干细胞培养与鉴定
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NSC：1.0-2.0×105cells/mL
ESC：1×104/cm2~2×104/cm2
15
纯化鉴定
纯化方法：多次传代进行纯化 常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测；内毒素检测； 鉴定检测：增殖能力、生长形态、特异性抗原表达、核型 分析、诱导分化能力等
16
常规检测
17
鉴定检测共通项目
• 试剂： Ficoll淋巴细胞分离液，分离出密度在1.077±0.001g/L
之间的淋巴细胞
9
密度梯度离心法
• • • • • • • • 用 1xPBS 按照 1：1 的比例稀释骨髓； 稀释后的骨髓沿离心管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上； 离心； 离心完毕，小心吸取中间云雾状单个核细胞层； 离心，加入培养基重悬接种； 3天之后首次换液； 其后，每隔2-3天换液； 待细胞到80%融合的时候进行传代。
可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型
7
分离细胞
分离方法的选择 • BMSC：密度梯度离心法（人、猴、狗） 贴壁筛选法（大鼠、小鼠、兔） • ADSC：胶原酶消化法 • NSC：无血清培养基自然筛选法
• ESC：囊胚内细胞团迁移法
8
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离 心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域 上形成区带的方法。
22
MSC（间质干细胞）鉴定检测
23
MSC（间质干细胞）鉴定检测
• 诱导分化能力鉴定：成骨诱导（茜素红染色）
诱导前（汇合度65%-70%）
染色前
24
成骨诱导
25
MSC（间质干细胞）鉴定检测
• 诱导分化能力鉴定：成脂诱导（油红O染色）
诱导前（融合度90-95%）
成脂染色前
26
MSC（间质干细胞）鉴定检测
47
OricellTM系列无蛋白非程序冻存液
48
OricellTM系列耗材
细胞培养耗材的选择
• 干细胞培养板、培养瓶 （特殊TC处理表面，更适用于干细胞的贴壁培养） • 神经元/神经干细胞培养板 （多肽包被，无需PLL/Laminin预处理，保存时间长） • 15ml、50ml离心管 （透明度更高、耐更高转速）
50
产品售后服务内容
51
售后技术支持服务
52
贴心咨询服务
53
完善的售后质量保障服务
54
5
神经干细胞（NSC）
广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内
可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。
6
胚胎干细胞（ESC）
百度文库
胚胎干细胞(embryonicstemcellES, 细胞)是指胚泡期 的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、 具有发育全能性的早期胚胎细胞 无限增殖、自我更新
37
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 染色体结构
核型分析：正常稳定的二倍体核型，小鼠（40， XX/ XY) 。
不随传代次数而改变。
38
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 核型分析：显色技术
小鼠ES核型分析：40，XY
39
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 全能性
体内分化：畸胎瘤实验 体外分化：EB（拟胚体）形成实验
取材部位
BMSC：髂骨或胸骨、后肢股骨和胫骨 ADSC：抽脂手术的脂肪组织或腹股沟 NSC：胚胎大脑GE区 ESC：囊胚内细胞团
4
间质干细胞（MSC）
定义：来源于中胚层的早期细胞， 能够分化为多种中 胚层和神经外胚层来源的细胞。 来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。 来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、猪等。
50 40 30 20 10 0 1 2 3 4
Day
5
6
7
细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此 区间进行。可在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的 时间，即倍增时间。
19
MSC（间质干细胞）鉴定检测
形态学 表面抗原标记 多向分化能力
20
MSC（间质干细胞）鉴定检测
大鼠神经干细胞-贴壁培养
小鼠神经干细胞-悬浮培养
小鼠神经干细胞-贴壁培养
29
NSC（神经干细胞）鉴定检测
特异性抗原表达
• Nestin (神经干细胞标志物)阳性表达率≥75%
• β3-tubulin（神经元标志物）阳性表达率 ≤10%
