10%分离胶的电泳和转膜条件
WB原理、步骤与总结
WB原理、步骤与总结实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h 或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
电泳、转膜
电泳、转膜转膜是把DNA 从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定，是进行各种后续研究（如 RFLP 分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究）的前提。
实验目的：掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤实验原理：1．转膜的方式：向上的毛细管转移向下的毛细管转移同时向两张膜转移电转移真空转移2．固相支持物的种类及选择：硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA ， < 500 bp 的DNA无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等）。
尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的DNA 结合容量，它能够吸附变性DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。
尼龙膜两边均有吸附DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把DNA 从凝胶上转到膜上。
DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定DNA 。
3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择：带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合DNA 是最大优点。
硝酸纤维膜：高盐离子强度促进DNA 与膜结合（20 × SSC ），低盐离子强度导致小片段DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ，DNA 不能与膜结合。
4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs。
取决于毛细管系统，DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。
DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小DNA ，碱转移 2hrs大部分结合到膜。
DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。
WB实验操作流程
Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的特定蛋白进行显影。
通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
实验流程主要包括以下几个步骤：样品制备；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。
实验器材操作步骤样品制备准备进行western blot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。
样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。
根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。
（1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）6、于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取：1. 将100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心3 min，弃上清。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
WB操作-郭子龙讲解
鉴于实验技术方法的改进以及试剂商品化程度的提高，本操作指南中的部分内容目前仅作参考学习，在实际实验过程中可能不会用到。
一、实验原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。
二、蛋白样品制备（根据样品及检测要求选适当提取方法，蛋白样品制备是WB 的第一步，更是决定WB成败的关键步骤。
）1.样品与试剂组织(Storage: -80℃)；RIPA裂解液(强) (谷歌生物；beyotime:P0013B Storage: -20℃，一年有效。
大瓶装买回来后及时用10ml EP管分装，尽量避免过多的反复冻融。
在分装的Ep管上标明分装当日日期，每使用一支要在EP管上做个标记，用完一支再启封新的。
如果不嫌麻烦，初次分装RIPA裂解液时分装于10ml Ep管中，用于组织裂解；用于上样蛋白配制的分装一部分于1.5ml Ep管中。
PMSF (谷歌生物；Solarbio: Cat.No.P0100 Lot.No.20150716 Storage: -20℃。
100mM)10×SDS样品缓冲液量取下列试剂，置于10ml塑料离心管中1M Tris-Hcl，PH6.8 2.5mlSDS 0.5gBPB 50mg甘油5ml加去离子水溶解后定容至10ml。
小份（500μl/份）分装后，于室温保存。
使用前将50μl的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
2.仪器与耗材组织蛋白：玻璃匀浆器；手术剪；冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。
细胞蛋白：冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。
WB实验
步骤：样品制备1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞3次，去尽残留液体，可以将培养瓶倒置，下面放吸水纸或者干棉花。
3．加入1% SDS裂解液(我们用的是200ulRIPA,，注意整个装RIPA 的EP管先前需要加入10ul的PMSF.)(6-well plate(6孔板), 100 μl /w；75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，冰上静置5min后，用枪头折弯或者细胞刮刮落细胞，转移到Ep管。
注意：蛋白提取必须冰上操作，以免蛋白降解，先把细胞培养瓶放冰上预冷（裂解目的是使细胞膜破裂，蛋白可以释放）。
(此时可以-20℃保存，4-6步可以做WB当天再做)4．超声功率10%，10~15秒间歇20秒，剪切DNA以减低样品粘性，到蛋白尽量澄清。
5．离心12000g, 5 min，取上清。
6．煮沸样品5 min。
制胶槽前一天，清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
1）玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧，即旋转到1.0（一定要对齐，以免漏胶，最好双人操作，一人用力往下压，卡紧后一定要用梳子先试一下，看是否能插入，调节一下。
否则配浓缩胶后插梳子很无奈）。
然后垂直卡在夹子上准备配胶。
2）配胶：先配分离胶，再配浓缩胶。
（物品大部分在新冰箱4度，用完最好尽快拧紧放回）插太深，防止枪头壁上粘太多，TEMED加后凝固很快，并且凝固时间和温度关系很大，换句话说，冬天TEMED加的要多些。
3）按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，用枪多次吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到制胶架？？？？高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。
然后胶上加一层无水酒精，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。
WB试验常见问题解答
WB试验常见问题解答[1]各位朋友：请教关于SDS-PAGE的问题。
我的配胶体系如下：15%分离胶4%浓缩胶水 2.3ml 2.7ml30%丙烯酰胺5.0ml 0.67mlTris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml10%SDS 0.1ml 0.04ml10%APS 0.1ml 0.04mlTEMED 0.004ml 0.004ml我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min。
跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。
谢谢答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶(毫升) ：5 －－10 －－15－－20－－30－－50蒸馏水：0.5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－ 3.0 －－5.030%Acr-Bis(29:1)：2.5 －－5.0 －－7.5 －－10.0 －－15.0－－25.01M Tris, pH8.8：1.9－－3.8 －－5.7－－7.6－－11.4 －－19.0 10%SDS ：0.05－－0.1－－0.15 －－0.2－－0.3－－0.510%过硫酸铵：0.05 －－0.1 －－0.15－－0.2 －－0.3 －－0.5 TEMED：0.002－－0.004 －－0.006 －－0.008 －－0.012 －－0.02配制不同体积4%胶SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 4％浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水： 3.16ml40％Acr/Bic（37.5：1）：0.5ml0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8）：1.26ml10％SDS ：50 微升μ微升μ10%AP（过硫酸胺）：25TEMED ：5 微升μ加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要。
如果玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。
WB实验操作流程
Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的特定蛋白进行显影。
通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
实验流程主要包括以下几个步骤：样品制备；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。
实验器材操作步骤样品制备准备进行western blot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。
样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。
根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。
（1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）6、于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取：1. 将100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心3 min，弃上清。
sdspage电泳的标准操作规程
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 M?.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.85×电极缓冲液 Tris 15.1 g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至 1 L，pH 8.32×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至 1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端 3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。
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10%分离胶的电泳和转膜条件
10%分离胶的电泳和转膜条件如下：
电泳条件：
1. 电源：采用恒压或恒流的电源，电压根据分离胶的厚度和电泳槽的体积而定，一般设置为60\~100V。
2. 温度：电泳过程应保持恒温，温度过高可能导致凝胶溶化，电泳速率降低；温度过低则可能导致电泳时间延长，对电泳效果产生影响。
3. 缓冲液：使用适当的电泳缓冲液，以保证电泳的稳定性和分离效果。
4. 凝胶浓度：10%分离胶的凝胶浓度为10%，适合分离相对分子量较大的蛋白质。
5. 电场强度：电场强度越高，电泳速率越快，但过高的电场强度可能导致凝胶溶化和电泳条带变形。
转膜条件：
1. 转膜方法：常用的转膜方法包括湿转法和半干转法。
湿转法操作简单，转移效率高，但需要使用昂贵的硝酸纤维素膜；半干转法适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少，但操作相对复杂。
2. 转膜缓冲液：通常使用含有甲醇、甘氨酸和Tris等成分的转膜缓冲液，根据具体实验条件调整配方。
3. 转移时间：根据蛋白大小和所需的转移效率而定，一般小分子蛋白的转移时间较短，大分子蛋白的转移时间较长。
4. 电流密度：电流密度越高，转移效率越高，但过高的电流密度可能导致蛋白烧伤和膜破裂。
5. 温度：保持恒温的转移温度，温度过高可能导致蛋白丢失和膜溶化；温度过低则可能导致转移效率降低。