抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测

抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测

来源：检验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6

一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验

(一)纸片琼脂扩散法

纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer试验，是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。

1．试验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。

2．培养基和抗菌药物纸片

(1)培养基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培养基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH值为7.2～7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。

(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。含药纸片密封储存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过l周。使用前将储存容器移至室温平衡l～2h，避免开启储存容器时产生冷凝水。

3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度。校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育24h。

4．结果判断和报告用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域)，当葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的敏感试验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。对另外一些菌，在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长，生长层小于20％可忽略不计。根据CLSI/NCCLS标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐药)。

(二)稀释法

如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量(浓度)的抗菌药物呈敏感时，就必须使用稀释法(dilution method)。稀释法包括两

种：肉汤稀释法和琼脂稀释法，分别介绍如下：

1．肉汤稀释法有常量稀释法(mac-rodilution)和微量稀释法(microdilution)，前者含药肉汤含量每管≥l.0ml(通常2m1)，后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素，操作方便，广泛应用于临床。

(1)培养基：使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正pH值为7.2～7.4(25℃)。离子校正的M-H肉汤(CAMHB)为目前推荐的药敏试验培养液。

(2)药物稀释①药物原液制备：抗菌药物直接购自于厂商或相关机构，所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。

质量(mg)=溶剂（ml）×浓度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）

容积(m1)= 质量(mg) ×分析效能（ug/mg）/浓度（ug/ml）

配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH值为6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。

一般原液浓度不低于1 000ug/ml或10倍于最高测试浓度，原液应储存于-60℃以下，保存期不超过6个月。②稀释抗菌药物的制备：行2倍系列稀释，使其终浓度(ug/m1)为51

2、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。

(3)菌种接种：配制0．5麦氏浓度菌液，用肉汤(常量稀释法)、蒸馏水或生理盐水(微量稀释法)稀释菌液，使最终菌液浓度(每管或每孔)为5×105 CFU／ml，稀释菌液于15min 内接种完毕，35℃孵育16～20h，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为20～24h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满24h以上。

(4)结果判断：以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC(ug/m1)。甲氧苄啶(甲氧苄胺嘧啶)或磺胺药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断，以细菌数为阳性对照的80％即可作为判断细菌生长指标。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否有细菌生长。

2．琼脂稀释法琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。

(1)培养基：M-H琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基，调整pH值在7.2～7.4(25℃)，过高或过低的pH值会影响药物效能。

(2)含药琼脂制备：将已稀释的抗菌药物按1：9(配制的药物溶液：琼脂培养基)加入，加热溶解琼脂，在45～50℃水浴平衡融化MH琼脂中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为3～4 mm。室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中，置2～8℃，储存日期为5d，对易降解药物如含

头孢克洛，在使用48h之内制备平板，使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中30min 以使琼脂表面干燥。

(3)细菌接种：将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍，以多头接种器吸取(为1～2ul)接种于琼脂表面，稀释的菌液于l5min内接种完毕，接种后置35℃孵育16～20h(MRS、VRE孵育时间需满24h)，奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5％C02、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

(4)结果判断：将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(含甲氧苄啶平板上可见少许散在细菌生长)。试验菌的结果报告可用MIC (ug/mg)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。

(三)E试验

E试验(Epsilometer test)是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的

技术。

1．试验原理 E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判断有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。

将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度(IC)，它与MIC呈高度相关。

2．细茵接种和加样使用厚度为4mmM-H琼脂平板，用0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。采用CLSl/NCCLS AST执行标准推荐孵育条件。

3．结果判断和报告读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。E试验IC值与CLSl/N CCLS的稀释法MIC参考值高度相关，二者直接相对应，CLSl/NCCLS MIC折点值适用于E试验。但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。

二、苛养菌的药物敏感试验

肺炎链球菌及其链球菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等苛养菌不能在普通环境及普通M H培养基中快速生长，上述的药敏试验条件不适合它们。它们需要更为复杂的培养基、孵育条件，在进行药敏试验时，质控菌株、药敏抗生素的选择、结果解释标准也有所不同。下面分别介绍几种重要苛养菌药敏试验的试验条件选择、质量控制方法和结果判断注意事项。各自的结果判断标准请参考CLSl/NCCLS手册。

(一)嗜血杆菌属

1．试验条件

(1)培养基：使用嗜血杆菌属试验培养基(hemophilus test medium，HTM)。

(2)接种菌液：菌悬液终浓度为5×105CFU/ml。

(3)孵育条件：35℃下孵育20～24h观察结果。对于扩散法，35℃、5％～7％C02下孵育l6～18h观察结果。

2．质量控制流感嗜血杆菌ATCC49247、流感嗜血杆菌ATCC49766、大肠埃希菌ATCC3 5218(用于β-内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂)为推荐参考菌株。

3．结果判断注意事项

(1)血液、脑脊液分离株仅需做氨苄西林、三代头孢菌素中的一种、氯霉素和美罗培南。

(2)耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌大多产TEM型β-内酰胺酶。大多数情况下，直接检测β-内酰胺酶更快。

(3)β-内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药(β-Lactmase-negative，ampicillin-resistant，BL-NAR)的流感嗜血杆菌株少见。然而，不论其体外药敏试验是否出现敏感，均应考虑为阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢盂多、头孢尼西、哌拉西林/他唑巴坦耐药。

(二)肺炎链球菌

1．试验条件

(1)培养基：肉汤稀释法使用离子校正的马冻融血培养基。

(2)接种菌液：菌悬液终浓度为l05CFU/ml。

(3)孵育条件：35℃下孵育20～24h。

2．质量控制肺炎链球菌ATCC49619、大肠埃希菌ATCC35218(用于β-内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂)为推荐参考菌株。

3．结果判断注意事项

(1)对青霉素敏感者，均可认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林／舒巴坦、头孢克洛等三代头孢菌素敏感；青霉素中介或耐药株，不推荐做上述药物的药敏试验，因为对青霉素耐药的肺炎链球菌对上述抗生素治疗的疗效很低。应当及时通知临床医生，然后应报告对头孢曲松、头孢噻肟和美罗培南的MIC。

(2)静脉注射高浓度青霉素(肾功能正常的成人2×106U/4h)或氨苄西林(29/6h)对青霉素中介的肺炎链球菌是有效的。标准剂量的头孢曲松、头孢噻肟对中介的肺炎链球菌也有临床疗效，但在发现该菌株引起的脑膜炎时常用最大剂量治疗。

(三)肺炎链球菌外链球菌属

1．试验条件

(1)培养基：肉汤稀释法同肺炎链球菌，琼脂稀释法用含5％羊血琼脂。

(2)接种菌液：菌悬液终浓度为5×105CFU/ml。

(3)孵育条件：35℃下孵育20～24h。琼脂稀释法需5％C0。。

2．质量控制肺炎链球菌ATCC49619为推荐质控菌株。

3．结果判断注意事项

(1)化脓性链球菌一般不需做青霉素药敏试验，该菌目前对青霉素仍为敏感株，只有某些无乳链球菌可能会对青霉素产生中介结果。

(2)对青霉素敏感的链球菌，同时被认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟等敏感，毋需对这些抗生素进行药敏试验。