• GFAP (星形胶质细胞标志物)阳性表达率≤10% • GalC或OSP（少突胶质细胞标志物）阳性表达率≤10%
35
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测-形态学
小鼠ES：紧密牢固结合、 多层密集立体生长，呈堆 积状，边缘清楚，细胞核 大、核仁明显、核浆比高。 有MEF 无MEF，无血清培养体系
人ES：相对松散、扁平 状集落,集落内细胞界限 隐约可见
36
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 特异性表达
抗原 人ES 小鼠ES Oct-4 + + Nanog + + SSEA-1 — + SSEA-3 + — SSEA-4 + —
• 形态学:梭形、成纤维样细胞 原代：克隆样生长 传代后：均质、旋涡状排列
Human
Rat
Mouse
Dog
Monkey
Rabbit
21
MSC（间质干细胞）鉴定检测
• 表面抗原标记（流式鉴定）： MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性,
它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细 胞因子受体以及整合素家族等。
• 诱导分化能力鉴定：成软骨诱导（阿利新蓝染色、三维培养法）
染色前
石蜡切片后染色图片
27
NSC（神经干细胞）鉴定检测
形态学特征：可做悬浮培养或贴壁培养
特异性抗原表达：Nestin 分化能力：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞
28
NSC（神经干细胞）鉴定检测-形态学
大鼠神经干细胞-悬浮培养
30
NSC（神经干细胞）鉴定检测
Rat NSC nestin staining
Mouse NSC nestin staining
31
NSC（神经干细胞）鉴定检测
分化能力
• 自然分化 加入含血清培养液，继续培养约7天，可分化为神经元、星型胶质细胞及 少突胶质细胞。三者的分化比例约为(16±7)%， (75±7)%和( 5±3)%。 • 定向分化
10
贴壁筛选法
• 取大鼠/小鼠的后肢股骨和胫骨； • 用1mL注射器吸入培养基后冲洗骨髓腔，将骨髓全部冲洗出来； • 骨髓悬液进行离心； • 弃上清，用培养基重悬细胞，接种到1个T25或者T75培养瓶中； • 3天后换液，以后每隔2-3天换液，待细胞80-90％融合时传代。
11
扩增传代
传代时机的控制（MSC为例）
解析：干细胞的培养与鉴定
产品经理：施真
主要内容
1. 干细胞原代提取及鉴定
2.干细胞培养体系与操作细节的重要性 3.OricellTM系列干细胞产品及售后服务
2
原代培养过程
3
原代取材
组织来源（个体年龄、健康状况）
BMSC、ADSC：成人（18-45周岁）、大鼠和小鼠（4周龄）、兔和狗（1-3 周龄） NSC：大鼠（孕龄14.5天的胚胎）；小鼠（孕龄12.5天的胚胎） ESC：小鼠（见栓后3.5天的孕鼠）
• 细胞汇合度的判断
• 传代消化时间的控制 • 接种密度的控制
培养体系的选择
12
扩增传代-细胞汇合度的判断(MSC)
13
扩增传代-消化时间的控制(MSC)
细胞消化15s
细胞消化35s
细胞消化55s
14
扩增传代-接种密度的控制
不同物种、细胞类型之间接种密度有差异
MSC、ADSC：2×104/cm2~4×104/cm2
分子生物学耗材（ Labcon系列）
全美进口●55周年历史●FDA/USP认证
• • • • 吸头 微量离心管 PCR产品系列 储样管、储样架等
49
细胞治疗用细胞因子
Cyagen团队特别针对免 疫细胞、干细胞培养开发的 一系列SCTSTM高活性细胞因 子产品，拥有高活性、高纯 度、高稳定性、无热源、无 外源因子污染等特点，更适 合干细胞、再生医学、免疫 学等研究使用。 常见治疗用细胞因子： IL-1α、IL-2、IL-4、IL-7 、IL-12、IL-15、GM-CSF、 IFN-γ、TNF-α
1.神经元方向分化：用无血清无生长因子诱导液诱导，可使分化比例升至
60%以上。 2.少突胶质细胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。
32
NSC（神经干细胞）鉴定检测
Rat NSC 神经元方向分化（Tubulin Staining)
星型胶质细胞方向分化（GFAP Staining)
33
• 复苏存活率 台盼蓝拒染法--如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进
入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不
为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
18
鉴定检测共通项目
• 细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或者CCK8法)
Growth Curve 60
（1X104 ） Cell quantity
NSC（神经干细胞）鉴定检测
