荧光偏振度
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
荧光偏振分析方法
1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
5. 小分子分析
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
汞离子检测荧光偏振探针检测限达到0.2 ppb， 比传统荧光偏振方法提高3个数量级，检测时间 只需20分钟，具有良好的特异性
MAP探针
Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8386-8389.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
AuNP Enhancement
AuNP-DNA System 0.2 ppb
K+的作用
一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动
Analyst, 2012, 137, 2770-2773.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
特殊结构核酸增强荧光偏振
➢ 离子和小分子检测
Chem. Commun. 2014,50, 2049-2051.
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。
随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。
基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。
溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。
虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。
荧光偏振光强度P定义为：P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。
对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G 为校正因子，G=Ihv/Ihh。
荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。
由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。
荧光偏振就大
1867年：Goppelsroder
AL 与桑色素的配合测定AL 的含量
1880：Liebeman
提出“荧光与化学结构关系”的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕
二 荧光与荧光光谱
（一） 荧光的产生 （二）荧光光谱与吸收光谱
（一） 荧光的产生
1 分子的能量态
在光学分析中涉及的分子能量有： Eo=Ee+ Ev + Er
荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间
I=I0e-kt , =1/k 分子所处的环境 有无淬灭 有无能量转移 有无分子间相互作用
影响因素
5 荧光探剂
(1)具有环状共轭双键即π电子系统
(2)量子产率随环境变化，而且变化很大 (3) 能产生稳定荧光的小分子 藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein (4) 与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价 结合
2、矿物的发光机理
矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态 （非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。
一 荧光的发现
1575：N.Monardes
Lignum Nephriticum
1852：Stokes
分光计
植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁
借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光 Fluorescence
Ee：价电子运动能, electron
Ev：原子在平衡位置附近的振动,vibration
Er：分子绕其重心的转动能, rotation 其中，Ee > Ev > Er
（一） 荧光的产生
2 分子的能级Energy Levels与跃迁Transition
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
荧光偏振值为负
荧光偏振值为负
荧光偏振值为负，是指在荧光分析中，样品的偏振值小于参考物质的偏振值。
荧光偏振值是指样品在激发光线垂直于样品平面时，荧光辐射在平行和垂直于激发光线方向上的强度之比。
荧光偏振值的大小与样品分子内部结构、分子间作用力等因素有关。
荧光偏振值为负可能由以下原因引起：
1. 样品中存在旋转对称性
当样品分子具有旋转对称性时，其荧光偏振值可能为负。
这是因为，在旋转对称性下，分子的极化率张量具有一定的对称性，导致在不同方向上的极化率不同。
这种情况下，荧光偏振值会受到旋转对称性影响而呈现出负值。
2. 样品中存在多重共振能量转移
多重共振能量转移是指在分子内部存在多个荧光基团，并且它们之间存在能量传递过程。
这种情况下，由于能量传递过程会改变不同基团之间的相对方向，导致荧光偏振值呈现出负值。
3. 样品中存在自旋交叉
自旋交叉是指分子内部存在多个能级，并且它们之间存在自旋耦合。
这种情况下，由于能级之间的自旋耦合会影响荧光偏振度的大小和方向，导致荧光偏振值呈现出负值。
4. 样品中存在分子内部的相互作用
在分子内部存在相互作用时，荧光偏振度也可能呈现出负值。
这是因为分子内部的相互作用会改变不同基团之间的相对方向和位置关系，从而影响荧光偏振度的大小和方向。
总之，荧光偏振值为负可能由多种因素引起。
在实际应用中，需要结合样品的具体情况进行综合分析和判断。
同时，在进行荧光分析时，还需要注意样品处理、测量条件等因素对荧光偏振度的影响。
荧光偏振技术原理PPT
回目录
荧光偏振技术原理与仪器及其应用
1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
回目录
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
回目录
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米二氧化硅颗粒增强荧光偏振探针
Chem. Commun. 2012, 48, 7480-7482.
回目录
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
核酸酶检测及药物筛选
Chem. Commun. 2011, 47, 4763-4765.
回目录
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
T4 polynucleotide kinase activity B, 2013, 1, 2018-2021.