(3)青霉素或氨苄西林中介的菌株，需用氨基糖苷类联合用药进行治疗。

(4)对红霉素耐药者或敏感者常提示对阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素耐药或敏感。

三、分枝杆菌的药物敏感试验

(一)结核及慢生长分枝杆菌的药物敏感试验

由于结核及慢生长分枝杆菌生长缓慢，在生长前，药物已扩散至培养基中，不能有效影响其生长。故不适用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验。结核及慢生长分枝杆菌药敏试验的药敏培养基、含药浓度、接种菌量、结果解释等都有其特殊性。

比例法是WH0/IUATLD全球结核病耐药监测方案中推荐的方法，目前国外普遍采用此法。国内多采用绝对浓度法，据报道，该法比比例法的耐药菌检出率要低5％～10％。某些微生物自动鉴定和药敏系统则采用放射核素等方法。

1．绝对浓度法(absolute concentration method)该法以“无生长”为终点或为最低抑菌浓度(MIC)来判断耐药与否，每种药物需制备两种不同浓度的含药培养基，同时用不含药培养基作为对照，接种菌液最终浓度为1ug/ml，37℃培养4周观察结果。判断标准为对照培养基上细菌生长良好，含药培养基上菌落>20个判为耐药。

(1)试验条件①培养基：改良罗氏培养基(Lowenstein-Jensen，L-J)。②试验药物：试验用药物和药物浓度(表6-2)。③接种菌液：多点刮取培养物少许，置于磨菌器中，用磨菌捧捻磨，使呈乳酪样，以0.5％Tween-80生理盐水稀释，与比浊管比浊，配制成lmg/ml菌悬液，然后以灭菌生理盐水稀释至l0-2mg/ml。试验时每点接种lOOul。④孵育条件：37℃下孵育4周。

(2)质量控制：①结核分枝杆菌H37RvATCC 27294为一线、二线药的敏感质控菌株；②结核分枝杆菌H37Rv ATCC35820为链霉素耐药质控菌株；③结核分枝杆菌H37Rv ATCC35822为异烟肼耐药质控菌株；④结核分枝杆菌K37Rv ATCC35826为环丝氨酸耐药质控菌株；⑤结核分枝杆菌H37Rv ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；⑥结核分枝杆菌H37Rv ATCC35828为吡嗪酰胺耐药质控菌株；⑦结核分枝杆菌H37Rv ATCC35830为乙硫异烟胺耐药质控菌株；

⑧结核分枝杆菌H37Rv ATCC35837为乙胺丁醇耐药质控菌株；⑨结核分枝杆菌H37Rv ATCC3 5838为利福平耐药质控菌株。

(3)结果判断注意事项：每周阅读平板1次。根据CLSI/NCCLS药敏测定时间，结核分枝杆菌为3周，慢生长分枝杆菌为2周，到4周末终止培养。结果报告方式分敏感、低浓度耐药、高浓度耐药和实报菌落数4种。判断标准如下：①敏感。含药培养基上无菌落生长。②低浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落数>20个，高浓度含药培养基上无或极少菌。③高浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落茂盛，高浓度含药培养基上菌落数>20个(+菌落数约占斜面面积l/4；++菌落数约占斜面面积l/2；+++菌落数约占斜面面积3/4；++++菌落呈菌苔样生长)。④实报菌落数。低浓度含药培养基上菌落数<20个时，实报菌落个数。

2．比例法(proportional method) 此法是在一种含药培养基上接种两种不同浓度的菌液，以含药培养基上的菌落数与不含药培养基上的菌落数之比作为药敏判定标准。

(1)试验条件：①培养基Milddle brook7H10琼脂。②试验药物。在表6-2中列出了CL SI/NCCLS推荐的抗结核分枝杆菌比例法药敏试验用药物和药物浓度。③接种菌液。调整细菌浓度为1麦氏浓度，再将其用7H9肉汤稀释成102和104倍两种浓度。分别吸取两种不同浓度的菌液l0ul(标准接种环一接种环)接种于同一个浓度的含药培养基及对照培养基。④孵育条件。37℃下孵育4周。

(2)质量控制：基本同绝对浓度法。

(3)结果判断注意事项：在两个浓度梯度的平板中，计数易数出菌落数的那一个，与对照平板菌落数相比，算出耐药百分比。

3．放射核素法BACTEC—TB 460等仪器检测系统使用放射核素法进行快速检测。具体使用见产品说明书。

(二)快速生长分枝杆菌的药物敏感试验

快速生长分枝杆菌在合适的固体培养基上孵育5～7d肉眼可见细菌菌落生长。其药物敏感试验常以肉汤稀释法进行，操作方法基本同需氧和兼性厌氧菌。菌种用胰大豆肉汤或CAM HB加上0.02％Tween-80，以避免细菌的聚集。30℃孵育3～5d后观察结果。

四、厌氧菌的药物敏感试验

由于厌氧菌对目前常用抗生素的敏感性较为稳定，加之厌氧菌培养要求特殊，临床实验室一般不做体外药敏试验。发生下述临床情况时应考虑体外药敏试验：①明确厌氧菌引起的严重感染；②已确诊的厌氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏效；③需长期用药的厌氧菌感染。

厌氧菌体外药敏试验基本原理和方法与需氧菌相同，只是培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。

1．培养基采用布氏血琼脂(Brucella blood agar)。配制完毕的布氏血琼脂储存期不能超过7d(4～l0℃)，最好不能长于72h。含亚胺培南和克拉维酸的培养基必须使用当天制作平板。布氏心脑浸液加入3％～5％冻融羊血为稀释法培养基。

2．孵育条件厌氧箱和厌氧罐是必需配置的，气体条件为80％N2、l0％H2和l0％C02，还需加入冷催化剂钯粒和亚甲蓝指示剂，35～37℃孵育48h。

3.质控菌株脆弱类杆菌ATCC25285、多型类杆菌ATCC 29741、迟缓优杆菌ATCC 43055。

五、抗菌药物敏感试验的质量控制

抗菌药物药敏试验必须做有效的质量控制，以保证检验结果的精确性、可靠性和可重复性。要完成有效的药物敏感性试验，除了必须采用可靠的试剂和检测系统外，实验室应建立一套完善的操作流程和评价程序，以规范试验中使用的各种试剂，规范操作者的操作和对结果的判断。

(一)质量控制参考菌株的质控试验

除了阳性生长对照试验、纯度对照试验、接种量对照试验、结果终点判读对照试验等外，临床微生物室常通过对已知的抗生素敏感的菌株进行测试，以达到综合质量控制目的。

CLSI/NCCLS 2004 AST执行标准推荐下述参考菌株为稀释法MIC的测定：金黄色葡萄球菌ATCC 29213，金黄色葡萄球菌ATCC 43300，肺炎链球菌ATCC 49619，粪肠球菌ATCC 29 212，粪肠球菌ATCC51299，淋病奈瑟菌ATCC 49226，大肠埃希菌ATCC 28922，大肠埃希菌ATCC 35218，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，铜绿假单胞菌ATCC 27853，流感嗜血杆菌ATCC 49247，流感嗜血杆菌ATCC 49766。