少突胶质细胞方向分化（OSP Staining）
34
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
形态学：集落样或克隆样生长 特异性转录因子/抗原表达：表达OCT-4，Nanog； SSEA种属间表达有差异 染色体结构：传代过程中保持正常稳定的核型
全能性：具有向胚胎的三个胚层来源的所有细胞分化 的能力
生物试剂使用前仔细阅读产品说明书 操作干细胞时动作轻柔
• 复苏、传代、冻存等步骤重悬细胞的过程
培养基使用前复温、细胞接种之后摇匀、各种干细胞
接种密度的控制、试剂保存时避免反复冻融等
45
OricellTM系列干细胞产品及售后服务
干细胞
细胞培养耗材、分子耗材
培养基 冻存液
细胞因子
46
干细胞相关试剂及耗材
43
培养体系的选择
干细胞的研究和利用过程中，最主要的提供最适生长环境，保持培养开始时细胞群 体的状态，这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规。
44
干细胞饲养员必备素质-细节决定成败
无菌意识，重中之重
• 规范化的无菌操作
超净台取用物品摆放、操作时细节问题 • 环境的控制
培养箱的定期消毒、水浴锅定期换水、大环境的控制等
40
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 体内分化
将细胞注射入（约106个）SCID （重症联合免疫缺陷）或裸鼠体 内，约4周后（人ES可能需要 8~10周），可见细胞注射处有肿 块生成，处死小鼠，肿瘤固定后 做石蜡包埋，切片，普通HE染色 后观察。 ES可在小鼠体内生长、 分化、形成含有三个胚层来源的 良性畸胎瘤。
41
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 体外分化
ES
EB
贴壁诱导
约5~7天后出现自主性搏动
42
干细胞培养体系与操作细节的重要性
刚接触干细胞，不知道该用什么培养基？
费尽心血提取的干细胞养了几代就老化了？
原代取材杂细胞太多？ 细胞生长不均匀，有的地方密有的地方稀？ 操作其他细胞都没问题，养干细胞就出现了污染？ ………….
ESC：1×104/cm2~2×104/cm2
15
纯化鉴定
纯化方法：多次传代进行纯化 常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测；内毒素检测； 鉴定检测：增殖能力、生长形态、特异性抗原表达、核型 分析、诱导分化能力等
16
常规检测
17
鉴定检测共通项目
• 试剂： Ficoll淋巴细胞分离液，分离出密度在1.077±0.001g/L
之间的淋巴细胞
9
密度梯度离心法
• • • • • • • • 用 1xPBS 按照 1：1 的比例稀释骨髓； 稀释后的骨髓沿离心管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上； 离心； 离心完毕，小心吸取中间云雾状单个核细胞层； 离心，加入培养基重悬接种； 3天之后首次换液； 其后，每隔2-3天换液； 待细胞到80%融合的时候进行传代。
可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型
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分离细胞
分离方法的选择 • BMSC：密度梯度离心法（人、猴、狗） 贴壁筛选法（大鼠、小鼠、兔） • ADSC：胶原酶消化法 • NSC：无血清培养基自然筛选法
• ESC：囊胚内细胞团迁移法
8
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离 心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域 上形成区带的方法。
22
MSC（间质干细胞）鉴定检测
23
MSC（间质干细胞）鉴定检测
• 诱导分化能力鉴定：成骨诱导（茜素红染色）
诱导前（汇合度65%-70%）
染色前
24
成骨诱导
25
MSC（间质干细胞）鉴定检测
• 诱导分化能力鉴定：成脂诱导（油红O染色）
诱导前（融合度90-95%）
成脂染色前
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MSC（间质干细胞）鉴定检测
47
OricellTM系列无蛋白非程序冻存液
48
OricellTM系列耗材
细胞培养耗材的选择
• 干细胞培养板、培养瓶 （特殊TC处理表面，更适用于干细胞的贴壁培养） • 神经元/神经干细胞培养板 （多肽包被，无需PLL/Laminin预处理，保存时间长） • 15ml、50ml离心管 （透明度更高、耐更高转速）
50
产品售后服务内容
51
售后技术支持服务
52
贴心咨询服务
53
完善的售后质量保障服务
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神经干细胞（NSC）
广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内