回目录
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
聚乙烯纳米颗粒增强荧光偏振信号放大分析方法
Chem. Asian J. 2014, 9, 2755-2760.
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
回目录
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振分析的一般步骤
• 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振度
荧光偏振度1. 什么是荧光偏振度？荧光偏振度是描述荧光分子在激发态和基态之间发生跃迁时所产生的偏振光的性质的一个参数。
它可以用来衡量荧光分子在不同方向上发射的光的强度差异，从而反映分子在激发态和基态之间跃迁的选择性。
2. 荧光偏振度的测量方法2.1 偏振荧光显微镜偏振荧光显微镜是一种常用的测量荧光偏振度的方法。
通过使用偏振片和分析片，可以选择性地过滤掉特定方向上的偏振光，从而实现对样品中发射出的荧光信号进行测量。
2.2 荧光极化法荧光极化法是另一种常用的测量荧光偏振度的方法。
它利用样品中荧光分子在激发态和基态之间跃迁时所产生的偏振性质。
通过测量样品中垂直和水平方向上的荧光信号强度，可以计算出荧光偏振度。
2.3 其他方法除了偏振荧光显微镜和荧光极化法，还有一些其他的方法可以用来测量荧光偏振度，如荧光共振能量转移、荧光寿命测量等。
这些方法在不同的实验条件下具有不同的优势和适用性。
3. 荧光偏振度的应用3.1 生物医学研究荧光偏振度在生物医学研究中有着广泛的应用。
它可以用来研究蛋白质的结构和功能，通过测量蛋白质中色氨酸和酪氨酸的荧光偏振度，可以获取它们在分子水平上的信息。
3.2 材料科学在材料科学领域，荧光偏振度也被广泛应用于材料表征和分析。
在液晶材料研究中，通过测量液晶分子中发射出的荧光信号的偏振性质，可以了解到液晶分子排列的方向和有序程度。
3.3 光电子学荧光偏振度在光电子学领域也有重要的应用。
在液晶显示技术中，荧光偏振度可以用来控制液晶分子的排列方向，从而实现液晶显示器的图像显示。
4. 荧光偏振度的影响因素荧光偏振度受到多种因素的影响，包括荧光分子的结构、环境条件以及测量方法等。
这些因素对荧光偏振度的影响需要进行详细的研究和分析。
5. 结论荧光偏振度是描述荧光分子在激发态和基态之间发生跃迁时所产生的偏振光性质的一个重要参数。
通过不同的测量方法和应用领域，我们可以深入了解荧光偏振度在生物医学研究、材料科学和光电子学等领域中的应用价值。
荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析具有高灵敏度、高特异性和低检测限等优点，能够实现快速、准确地定量检测目标 物质。此外，该技术还具有操作简便、样本用量少等优点，使得其在生物医学领域中具有广泛的应用 前景。
02
荧光偏振免疫分析技术
荧光物质与标记技术
荧光物质
荧光物质是一种能够在特定波长光激发下发出荧光的物质，常用于荧光偏振免疫 分析中的标记物。常见的荧光物质包括荧光素、量子点、荧光染料等。
数据处理
数据处理是对检测到的信号进行解析、计算和分析的过程。通过建立数学模型和算法，将荧光信号转化为待测物 质的浓度或活性。数据处理还包括对实验数据的统计、分析和可视化，以提供准确的实验结果和可靠的结论。
荧光偏振免疫分析的优缺点
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、可 定量检测等。
缺点
对实验条件要求较高、仪器设备昂贵 、需要专业操作人员等。
通过病毒与细菌检测，有助于疾病的早期诊断、治疗监测和预防控制，对于公共卫生和疫情防控具有 重要意义。
其他医学应用
荧光偏振免疫分析在医学诊断中还有 许多其他应用，如药物浓度监测、自 身免疫性疾病的抗体检测、生物毒素 和毒素抗体的检测等。
通过这些应用，可为临床医生提供更 全面的诊断信息，有助于疾病的精准 治疗和患者管理。
100%
数据记录
记录荧光信号的变化，生成数据 曲线或表格。
80%
结果分析
根据数据曲线或表格，计算抗原 的浓度或活性，进行结果解读和 报告。
04
荧光偏振免疫分析在医学诊断中的应用
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌或脱落到体液中的物质，可用于肿瘤 的早期发现、诊断、治疗监测和预后评估。荧光偏振免疫分析可 以检测体液中微量肿瘤标志物，为肿瘤的早期发现和治疗提供有 力支持。
荧光偏振免疫分析PPT
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓 度比变化关系曲线