一般来说，这些菌株同样也适用于琼脂扩散法。金黄色葡萄球菌ATCC 25923只用于琼脂扩散试验。大肠埃希菌ATCC35218仅推荐用于含β-内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦或三唑巴坦的抗生素)药敏试验；金黄色葡萄球菌ATCC 43300和29213使用于苯唑西林盐琼脂筛选试验；粪肠球菌ATCC51299和29212使用于万古霉素筛选试验和高水平耐氨基糖苷类肠球菌药敏试验；肺炎克雷伯菌700603使用产ESBLS的试验。

质控菌株需用临床分离株相同的培养基和方法进行标准法的药敏试验。CLSI/NCCLS质控菌株的MIC预期值和抑菌圈直径参见CLSI/NCCLS手册。质控菌株稀释法药敏试验的MIC 应位于整个试验浓度范围的中部。

储存质控菌种应在菌种保存液(50％胎牛血清肉汤或10％～l5％胰大豆肉汤)中置于-2 0℃或-80℃或液氮中，也可冷冻真空保存。冻存的或冷冻真空的培养物至少在试验前需传代2次。工作中的质控菌株在胰大豆琼脂(一般菌)或巧克力琼脂(苛养菌)斜面上每周传代一次。在试验前传代的菌株应在琼脂平板上分离取得单个菌落。

质控试验应每日进行。MIC在预定值范围外时，需查找误差原因并予以纠正。产生误差的原因包括：①质控菌株选用不当；②细菌菌液浓度不对；③培养基储藏不当或过期失效；

④质控菌株或培养基被污染；⑤培养基平板的制作不符合要求；⑥孵育的温度和气体条件不符。

(二)药敏试验平板、肉汤的质量控制

常量稀释法的含药肉汤试管、微量稀释法的条板和稀释琼脂平板在使用前均应进行合适质控菌株的测试，观察其MIC是否在预期值范围，不在预期值范围内者应丢弃。当然，上述培养基应做无菌试验，至少每批抽样一支，孵育过夜，观察细菌有无生长，以确保培养基无菌。

MH琼脂可用铜绿假单胞菌ATCC227853作为质控菌株，用10ug含药的庆大霉素纸片做药敏试验，其抑菌环直接应在CLSI/NCCLS AST执行标准预定值范围内。

六、耐药性监测的分子遗传学

随着分子细菌遗传学和分子生物学技术的不断进步，微生物对抗生素耐药性的遗传学机制不断明了，许多用于检测抗生素耐药性的基因检测方法，如PCR、PCR-RFLP分析、PCR-S SCP分析、PCR-SSP、基因芯片分析、DNA序列测定等，得以发展并在临床实验室应用。

与常规方法相比，基因检测方法检测抗生素耐药基因有下述优点：有些细菌不能或不易培养，只能检测其基因型；能快速鉴定慢生长细菌的耐药性，能早期指导临床医生治疗用药；有助于判定MIC位于折点或折点附近的细菌药敏试验结果；在细菌耐药性的流行病学追踪调研中，基因检测比抗生素药敏方法准确。

当然，目前抗生素耐药性的基因检测方法尚处于发展早期。既没有完全弄清细菌耐药的遗传学机制，也没有建立起检验标准。基因检测药敏试验的主要不足在于：细菌对同一抗生素的耐药通常可由多种耐药机制引起，基因检测方法通常只能检测某一特定的耐药，而抗生素药敏试验则能用一种培养分析检测不同形式的耐药。

1．β-内酰胺药物耐药基因的检测

(1)耐苯唑西林金黄色葡萄球菌基因的检测：苯唑西林MIC值为2～8ug/ml被判为MRsA (耐苯唑西林金黄色葡萄球菌)的金黄色葡萄球菌可能具有mecA基因，也可能是因为产高水平β-内酰胺酶，以至缓慢水解苯唑西林。临床治疗MRSA引起的感染首选万古霉素，而治疗产高水平β-内酰胺酶菌株所致感染，则应使用对酶稳定的β-内酰胺类药物或β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂合剂。

(2)肺炎链球菌β-内酰胺耐药基因的检测：肺炎链球菌可获取其他肺炎链球菌或其他链球菌染色体DNA而修饰自身PBP(青霉素结合蛋白)导致耐药。PBP2b基因序列(该序列仅出现于青霉素敏感菌株)的PCR阴性则提示可能介导耐药。

(3)革兰阴性菌β-内酰胺基因的检测：编码革兰阴性菌中的TEM、SHV、OXA等β-内酰胺酶的基因的DNA探针和PCR引物已能合成，可用于基因检测方法检测。还可采用等电聚焦电泳和DNA测序作为鉴定新的β-内酰胺酶基因的筛选工具。

2．氨基糖苷类耐药基因的检测革兰阴性细菌具有多种不同类型的耐氨基糖苷类耐药基因，如转乙酰基酶、转腺苷酶和转磷酸基酶编码基因。目前为止，尚无一种DNA探针或P CR引物预测它们的耐药性。

革兰阳性细菌对氨基糖苷类的耐药性较单一，通对DNA和PCR方法可检测出氨基糖苷类高水平耐药基因，如检测肠球菌ant(6)链霉素耐药基因和编码庆大霉素耐药的aac(6’)-a ph(2’)基因。

3．大环内脂、林可霉素、米卡霉素(密柑霉素)耐药基因的检测 mefA和mefE为大内脂类抗生素泵出基因。肺炎链球菌耐红霉素，常由mefE基因介导。红霉素甲基酶基因(erm)介导大环内酯类、林可霉素和米卡霉素耐药。msrA基因仅介导对大环内脂类和米卡霉素耐药。msrA的PCR分析法可判定是存在msrA还是crmA，以辅助是否可选用氯洁霉素治疗耐红霉素葡萄球菌感染。

4．喹诺酮耐药基因的检测喹诺酮耐药的两大主要机制为：①靶位改变。DNA解旋螺旋酶(由gyrA和gyrB编码)和拓扑异构酶(由parC和parE编码)改变；②药物主动泵出。耐药常与9yr和par位点突变相关。PCR技术扩增后测定gyrA、parC和parE基因的核酸序列有助于检测对喹诺酮的耐药性。

5．糖肽类耐药基因的检测肠球菌耐药性有几种不同的基因，包括vanA、vanB、vanC l、vanC2、vanC3、ranD等，检测上述基因的DNA探针和PCR方法已有报道。日本、美国还报道了对糖肽类抗生素敏感性降低的金黄色葡萄球菌，由于耐药机制不清，目前尚未有相应的基因检测方法。

