单细胞凝胶电泳试验

（一）原理

单细胞凝胶电泳试验（，）是近年来经过不断完善逐步发展起来地一种快速检测单细胞水平损伤地新技术.文档来自于网络搜索

有核细胞地分子量很大，超螺旋结构附着在核基质中，分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液地作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内地、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核仍保持缠绕地环区附着在剩余地核骨架上，并留在原位.如果细胞未受损伤，电泳时，核因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形地荧光团，无拖尾现象.若细胞受损，在中性电泳液（）中，核仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响双螺旋大分子地连续性.只有当双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星.如果在碱性电泳液（>）中，先是双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂地碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核向阳性迁移，形成拖尾.细胞受损愈重，产生地断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移地量也就越多，迁移地距离越长，表现为尾长地增加和尾部荧光强度地增强.因此，通过测定迁移部分地光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞地损伤程度.文档来自于网络搜索

（二）仪器

．全磨砂载玻片

．号盖玻片

．微量吸管和吸头

．冰盒

．电泳仪

．荧光显微镜

（三）试剂

．正常熔点及低熔点琼脂糖.

．细胞裂解液：，，，％肌氨酸钠，用调值到.用前加％和％.文档来自于网络搜索．碱性电泳液：，调到.

．缓冲液（）.

．荧光染料：µ地溴乙锭，也可用µ地吖啶橙或µ地碘丙锭等.

（四）方法

.制备细胞悬液

单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物地组织或培养地细胞系，或从活体组织分离出地原代细胞等.动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性地原代细胞进行测试.选择合适地培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>，细胞密度为(～)×备用.文档来自于网络搜索

. 凝胶制片

为了加强凝胶对玻片地附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加℃水浴后地％～％正常熔点琼脂糖µ.然后再铺胶层.第层：取密度为×地细胞悬液，以体积比为：地比例与预热到℃地％低熔点琼脂糖混匀，取µ加到第层胶上，铺匀凝固；第层：以％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”. 文档来自于网络搜索

.细胞裂解

将细胞“三明治”载玻片浸入新配制地预冷℃地裂解液中，保持℃ .

解旋

细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制地碱性电泳液盖过胶面约～，加盖避光，置于℃～.使充分解旋.碱性条件下（>）可使展开、解旋为单链，碱性易变性区段() 变为单

链断片( ) .文档来自于网络搜索

.电泳

解旋结束后，通电电泳.电泳条件为和，电泳～.或按～确定电压.最适条件实验者可自行选择.最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够地敏感性并减少实验室间差异.文档来自于网络搜索

.中和与染色

电泳后取出载玻片，在缓冲液（）中浸没或漂洗次，每次.每张胶板上滴加～µ荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤.以上各步骤应在黄或红光下操作.中和后地凝胶片应在内染色，以免过多扩散.否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水左右，或在室温中晾干.对于干燥地凝胶片，使用中性缓冲地甲醛处理数分钟，将有利于长期保存.文档来自于网络搜索

.结果观察

结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式.在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大～倍)，每片记数～个细胞，每个剂量组检查个细胞.无损伤地细胞表现为一圆形荧光细胞核.受损地细胞所产生地断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”地慧星现象.文档来自于网络搜索

镜下观察时，首先应记录出现拖尾地细胞数，计算拖尾细胞率.同时用目镜测量拖尾细胞地尾长，统计各试验（剂量）组地平均尾长.尾长是指断片从其主核向电泳正极迁移地距离，而不同地实验室尾长测定方法有所不同.但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较.文档来自于网络搜索

图象分析需有相应地设备和专门地分析软件.使用电脑逐个对细胞进行图像分析.应用图像分析系统可得到更多地分析参数.目前主要观察指标有尾长（）、慧尾地百分含量、尾距（）、尾块( )和尾惯量（）等.尾长( )即迁移地长度，在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块( )即彗星尾部分散地大小不一地断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块地面积、平均荧光强度、在轴上与彗核中心距离有关地综合性指标.目前通常选用迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标.文档来自于网络搜索

目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国公司地、美国公司地()、德国公司地分析系统、捷克公司地彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部地百分比、碎片等.但这些软件均需与其相应地仪器设备配套使用，价格十分昂贵.国内也正在开发一些分析系统.文档来自于网络搜索

除了昂贵地商业软件外，也有一些免费地彗星分析软件.如等所设计地分析软件( ) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部含量、尾矩等多项参数. 等在地基础上研制了另一软件()，该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量地彗星参数中增加了尾矩，而且用户界面更友好.这个免费软件地一个特点是，它们地源代码是公开地，人们可以看到每一个彗星参数地运算方法和编写程序.因此，软件使用者可以根据实验目地地不同来改变这些参数地运算方法和计算程序，从而建立一个新地测量遗传损伤地参数.这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算试验菌落数以及电泳凝胶地分析等.年建立了免费下载系统，其网址为：和.近年来使用较多地国外免费分析软件见以下网址：；文档来自于网络搜索

.随着彗星试验地发展，在资源共享地网络空间里，会有更完善更方便地彗星分析软件出现.文档来自于网络搜索

（五）注意事项

虽然具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因