蛋白质芯片
常规蛋白质芯片的构建方法及前景
常规 蛋 白 质 芯 片 的构 建 方 法及 前 景
刘子 一 ，石 霖
（． 宁省 沈 阳市于 洪 区动 物疫 病预 防控 制 中心 ，辽 宁 １辽
沈 阳 １ ０ ７ １ ２； ０
２ 辽 宁省 动 物疫 病预 防控 制 中心 ，辽 宁 ．
中图 分 类 号
～ 一 一 ● 究 发 现 ，其 非 特 异 结 合 性 是 常 规 载 体 的 使 用 诸 如无 脂 奶粉 、牛 血 清 白蛋 白、 干 酪素 等 封
百 分之 一 ，又 如 利用 微 印章 接 触 式 技 术 将 双 极性 闭剂 的方 法 减 低 背 景 。封 闭剂 非特 异 地 吸 附到 芯 分 子 固定 在 金及 其 他 载 体 的表 面 形 成 一 端和 载 体 片 的 空 白区 ， 由于 其 结 合 力 较低 ，在 合 适 的洗 液 表 面 共 价 结 合 。另一 端 和 捕 获 分 子共 价 结合 的 自 中可 以有 效 地 去 除 。
Ｓ） ｉ －ｅ） ｎ 进行 适 当 的化 学修 饰 ，通 过 静 电力 吸 附 或共 价 键 Ｅ Ｄ 、非 接 触 式 的 喷 墨 打 印 （ ｋ ｊｔ；后 者 如 光
Ｐ ｏ ｌｈ ｇａｈｃｌ ｒ ｔ、微 接 触 ｏ ｔ ｉ 结合 的方 式 结 合 蛋 白分 子 ，常 见 的抗 体 抗 原 均可 导 平 板 点 样 （ｈｔ—ｉ ｏｒｐｉａ ｐ ｎ） 以被 结 合 上 去 ，缺 点是 结合 效 率 参 差 不齐 。近 年 式 印 章 点样 （ ｃｏｏｔｃ Ｐ ｎｉｇ 、远距 电喷样 Ｍｉｒｃｎａｔ ｒ ｔ ） ｉ ｎ
一 一 一 一 一
［ 摘
要］蛋 白质 芯片是 继核酸 芯 片后发展 起来 的一 个新 技术 。和基 因芯片一样 ，蛋 白质
生物芯片技术及其在医学上的应用
生物芯片技术及其在医学上的应用近年来，随着生物芯片技术的高速发展，其在医学领域中的应用越来越广泛。
生物芯片技术是指将微小的生物材料固定在芯片的表面上，以探测生物分子、细胞或组织的一种技术手段。
它的优势在于快速、准确、高通量和高灵敏度，被广泛应用于高通量基因分型、蛋白质鉴定、细胞生物分析、药物筛选、立体图像构建等领域。
一、生物芯片技术生物芯片技术是指使用微电子技术制造出小型芯片，在芯片上通过精巧的设计排列多个生物分子检测元件，可同时进行大量生物学实验，并可快速记录和分析实验结果，极大地提高了实验效率。
其中，常用的生物芯片技术有基因芯片技术、蛋白质芯片技术和细胞芯片技术。
1.基因芯片技术基因芯片技术是基于DNA、RNA的芯片技术，用于同步探测及分析大量基因DNA序列的表达情况，从而了解不同组织、不同状态下基因表达水平的变化，并寻找与特定疾病有关的基因表达水平的差异。
它的快速高通量的处理能力可为全基因组表达分析、基因突变筛查、SNP检测、基因亚型鉴定、疾病识别、药物靶标发现和新药研究等提供有力的支持。
2.蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是利用固相法在玻片、滤膜、微球或微芯片的表面上制备一系列纯化的特异性或全长的蛋白质样品阵列，用于快速大规模地筛选靶蛋白质，分析蛋白质相互作用、酶活性或某些组分与特定蛋白质的结合能力等。
它可用于疾病标记物的检测和筛选、蛋白功能鉴定、蛋白特异性鉴别、药物筛选等方面。
3.细胞芯片技术细胞芯片技术是利用微流控技术制作微小的通道和微型反应器，在芯片上实现细胞的悬浮、培养和观测等操作。
它可应用于各种组织细胞的轻松快捷的分离、单细胞的提取、测序和分析，可推广到药物筛选和个性化医疗等领域。
二、生物芯片技术在医学上的应用生物芯片技术的高通量、高灵敏度、高可靠性和高通用性，使其成为了医学领域中的重要工具，可应用于诊断、预后分析、治疗方案的制定和药物研究等方面。
1.疾病诊断和预后分析基因芯片技术可用于疾病的早期诊断，如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、直肠癌等癌症的检测。
蛋白质检测方法
蛋白质检测方法蛋白质是生物体内重要的组成部分，对于生命的维持和发展起着至关重要的作用。
因此，蛋白质的检测方法也显得尤为重要。
本文将介绍几种常见的蛋白质检测方法，希望能够为相关领域的研究人员提供一些帮助。
一、SDS-PAGE。
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，将蛋白质按照其分子量大小进行分离。