VanA型对万古霉素和替考拉宁均高度耐药，VanB型对万古霉素呈不同水平的耐药性，对肽可霉素敏感。用PCR方法检测肠球菌VanA基因可有效地预报多重耐药，抗生素药敏方法则不能区分该耐万古霉素的肠球菌是含VanA基因的肠球菌还是含VanB基因的肠球菌。 6．氯霉素耐药基因的检测编码氯霉素乙酰基转移酶的基因CATs存在于革兰阴性和阳性菌中，介导氯霉素耐药。检测CAT的DNA探针的特异性尚未肯定。

7．四环素耐药基因的检测四环素耐药可由tet系列的十几种不同基因介导。其中te t(M)扩散最广，可见于葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、革兰阴性杆菌如弯曲菌属、阴道加德纳菌、支原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌等等。PCR检测有助于判断牙周疾病用四环素治疗的疗效。

8．磺胺耐药基因的检测与磺胺耐药相关的耐药基因有SUⅡ和StlIII。其中，sulII 基因常与转座子如Tn21连在一起。转座子能介导多种耐药基因在细菌间传递，因此，sulI 基因可作为革兰阴性菌多重耐药的指征。

9．甲氧苄啶(TMP)耐药基因的检测细菌中介导TMP耐药的基因(dhfr)数量不断增多，尚未找到所有dhfr基因都相同的一致性序列。

10．分枝杆菌中耐药性基因的检测用PCR方法检测出结核分枝杆菌rpoB基因位点的突变，可在分离培养出结核分枝杆菌前指导临床医生不能使用利福平治疗。katG和inhA基因与异烟肼耐药相关，可通过PCR-RFLP分析和PCR产物的DNA序列分析来检测。

七、联合抗菌药物敏感试验和体外杀菌试验

体外联合药敏试验的目的在于：①混合性感染时，单一用药可能不能控制各种病原体；

②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；③联合用药比单一用药时毒性小；④联合用药比单一用药时效果更好。

抗菌药物联合用药有4种结果：①无关作用，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；

②拮抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③累加作用，两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。协同作用是临床和实验室期盼的结果。协同用药最典型的例子是青霉素或其同类物与氨基糖苷类抗生素联合治疗肠球菌感染心内膜炎。

尽管目前联合药敏试验较为费时费力，但当临床医生希望联合用药治疗时，必须做联合抗菌药物敏感性试验。

(一)联合抑茵试验

棋盘稀释法为目前临床实验室常用的定量方法，方法如下：

1．首先，分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。

2．根据上述MIC，确定药物稀释度。一般选6～8个稀释度，药物最高浓度为其MIC的2倍，依次对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行。这样可从管(孔)中得到不同浓度组合的两种药物混合液。

3．接种菌量为5×105CFU/ml，35℃孵育18～24h后观察结果。

4．计算部分抑菌浓度(fractional inhibi-tory concentration，FIC)指数。

FIC=(A药联合时的MIC/A药单用时的MIC)/(B药联合时的MIC/B药单用时的MIC) 判断标准：FIC指数<0.5为协同作用；0.5～1为相加作用；l～2为无关作用；>2为拮抗作用。

(二)联合杀菌试验

1．时间一杀菌曲线法采用杀菌动态曲线用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率，也可评价两种及两种以上抗菌药物对测试菌联合杀菌活性。方法如下：

(1)无菌试管标记为Oh、4h、8h、24h和生长对照五组。

(2)每管加入肉汤培养基lOml。

(3)每管中加入定量的测试药物。

(4)每管中加入0.1m1 0.5麦氏比浊度标准的菌液，使细菌终浓度为106CFU/ml。

(5)加入菌后，立即将0h管和生长对照管游涡混匀15s，并用生理盐水稀释1 000倍。取出0.1ml涂布于血琼脂平板上，35℃孵育过夜后计数菌落数。

(6)其他组试管按时培养后同法计算菌落数。

(7)将各时间点测的平均菌落数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线图。读取杀菌速率。

2．最低杀菌浓度测定最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)是指能杀灭99.9％以上测试菌量的最低药物浓度。由于影响杀菌的因素较多，某些菌株在体外可表现出对杀菌药物的耐受现象或反常效应，使MBC测定结果重复性差，并且难以确定杀菌

终点。与MIC测定法不同的是：①生长对照用MH肉汤稀释至103CFU/ml，取0.1ml涂布于2个血平板上，孵育过夜，计算菌落数，得到最初接种的菌落数。②测试管孵育20h，将无肉眼可见菌生长的各管混匀15s后再孵育4h，再次混匀后从无肉眼可见菌生长管中取0.1ml 涂布于2个血平板上，孵育过夜，计算菌落数。③当无肉眼可见生长管中的菌落数<最初接种菌落数的0.1％，该管的最低药物浓度即为MBC。

八、抗菌药物治疗效果监控试验

(一)血清药物浓度测定

通常，为保证感染组织中抗菌药物达到有效浓度，血药浓度应该达到致病细菌MIC2倍以上。当患者肝肾功能不全，或应用庆大霉素、氯霉素这类治疗浓度和中毒浓度相近的抗生素时，监测血清抗菌药物浓度十分重要。

根据抑菌商数(inhibitory quotient，IQ)可帮助调整临床抗菌药物种类、给药方式和剂量。IQ=体液抗菌药物浓度/MIC。

常规监控给药后的血药浓度峰值，一般在静脉给药后30min，肌注给药后lh，口服给药后1～3h采血。监控谷值则在下一剂药物给予前进行。

血清抗菌药物浓度测定方法有经典的微生物法和非微生物法。非微生物法需使用特定仪器设备，临床微生物室多用微生物测定法，其基本原理与琼脂扩散法相似。

(二)血清抗菌活性测定

本法是采取患者血液经分离所得的血清对感染部位分离确诊的病原菌进行抑菌和杀菌能力测定，为临床使用抗菌药的疗效考核评价以及感染预后的判断提供实验依据。

其方法与体外抑菌试验和体外杀菌试验相同。血清抑菌力/杀菌力>1：8常提示治疗方案有效。但对于某些严重感染，如细菌性心内膜炎，血清抑菌力/杀菌力比值的标准应>64，才能提示治疗方案有效。

九、特殊菌的耐药性监测

（一）耐甲氧西林葡萄球菌

在体外抗菌药物敏感性试验中，对30ug头孢西丁纸片的抑菌圈直径≤19mm或苯唑西林MIC≥4ug/ml的金黄色葡萄球菌以及对30ug头孢西丁纸片的抑菌圈直径≤24mm或苯唑西林MIC≥0.5/ug/ml的凝固酶阴性葡萄球菌，称耐甲氧西林葡萄球菌(methecillin resistance staphylococcus，MRS)。

1、耐药性产生机制

69％～l00％的MRS均含有macA基因，mecA检测结果和表型检测有较好的相关性。曾有学者建议将mecA作为判断耐甲氧西林葡萄球菌的标准。

macA是定位于MRS染色体的一段2130bp的DNA序列，与一段40～60kb的外源DNA一起整合于葡萄球菌染色体上。mecA基因在生物界起源尚不清楚，但多数实验结果支持为水平传播，且可经噬菌体转导。mecA基因编码产生78kD的青霉素结合蛋白2’(PBP2’)，其与β-内酰胺类药物的亲和力低，致使细菌在较高的药物浓度下仍继续生长繁殖表现其耐药性。