可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。
6
胚胎干细胞（ESC）
百度文库
胚胎干细胞(embryonicstemcellES, 细胞)是指胚泡期 的内细胞团中分离出的尚未分化的、能在体外培养、 具有发育全能性的早期胚胎细胞 无限增殖、自我更新
37
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 染色体结构
核型分析：正常稳定的二倍体核型，小鼠（40， XX/ XY) 。
不随传代次数而改变。
38
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 核型分析：显色技术
小鼠ES核型分析：40，XY
39
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 全能性
体内分化：畸胎瘤实验 体外分化：EB（拟胚体）形成实验
取材部位
BMSC：髂骨或胸骨、后肢股骨和胫骨 ADSC：抽脂手术的脂肪组织或腹股沟 NSC：胚胎大脑GE区 ESC：囊胚内细胞团
4
间质干细胞（MSC）
定义：来源于中胚层的早期细胞， 能够分化为多种中 胚层和神经外胚层来源的细胞。 来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。 来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、猪等。
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Day
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细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此 区间进行。可在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的 时间，即倍增时间。
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MSC（间质干细胞）鉴定检测
形态学 表面抗原标记 多向分化能力
20
MSC（间质干细胞）鉴定检测
大鼠神经干细胞-贴壁培养
小鼠神经干细胞-悬浮培养
小鼠神经干细胞-贴壁培养
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NSC（神经干细胞）鉴定检测
特异性抗原表达
• Nestin (神经干细胞标志物)阳性表达率≥75%
• β3-tubulin（神经元标志物）阳性表达率 ≤10%
• GFAP (星形胶质细胞标志物)阳性表达率≤10% • GalC或OSP（少突胶质细胞标志物）阳性表达率≤10%
35
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测-形态学
小鼠ES：紧密牢固结合、 多层密集立体生长，呈堆 积状，边缘清楚，细胞核 大、核仁明显、核浆比高。 有MEF 无MEF，无血清培养体系
人ES：相对松散、扁平 状集落,集落内细胞界限 隐约可见
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ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 特异性表达
抗原 人ES 小鼠ES Oct-4 + + Nanog + + SSEA-1 — + SSEA-3 + — SSEA-4 + —
• 形态学:梭形、成纤维样细胞 原代：克隆样生长 传代后：均质、旋涡状排列
Human
Rat
Mouse
Dog
Monkey
Rabbit
21
MSC（间质干细胞）鉴定检测
• 表面抗原标记（流式鉴定）： MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性,
它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细 胞因子受体以及整合素家族等。
• 诱导分化能力鉴定：成软骨诱导（阿利新蓝染色、三维培养法）
染色前
石蜡切片后染色图片
27
NSC（神经干细胞）鉴定检测
形态学特征：可做悬浮培养或贴壁培养
特异性抗原表达：Nestin 分化能力：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞
28
NSC（神经干细胞）鉴定检测-形态学
大鼠神经干细胞-悬浮培养
30
NSC（神经干细胞）鉴定检测
Rat NSC nestin staining
Mouse NSC nestin staining
31
NSC（神经干细胞）鉴定检测
分化能力
• 自然分化 加入含血清培养液，继续培养约7天，可分化为神经元、星型胶质细胞及 少突胶质细胞。三者的分化比例约为(16±7)%， (75±7)%和( 5±3)%。 • 定向分化
10
贴壁筛选法
• 取大鼠/小鼠的后肢股骨和胫骨； • 用1mL注射器吸入培养基后冲洗骨髓腔，将骨髓全部冲洗出来； • 骨髓悬液进行离心； • 弃上清，用培养基重悬细胞，接种到1个T25或者T75培养瓶中； • 3天后换液，以后每隔2-3天换液，待细胞80-90％融合时传代。