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲 且有弹性此构型对应着一定的偏振度值. 在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光 偏振度在0.11左右;
• 2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非 特异性结合),背景荧光和光散射的影响。
• 3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围 (窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。
• 4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需
对本实验室研究的思考
• 当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋 白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标 签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数, 动力学白分子可能呈现更紧密、更小 的构型, 导致复合体分子
荧光偏振研究的一般步骤
• 1.确定最佳的荧光标记物;
• 2.确定公式中的各种参数;
• 3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定 最优稀释比，使其结合能力与FP值成线性 关系;
• 4.建立标准曲线;
• 而待测样本中竞 争抗原的浓度增 加时,荧光标记抗
• FPIA是均相的 竞争免疫分析方 法,反应完全在 溶液系统中,不 需要分离结合的 和未结合的抗体。
• 实验操作过程非 常简单,仅仅是 将抗体,荧光标
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 1. 制备DNA-组蛋白复合体:
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之比为10:1;
荧光偏振免疫分析的优点
• 1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂 的用量。
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荧光偏振度
1. 引言
荧光偏振度是描述荧光分子在吸收光后发出的荧光光子的偏振状态的一个参数。
荧光偏振度可以用来研究分子的结构、动力学和相互作用等信息。
本文将详细探讨荧光偏振度的定义、测量方法以及在不同领域的应用。
2. 荧光偏振度的定义
荧光偏振度是指荧光光子的偏振状态相对于吸收光的偏振状态的度量。
偏振度的取值范围为-1到1，其中-1表示完全垂直偏振，1表示完全平行偏振，0表示无偏振。
3. 荧光偏振度的测量方法
3.1 偏振荧光光谱法
偏振荧光光谱法是最常用的测量荧光偏振度的方法之一。
该方法通过测量荧光光谱在不同偏振方向上的强度来计算荧光偏振度。
实验中通常使用偏振器和分光仪来控制和测量光的偏振状态。
3.2 偏振显微镜法
偏振显微镜法是另一种常用的测量荧光偏振度的方法。
该方法利用偏振显微镜观察荧光样品在不同偏振方向下的荧光强度和偏振状态。
通过分析荧光图像的偏振特性，可以计算得到荧光偏振度。
3.3 其他测量方法
除了偏振荧光光谱法和偏振显微镜法，还有一些其他的测量荧光偏振度的方法，例如荧光偏振光谱法、荧光偏振瞬态法等。
这些方法在不同的实验条件下可以提供更多的信息和更高的测量精度。
4. 荧光偏振度的应用
4.1 分子结构研究
荧光偏振度可以用来研究分子的结构信息。
不同的分子结构对荧光偏振度有着不同的影响，通过测量荧光偏振度可以推断分子的构型和取向。
这对于有机分子、生物分子等的研究具有重要意义。
4.2 动力学研究
荧光偏振度还可以用来研究分子的动力学过程。
荧光偏振度随着时间的变化可以反映分子的运动和转动。
通过分析荧光偏振度的变化，可以研究分子的旋转、振动和扭曲等动力学过程。
4.3 分子相互作用研究
荧光偏振度对分子之间的相互作用也具有很高的敏感性。
当分子与其他分子或溶剂发生相互作用时，荧光偏振度会发生变化。
这可以用来研究分子间的相互作用力、分子间的距离和分子结构的变化等。
4.4 其他应用领域
除了分子结构、动力学和相互作用的研究，荧光偏振度在其他领域也有广泛的应用。
例如材料科学中的荧光材料研究、生物医学中的荧光探针设计和荧光成像等。
5. 总结
荧光偏振度是一种重要的荧光参数，可以提供有关分子结构、动力学和相互作用等信息。
通过不同的测量方法，可以准确地获得荧光偏振度的数值。
荧光偏振度在分子科学、材料科学和生物医学等领域都有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，荧光偏振度的测量方法和应用将会更加多样化和精确化。