研究发现，存在mac操纵子，在mecA基因的上游存在有操纵基因mecRI和mecI。其中，mecI编码抑制蛋白，mecRI编码诱导蛋白。此外，mecA基因的表达还依赖于甲氧西林耐药表达辅助基因，如femA、femB、femD和femE，它们固有存在于染色体中。目前至少发现两种mecA表达的调节机制：①低度耐药株：诱导物和诱导蛋白与meeRI结合，活化了meeRI，直接或间接破坏抑制蛋白mecI和mecA的结合状态，去阻遏mecA的表达。②高度耐药株：由质粒介导的β-内酰胺酶调控蛋白BlaI、BlaRI代替mecI、mecRI的作用。此时，PBP2’产生不受mecA操纵基因控制。临床上分离的多重耐药MRSA，大多兼有mec操纵基因的破坏和质粒β-内酰胺酶基因的调控。

2、耐药性监测试验

1）基因监测

(1)核酸探针杂交技术：目前，mecA基因已克隆，以据此设计的探针标记32P、地高辛和酶等即可进行菌落原位杂交、斑点杂交和Southern印迹等检测。

(2)PCR技术：mecA基因具有高度保守性，可选择无或少潜在突变位点、GC含量约为5 0％的基因区域设计PCR引物。

2）表型检测 MRS的耐药监测有四种方法：K-B纸片扩散法、稀释法、E试验法和琼脂筛选试验。CLSI/NCCLS规定了试验的条件、质量控制和结果的判断。推荐质控敏感株为AT CC29213，耐药菌株为ATCC433300。

值得注意的是，苯唑西林MIC值为2～8ug/ml被判为MRSA的金黄色葡萄球菌可能具有mecA基因，也可能是因为产高水平β-内酰胺酶，以至缓慢水解苯唑西林。临床治疗MRSA 引起的感染首选万古霉素，而治疗产高水平β-内酰胺酶菌株所致感染，则应使用对酶稳定的β-内酰胺类药物或β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂合剂。因此，MIC值为2～8ug/ml的金黄色葡萄球菌应以PCR方法确证。

（二）耐万古霉素和高水平氨基糖苷类肠球菌

肠球菌对多种抗生素固有耐药，其引起的感染，如细菌性心内膜炎，一般都需要联合应用β-内酰胺类/多肽类与氨基糖苷类两类抗生素协同治疗以提高杀菌作用。若肠球菌对多肽类抗生素或高水平氨基糖苷类抗生素耐药，就没有有效的治疗方案。所以临床实验室需及时检测耐多肽类抗生素或高水平氨基糖苷类菌株，以指导临床医生使用有效的抗生素。

1）耐药性产生机制

1．耐高水平氨基糖苷肠球菌对氨基糖苷类的耐药性分为天然耐药和获得性耐药两种。天然耐药主要为摄入药物减少，表现为低、中等剂量的耐药。获得性耐药主要是产生质粒编码的修饰酶、核蛋白体靶位改变(如对链霉素耐药)。

2．耐万古霉素肠球菌对万古霉素的耐药性也分为天然耐药和获得性耐药两种天然耐药，又称VanC型耐药，主要包括鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和微黄肠球菌，其对万古霉素呈低水平耐药，对替考拉宁敏感。获得性耐药从其表型分为两类：VanA型和vanB型。VanA

型对万古霉素和替考拉宁均高度耐药，VanB型对万古霉素呈不同水平的耐药性，对替考拉宁敏感。

2）耐药性监测试验

1．耐高水平氨基糖苷类肠球菌肠球菌若对庆大霉素耐药，则对除链霉素以外的其他氨基糖苷类均耐药，所以常规耐药性检测试验主要是庆大霉素和链霉素的药敏试验。

CLSI/NCCLS推荐的试验方法有琼脂稀释法、微量肉汤稀释法和纸片扩散法。MIC判定界值庆大霉素为500ug/L，链霉素为2 000ug/L，链霉素试验时，若24h为阴性，则还须继续培养24h，再读结果。纸片扩散法则使用120ug/片的庆大霉素和300ug/片的链霉素，中介结果需补做MIC。推荐质控敏感株为粪肠球菌ATCC 29212，耐药株为粪肠球菌ATCC 51299。 2．耐万古霉素肠球菌临床有许多方法可检测耐万古霉素肠球菌，包括纸片扩散法和自动化仪器(Vitek和MicroScan系统)，但在检测低水平耐万古霉素肠球菌(VanB和VanC 型)时，敏感性降低。因此，CLSI/NCCLS推荐琼脂筛选法作为耐万古霉素肠球菌检测的经典方法。

琼脂筛选法的敏感性和特异性分别为96％～99％和l00％。琼脂筛选法用6ug/ml万古霉素脑心浸液琼脂。推荐质控敏感株为粪肠球菌ATCC 29212，耐药株为粪肠球菌ATCC 512 99。

（三）耐青霉素肺炎链球菌

肺炎链球菌对青霉素MIC>2ug/ml判为耐药，0.12～2.Oug/ml间判为中介。青霉素耐药机制是青霉素结合蛋白(PBP)的改变，肺炎链球菌对青霉素敏感，也对其他β-内酰胺类药物敏感；对青霉素耐药，则可能对一种或多种其他β-内酰胺类药物耐药。

1、耐药性产生机制

肺炎链球菌耐青霉素主要在于PBP(最主要PBP2)的改变，减低了对β-内酰胺类的亲和力。肺炎链球菌包含6种PBP(1a、1b、2a、2x、2b和3)。在青霉素敏感株，这些pbp基因高度保守(<1％序列改变)，其中，PBP2X是肺炎链球菌临床株中青霉素的原始靶位。在青霉素耐药株，pbp基因常为嵌合体基因(PBPla、2x和2b)，尤其是PBP2b，其对青霉素亲和力低，当其含量高时，可导致对青霉素形成表型耐药。当然，由于嵌合突变的复杂性，耐青霉素不一定耐广谱抗生素，耐广谱抗生素也不一定耐青霉素。

2、耐药性监测试验

所有肺炎链球菌侵入性的分离株，包括来自脑脊液和血液的菌株，应该通过MIC方法测试它们对青霉素和广谱头孢菌素的敏感性。ClSI/NCCLS介绍了微量稀释法和纸片扩散法来测试肺炎链球菌。但CLSI/NCCLS目前推荐特别是对于有生命危险的感染，不应用苯唑西林筛选试验，而应依青霉素和广谱头孢菌素(头孢噻肟、头孢曲松)的MIC而定。

许多实验室使用苯唑西林纸片作为筛选纸片，苯唑西林纸片抑菌圈直径>20mm，说明此株菌对青霉素敏感，也对其他β-内酰胺类药物敏感；但是，抑菌圈直径<19mm，不能轻易地归为耐药，要测定此菌的MIC值而定。例如，许多菌株青霉素MIC值为0.06ug/ml(敏感)，但抑菌圈直径<19mm。因此，如果做了苯唑西林筛选试验，而无MIC试验支持，有可能造成潜在的不恰当的治疗方案，特别是在青霉素耐药刚形成时，MIC很可能是在中介范围内的。