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扩增传代
传代时机的控制（MSC为例）
解析：干细胞的培养与鉴定
产品经理：施真
主要内容
1. 干细胞原代提取及鉴定
2.干细胞培养体系与操作细节的重要性 3.OricellTM系列干细胞产品及售后服务
2
原代培养过程
3
原代取材
组织来源（个体年龄、健康状况）
BMSC、ADSC：成人（18-45周岁）、大鼠和小鼠（4周龄）、兔和狗（1-3 周龄） NSC：大鼠（孕龄14.5天的胚胎）；小鼠（孕龄12.5天的胚胎） ESC：小鼠（见栓后3.5天的孕鼠）
• 细胞汇合度的判断
• 传代消化时间的控制 • 接种密度的控制
培养体系的选择
12
扩增传代-细胞汇合度的判断(MSC)
13
扩增传代-消化时间的控制(MSC)
细胞消化15s
细胞消化35s
细胞消化55s
14
扩增传代-接种密度的控制
不同物种、细胞类型之间接种密度有差异
MSC、ADSC：2×104/cm2~4×104/cm2
分子生物学耗材（ Labcon系列）
全美进口●55周年历史●FDA/USP认证
• • • • 吸头 微量离心管 PCR产品系列 储样管、储样架等
49
细胞治疗用细胞因子
Cyagen团队特别针对免 疫细胞、干细胞培养开发的 一系列SCTSTM高活性细胞因 子产品，拥有高活性、高纯 度、高稳定性、无热源、无 外源因子污染等特点，更适 合干细胞、再生医学、免疫 学等研究使用。 常见治疗用细胞因子： IL-1α、IL-2、IL-4、IL-7 、IL-12、IL-15、GM-CSF、 IFN-γ、TNF-α
1.神经元方向分化：用无血清无生长因子诱导液诱导，可使分化比例升至
60%以上。 2.少突胶质细胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。
32
NSC（神经干细胞）鉴定检测
Rat NSC 神经元方向分化（Tubulin Staining)
星型胶质细胞方向分化（GFAP Staining)
33
• 复苏存活率 台盼蓝拒染法--如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进
入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不
为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
18
鉴定检测共通项目
• 细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或者CCK8法)
Growth Curve 60
（1X104 ） Cell quantity
NSC（神经干细胞）鉴定检测
少突胶质细胞方向分化（OSP Staining）
34
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
形态学：集落样或克隆样生长 特异性转录因子/抗原表达：表达OCT-4，Nanog； SSEA种属间表达有差异 染色体结构：传代过程中保持正常稳定的核型
全能性：具有向胚胎的三个胚层来源的所有细胞分化 的能力
生物试剂使用前仔细阅读产品说明书 操作干细胞时动作轻柔
• 复苏、传代、冻存等步骤重悬细胞的过程
培养基使用前复温、细胞接种之后摇匀、各种干细胞
接种密度的控制、试剂保存时避免反复冻融等
45
OricellTM系列干细胞产品及售后服务
干细胞
细胞培养耗材、分子耗材
培养基 冻存液
细胞因子
46
干细胞相关试剂及耗材
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培养体系的选择
干细胞的研究和利用过程中，最主要的提供最适生长环境，保持培养开始时细胞群 体的状态，这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规。
44
干细胞饲养员必备素质-细节决定成败
无菌意识，重中之重
• 规范化的无菌操作
超净台取用物品摆放、操作时细节问题 • 环境的控制
培养箱的定期消毒、水浴锅定期换水、大环境的控制等
40
ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 体内分化
将细胞注射入（约106个）SCID （重症联合免疫缺陷）或裸鼠体 内，约4周后（人ES可能需要 8~10周），可见细胞注射处有肿 块生成，处死小鼠，肿瘤固定后 做石蜡包埋，切片，普通HE染色 后观察。 ES可在小鼠体内生长、 分化、形成含有三个胚层来源的 良性畸胎瘤。
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ESC（胚胎干细胞）鉴定检测
• 体外分化
ES
EB
贴壁诱导
约5~7天后出现自主性搏动
42
干细胞培养体系与操作细节的重要性
刚接触干细胞，不知道该用什么培养基？
费尽心血提取的干细胞养了几代就老化了？
原代取材杂细胞太多？ 细胞生长不均匀，有的地方密有的地方稀？ 操作其他细胞都没问题，养干细胞就出现了污染？ ………….