4.样品制备：取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。
然
后在4℃下静置20分钟，出现絮状沉淀。
将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟，离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，即为样品。
5.上样：当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取1ml样品，小心地注入层析柱胶床面
中央，慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm液层时，用乳头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小心加入3－5cm高的洗脱液。
6.洗脱：继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步。
用核酸蛋白检测仪检测，
同时用部分收集器收集洗脱液。
合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后的蛋白质溶液。
7.用氯化钡溶液检测蛋白质溶液，评价脱盐效果。
五.结果处理
记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。
六.注意事项
1.整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，
应当重新装柱。
2.加样时应小心注入床面中央，注意切勿冲动胶床。
七.思考题
影响凝胶过滤脱盐效果的因素有那些？。