（四）产超广谱β-内酰胺酶细菌

超广谱β-内酰胺酶(ESBL)主要见于肠杆菌科细菌，是目前肠杆菌科细菌(尤其是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和产酸克雷伯菌)对广谱头孢菌素产生耐药性的最主要原因，它由质粒介导，可使细菌对青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青霉烯及酶抑制剂(克拉维酸)复合制剂敏感。

1）产生和分类

ESBL属于Bush功能分类的2be亚组，分子结构分类中的A类酶，包括TEM、SHV起源E SBL和非TEM、SHV起源ESBL。前者是由广谱β-内酰胺酶TEM-1/2和SHV-l经1～4个点突变，增强了对广谱β-内酰胺类抗生素的催化能力和亲和力而形成，也是现在世界各地最主要的流行类型。后者主要包括CTX-M系列和PER-1等，这些酶在世界某些地区有少量报道。 2）耐药性监测试验

不同种类的ESBL由于突变点不同，其介导的耐药表型也不一致，但CLSI/NCCLS规定不管体外药敏结果如何，只要确定为产ESBL菌株，对所有三代头孢菌素和氨曲南均应报告耐药。

ESBL的实验室检测主要是基于它可被酶抑制剂克拉维酸所抑制的原理。同时选用多种抗生素，如头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、头孢泊肟和氨曲南，作为检测底物能提高检出率。需注意的是，由于抗生素使用的差异，在我国用头孢噻肟作为检测底物对ESBL的检出率明显高于用头孢他啶作为检测底物，正好与欧美等西方国家相反。

CLSI/NCCLS已经规定了肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌ESBLS检测的初步筛选和表型确证试验，需要注意的是，CLSI/NCCLS强调，CLSI/NCCLS文件所描述的测试仅适用于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和产酸克雷伯菌，虽然其他肠杆科细菌以及某些非肠杆菌科细菌也能产生ESBLs。下面仅介绍非CLSI/NCCLS规定ESBL检测方法。

1．双纸片协同试验按标准纸片扩散法进行操作，将待检菌菌液均匀涂布于平板。待平板稍干后，中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，然后在距该纸片25mm(中心-中心)处分别贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，35℃孵育16～18h

观察结果。若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象(协同现象)，则说明待检菌产生超广谱β-内酰胺酶。

双纸片协同试验检测ESBL应注意纸片的距离，缩小两纸片问的距离可提高试验的敏感性，但抗生素纸片的抑菌圈会因纸片距离太近而发生融合，影响结果的判断。

2．三相水解试验分为直接法和间接法按标准纸片扩散法进行操作，将待检菌菌液均匀涂布于平板。待平板稍干后，贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，然后在距离抗生素纸片3mm的位置挖一个直径2mm的孔，在孔中加入30ul 0.5麦氏浓度的待检菌菌液，35℃孵育l6～18h观察结果。若抗生素纸片周围的抑菌圈形状发生改变，试验为阳性，说明待检菌产生超广谱β-内酰胺酶。如果在上述抗生素周围的抑菌圈很小或观察不到抑菌圈时，应改用间接法。

间接法与直接法的不同之处在于，间接法涂布的不是待检菌菌液，而是对上述抗生素均敏感的大肠埃希菌ATC/2 25922的菌液。

三相试验在操作上较困难，敏感性也不是很高，限制了其常规应用。

3．E-test E-test检测ESBL是基于检测MIC值的原理，共包括4种抗生素药物试条：头孢他啶、头孢他啶+克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟+克拉维酸。其操作方法与常规纸片法药敏试验的操作相同。当头孢他啶与头孢他啶+克拉维酸的MIC比值或头孢噻肟与头孢噻肟+克拉维酸的MIC比值大于或等于8(即3个对倍稀释度)，即判定为此细菌产生ESBL。

4．自动化仪器 MicroScan、Vitek等都有检测ESBl。的专用试条和专家系统。其原理也是基于先测定细菌对抗生素的MIC值。判断标准同E-test法。

5．其他方法可利用等点聚焦电泳、PCR、基因测序等生化和分子生物学方法检测、鉴定、监测ESBL。

（五）产头孢菌素酶细菌

头孢菌素酶即AmpC伊内酰胺酶，属于Bush分类l组(C类)丝氨酸头孢菌素水解酶，可介导细菌对三代头孢菌素的耐药，且不能被酶抑制剂克拉维酸所抑制，并且克拉维酸是其很强的诱导剂。β-内酰胺类抗生素中仅对四代头孢菌素、碳青霉烯类抗生素仍敏感。

1、产生和分类

AmpCβ-内酰胺酶可由染色体或质粒介导。几乎所有肠杆菌科细菌(除了沙门菌属和克雷伯菌属的某些种)和铜绿假单胞菌都可产生染色体AmpC酶。

染色体AmpC酶可分为诱导型和非诱导型。前者主要存在于阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌、黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌，在自然状态下细菌产生此种酶的量很少，但在β-内酰胺类抗生素(尤其是头孢西丁和亚胺培南)或肛内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)的作用下可大量诱导AmpC酶的产生(增加l00～1 000倍)。而且其调控基因的突变率很高，突变后将使酶不需诱导而持续大量产生，成为持续高产型菌株。后者主要存在于大肠埃希菌和志贺菌，由于调控基因缺陷，无论诱导剂是否存在，此种酶的产量都很少，临床意义不大。但突变后酶也可持续大量产生，成为持续高产型菌株。

染色体AmpC酶的持续大量表达与调节基因突变有关。天然状态下的染色体AmpC酶是典型的诱导酶，受amp复合操纵子的调控，其诱导调控机制已基本阐明。amp复合操纵子的诱导表达与细菌细胞壁肽聚糖循环有关，它由4个不连续基因即ampC、ampR、ampD和ampG

组成。ampD的某些突变，可导致AmpD蛋白活性下降或缺失，使菌体内N-乙酰胞壁酰三肽(细胞壁肽聚糖降解产物)大量累积，从而激活AmpR启动ampC基因的表达。ampR的某些突变可降低AmpR对ampC表达的阻遏作用。

质粒AmpC酶主要位于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、伤寒沙门菌和产气肠杆菌中。迄今为止共发现25种质粒AmpC酶，并且以每年1～2个新型别的速度增加。通常，质粒AmpC酶不需诱导便可持续大量表达。且质粒能够在不同细菌间播散，将引起比染色体AmpC酶更严重的问题。

根据质粒AmpC酶和染色体AmpC酶的氨基酸序列的同源性，将质粒AmpC酶按其染色体起源分为多个组：①来源于弗劳地枸橼酸杆菌染色体的，包括LAT-1/2/3/4、CMY-2/3/4/5/ 6/7/8/9和BIL-1；②采源于铜绿假单胞菌染色体的，包括CMY-1/8、FOX-1/2/3/4/5/6和M OX-1/2/3；③来源于阴沟肠杆菌染色体的，包括MIR-1、ACT-1；④来源于摩根菌染色体的D HA-1；⑤来源于黏质沙雷菌色体的ACC-1。

2、耐药性监测试验

由于诱导型染色体AmpC酶基因几乎存在于所有肠杆菌科细菌中，所以通过诱导检测染色体AmpC酶通常没有临床意义。临床上，对有可能产诱导型AmpC酶的菌株(阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌、黏质沙雷菌和铜绿假单胞菌)应严格控制头孢菌素等酶诱导剂的使用。

非诱导持续表达AmpC酶的检测方法尚未标准化。比较好的方法有间接三相试验和多重PCR。间接三相试验方法如下：

将50ul 0.5麦氏浓度的待检菌菌液加入12ml胰蛋白肉汤，35℃孵育4h，离心收集沉淀，反复冻融5次获得酶粗抽液。将大肠埃希菌ATCC 25922的菌液按标准纸片扩散法均匀涂布于平板，平板中心贴上一张头孢西丁纸片，用无菌手术刀片由距纸片边缘5mm处以辐射状方向向外划一道长的沟槽，然后将25～30ul酶粗抽液由内向外均匀加入沟槽(不要溢出，以免假阳性)，35℃孵育过夜。若沟槽和抑菌圈的交界处出现抑菌圈的缺损，则为阳性结果。

（六）多重耐药结核分枝杆菌

世界卫生组织(WHO)估计全球受结核分枝杆菌(MTB)感染的人数达20亿，其中有5 000万人感染了耐药结核分枝杆菌，至少又有1/3以上有发生多重耐药结核病(MDR-TB)的危险。MDR-TB治愈率低，治疗费用高，已成为20世纪后期全球结核病回升的主要原因之一，也是当今全球结核病研究的重点和难点。我国是结核病高发国家，耐药率很高，其中多重耐药更为严重。

1、耐药性产生机制

1）细胞膜或壁渗透阻碍 MTB细胞壁含极丰富的脂质(30％～60％)，构成了MTB的通透性屏障。分枝杆菌的某些特性如抗酸性、生长速率缓慢和对广范围抗菌药物的固有耐药，在很大程度上被认为与细胞壁渗透阻碍有关。

2）药物靶蛋白编码基因突变近年的研究表明，抗MTB药物靶蛋白的染色体编码基因发生突变是MTB耐药的主要分子机制。已确定耐药的抗结核药物主要是利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇(EMB)和喹诺酮类。

(1)利福平耐药的分子机制：利福平属一线抗结核药物，是快速杀菌剂。其作用机制是通过与RNA聚合酶B亚基(rpoB基因编码)结合，干扰转录的开始和RNA延伸。

MTB耐利福平的机制可能与RNA聚合酶t3亚基空间构象发生变化，以致不能与RFP结合有关。

研究表明，95％左右的rpoB突变发生在507-533位置27个氨基酸密码子(81bp)组成的区域内。突变率最高的是531位(丝氨酸-亮氨酸)，次之为526位(组氨酸-酪氨酸)等。目前，rpoB突变已作为MTB耐利福平的遗传标志。

(2)异烟肼耐药的分子机制：异烟肼是重要的一线抗结核药物。近年的研究表明，MTB 耐异烟肼可能与以下因素有关。①过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(KatG)突变：KatG基因含2 223个核苷酸，其表达的过氧化氢酶一过氧化物酶，在异烟肼抗MTB作用中起关键作用。若KatG缺失或突变，使过氧化氢酶一过氧化物酶活性丧失或降低，将导致INH耐药。研究表明，50％～70％的耐异烟肼MTB菌株有KatG突变，最常见的突变位点是463位(精氨酸-亮氨酸)和315位(丝氨酸-苏氨酸)。10％～24％的MTB临床分离株KatG完全缺失。②inhA 基因突变：inhA基因编码一种与分枝杆菌酸生物合成有关的还原酶。其产物为32kD的蛋白质。目前发现，inhA基因的突变主要为94位的丝氨酸-丙氨酸的置换。③烯酰基还原酶基因(ahpC)突变：它控制过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG和烷基过氧化氢酶的编码基因ahpC等的表达。目前发现ahpC基因突变可导致ahpC表达增强，但其与耐异烟肼的关系尚不清楚。

(3)链霉素耐药的分子机制：链霉素也是目前治疗结核病的一线药物。它主要作用于MT B的核糖体，诱导遗传密码的错读，抑制mRNA转译，从而抑制蛋白质合成。近年来的研究表明，大多数菌株耐链霉素是由于核糖体蛋白Sl2编码基因(rpsL)和或l6SRNA编码基因(r rs)突变所致。rpsL基因的突变，主要是43位密码子上一个单碱基的置换。rrs基因的突变，主要是513、516位的碱基插入。

(4)吡嗪酰胺耐药的分子机制：吡嗪酰胺作为一线抗结核药物已有近50年的历史。吡嗪酰胺是半休眠的杀菌剂，因而可缩短抗结核疗程。研究表明，MTB耐吡嗪酰胺是由于其吡嗪酰胺酶编码基因(pncA)突变，使吡嗪酰胺酶活性丧失或降低，而不能将吡嗪酰胺转变成活性型的吡嗪酸而发挥杀菌作用。

研究发现约72％的MTB耐吡嗪酰胺菌株有pncA突变，大多数为点突变，少数为插入或缺失突变。pncA基因全长561bp，其47、85和70位是突变率较高的部位。但有28％的耐吡嗪酰胺菌株在pncA基因及其上游85bp区域内末发现突变，说明还存在其他耐药机制。 (5)乙胺丁醇耐药的分子机制：乙胺丁醇的作用机制和MTB耐乙胺丁醇的机制还不十分清楚。已知乙胺丁醇是一种阿拉伯糖类似物，作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物的形成，使靶分子在细胞内的药物(如利福平)更容易进入细胞，因此乙胺丁醇与利福平联合治疗结核病有协同作用。

MTB耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因(embABC)操纵子突变有关。该操纵子约l0.2kb，由embC、embA和embB三个基因组成。研究发现，约70％的MTB耐乙胺丁醇分离株有embB基因突变，突变位点以306位多见。embB基因约3246bp，编码一个糖基转移酶，embB突变影响了乙胺丁醇和糖基转移酶的相互作用。余下30％乙胺丁醇耐药株无embB突变，说明存在其他耐药机制的可能。

(6)喹诺酮类药物耐药的分子机制：喹诺酮类药物作用于MTB的DNA旋转酶，抑制其活性，使DNA双链不能被解开，DNA复制停止，达到杀菌作用。DNA旋转酶由A、B亚基组成。A亚基编码基因(gyrA)长2517bp，位于B亚基编码基因(gyrB，长2060bp)下游36bp处。9y rA的67～106位点被认为是喹诺酮类药物的作用位点。

研究表明，MTB耐喹诺酮主要是gyrA突变所致。目前报道的细菌耐哇诺酮基因突变几乎都位于该区域，因此该区域被称为喹诺酮耐药决定区。现已发现的gyrA突变点主要有94、90、88位等。尚未见9yrB突变的报道。

(7)多重耐药的分子机制：一般认为MTB的多重耐药主要是由于各种药物作用于靶分子的编码基因，使其逐步突变所致。因为研究结果表明在耐INH、RFP和SM的MTB分离株中，55％～70％的菌株同时存在INH、RFP和SM三种以上的耐药基因突变；20％～30％有两种耐药基因改变，10％～15％只有一种耐药基因突变。而且耐药基因突变检出率与耐药浓度有关。这些结果也同时说明：不合理的化疗方案和不规律的治疗是发生MDR-TB的主要因素。也有观点认为MTB的多重耐药是由一个耐多药位点突变所致。

2、耐药性监测试验

WH0指出，MTB耐药性监测目的有三条：①指导结核病开始治疗时的药物选择；②治疗不能得到满意结果时，证实耐药性的出现，并指导进一步治疗药物的选择；③监测社会中耐药MTB的流行情况。

常规耐药性检测方法参见本章第三节。分子生物学检测主要采用建立于PCR基础上的突变检测技术，特殊之处介绍如下：

1）DNA样品的准备：DNA样品以细菌培养物为试验最适材料，而原始样品往往存在抑制剂或细菌含量太少而使扩增产物难以检测，所以一般仅限于涂片阳性样本。MTB的DNA制备方法基本同其他细菌，即采用酚／氯仿抽提法。但是MTB的细胞壁厚，脂类含量高，破壁困难，通常要增加消化酶的浓度并延长消化时间。

2）基于PCR的耐药基因分析方法

(1)PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)：PCR-SSCP是检测单碱基突变可靠而简便的方法。检测步骤主要包括PCR扩增、双链DNA变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SSCP结果分析。双链DNA的变性通常采用加热、骤冷的方法进行。变性分析可通过溴化乙锭(EB)或银染色获得结果，也可采用DNA测序仪进行分析。目前，国外大多采用本法研究MTB的耐药性。其在RFP、INH、SM和氟喹诺酮类抗结核药物耐药基因的突变研究和检测中的应用已有许多报道。本法的特点是简便、快速，2d内可获得测定结果；检测耐药基因有很强的特异性和较高的敏感性；与常规耐药性测定方法有很高的符合率；结果容易观察，并能长期保存；成本较低，又可同时分析多个样本，很适用于临床检测。但是SSCP操作技术要求较高，影响因素较多，只能用于确定有无基因突变而不能确定突变的部位和性质，这是PCR-SSCP的不足。

(2)DNA序列测定：DNA序列测定不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质，因此是检测基因突变的最理想方法，也是判断突变的金标准。DNA序列测定有多种方法，但PCR—DNA序列测定简便、快速，是最常用的测定方法。PCR扩增产物DNA测序主要包括PCR扩增、扩增产物的纯化及序列测定等步骤。

目前，DNA序列测定技术已在MTB耐药基因研究中得到广泛应用。并已用于rpoB、inh A、katG、rpsL和gyrA基因突变检测。

尽管DNA序列测定能够准确测定突变的部位与性质，但对每一株菌株来说，要测定各种抗结核药物所有已知的突变部位需多次反应，同时费用昂贵，因此其应用受到一定限制。 (3)PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)：PCR-RFLP法检测MTB耐药基因突变包括两个基本步骤：即PCR扩增和电泳片段的带型分析。电泳片段的带型分析是根据所用限制性内切酶的作用位点，观察待检片段是否存在含有特定酶切位点的DNA片段。

本法通过分析DNA序列的特定位点，并与药物敏感株带型比较，便可得知待检菌株是否存在特定位点的基因突变，但不能分析突变的性质，故本法的应用有一定的局限性。

3）耐药基因的基因芯片检测基因芯片技术同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对样品大量序列进行检测和分析。芯片技术也已用于MTB耐药性的研究和耐药基因的快速测定。

利用芯片技术作MTB耐药性的基因研究和耐药基因检测，从样品制备到检测结果，全程仅需4h，大大缩短了患者的细菌学诊断时间。如果合成的探针包括所有的突变类型，即能通过一次试验检测，即可得到五种一线抗结核药物及喹诺酮类药物的耐药相关基因突变信息。

但是芯片制备比较复杂，样品的标记又较为繁琐，检测成本较高，还需要昂贵的仪器设备，这是芯片检测技术不足之处。

3、MTB耐药性检测的展望

MTB耐药性的检测方法研究一直是结核病研究的热点和难点。经过数十年的努力，现已建立多种耐药性测定方法，但仍不能满足临床诊治的需要。①这些方法基本都是生长依赖性

的，即只能对分离的菌株进行检测，因而仍需较长时间；②药敏结果的临床含义即细菌学耐药与临床耐药结果的一致性不确切；③由于方法、原理及药物浓度上的差异，各方法间缺乏良好的可比性。④快速测定大多需特殊的仪器设备，且费用很多，难以普及应用。

利用分子生物学检测耐药基因也存在很多问题：①尚未找到各种药物的全部或绝大部分耐药基因；②虽已找到突变基因，但与耐药关系仍不清楚；③检测技术要求很高，影响因素较多；④要检测的耐药基因种类多，费用高；⑤直接测定临床标本的耐药性尚有问题；⑥与耐药基因突变有关的可能诱发因素至今尚不清楚。

当前尤其应加强下述方面内容研究：①进一步研究各种耐药基因突变与耐药表型之间的关系。寻找各种抗结核药物的作用位点、作用机制、耐药基因编码酶的调节途径。②进一步证明MTB耐药性改变与毒力变异之间的关系。③寻找耐药基因与可能的诱变因素之间的关系。④探索快速、灵敏、特异、简便、价廉的耐药基因突变检测新方法。⑤根据MTB作用机制和耐药机制开发新的抗结核药物，或从新的广谱抗生素制剂中筛选抗结核新药。

（七）其他特殊耐药性监测

1、过去对嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌的耐药性监测CLSI/NCCLS规定只能用MIC法。由于MIC法比较烦琐，所以很多基层医院并未开展这两种菌的耐药性检测。随着耐药性研究资料的积累，CLSI/NCCLS操作规程不断更新，2004年Ml00-S14文件规定，对嗜麦芽窄食单胞菌可以作米诺环素、复方新诺明、左氧氟沙星的K-B纸片扩散法测试，洋葱伯克霍尔德菌可以作头孢他啶、美罗培南、米诺环素的K-B纸片扩散法测试，并给出了判定界值。这显然有利于这两种菌耐药性监测的普及。

2、目前的研究表明，对大环内酯类抗生素耐药的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌可能对克林霉素具有天然或诱导耐药性。但是单纯的克林霉素纸片测试不能检出诱导耐药性，可误报为敏感。2004年CLSI/NCCLS Ml00-Sl4文件描述了采用红霉素纸片和克林霉素纸片的D试验，用来检测克林霉素的诱导耐药性。如果D试验阳性，临床上应认为：该菌株可能对克林霉素耐药，克林霉素仍可能对一些患者有效。

来源：检验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6