首先，将待检测的蛋白样品在含有十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液中进行变性处理，使得蛋白质呈现带负电荷。
然后，将蛋白样品加载到凝胶孔中，施加电场进行电泳分离。
最后，通过染色或Western blot等方法检测蛋白质的分离情况。
二、免疫印迹（Western blot）。
免疫印迹技术是一种高度特异性的蛋白质检测方法，能够检测特定抗原蛋白在混合蛋白质中的存在情况。
首先，将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE分离，然后将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上。
接着，用特异性的抗体结合目标蛋白，再用酶标记的二抗结合一抗，最后通过显色反应来检测目标蛋白的存在。
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）。
ELISA是一种常用的蛋白质检测方法，具有高灵敏度和高特异性。
通过将待检测的蛋白样品吸附在微孔板上，然后加入特异性的抗体结合蛋白质。
接着，加入酶标记的二抗结合一抗，最后通过显色反应来检测目标蛋白的存在。
四、质谱分析。
质谱分析是一种高效的蛋白质检测方法，能够准确测定蛋白质的分子量和氨基酸序列。
通过质谱仪的作用，将待检测的蛋白样品进行离子化，然后通过质谱仪测定蛋白质的质荷比，从而得到蛋白质的分子量和氨基酸序列信息。
五、免疫沉淀。
免疫沉淀是一种通过抗体特异性结合来沉淀目标蛋白的方法。
首先，将待检测的蛋白样品与特异性抗体结合，然后再加入沉淀剂如蛋白A/G琼脂糖，使得抗体-蛋白质复合物沉淀下来，最后通过洗涤和离心来获取目标蛋白。
六、蛋白质芯片技术。
蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质检测方法，能够同时检测大量的蛋白质。
生物芯片的技术原理及应用
生物芯片的技术原理及应用生物芯片是一种集成电子学、生物学和化学的多学科交叉研究领域，它是一种利用半导体工艺制作微小芯片，在芯片上刻制出细小、复杂和高灵敏度的电极，并通过微蠕动泵等技术将生命体系中的生物分子，如DNA序列、蛋白质和其他生物分子，限定或捕获在芯片上，再通过电化学或光学方法对生物分子的特性进行检测和分析的技术手段。
生物芯片的基本技术原理包括芯片制造、生物分子捕获与定位、生物反应与检测。
一、芯片制造生物芯片的制造方法主要有两种：基于光刻的方法和基于微流控制的方法。
基于光刻的方法是先利用微电子学制造出芯片的电路结构，再使用光刻技术将微生物捕获点和微反应槽等结构刻制在芯片表面。
而基于微流控制的方法则是利用微流控芯片中微型气泡、微液滴等构造实现微反应。
二、生物分子捕获与定位在芯片制造完成后，接下来就需要进行生物分子捕获与定位的工作。
这个步骤主要有两种方式：第一种是利用生物分子的特异性识别作用，将特定基因或蛋白质与芯片表面的探测分子上的互补序列或抗原-抗体等配对，从而实现生物分子在芯片上的捕获；第二种方式则是通过微型流动系统将微通道中的生物分子实现限制与定位。
这些方法可以实现高通量的生物分子捕获和多样的生物分子定位和形态控制。
三、生物反应与检测生物芯片利用电化学、光学和电学等多种检测方法来实现对生物分子的检测。
其中最常用的技术包括荧光检测、电化学检测和表面等离子体共振检测。
荧光检测利用特定探针与目标生物分子的结合发射自然荧光，从而实现生物分子的检测。
电化学检测主要是利用电化学基团与生物分子之间的相互作用来实现检测。
表面等离子体共振检测则是利用激光对金属膜表面散射的电磁波的强度，实现对生物分子的定量和检测。
生物芯片的应用涉及众多领域，从基因诊断到食品安全，从医院到实验室。
下面我们来简单介绍一下其主要应用领域：1. 基因芯片基因芯片是生物芯片最常用的一种，主要用于DNA测序和检测。
它的优点在于能够实现高通量的基因测序和高度特异性的DNA检测，可以快速、准确地识别和研究疾病基因、生物技术基因等。
蛋白组学检测方法
蛋白组学检测方法蛋白组学是研究生物体内所有蛋白质的组成、结构和功能的一门学科，而蛋白组学检测方法则是用来分析和检测生物体内蛋白质的方法。
蛋白组学检测方法的发展为我们深入了解蛋白质的功能和作用机制提供了有力工具。
在本文中，我们将介绍几种常见的蛋白组学检测方法。
1. 质谱分析质谱分析是一种高效、灵敏的蛋白质检测方法。
通过将待测样品中的蛋白质分子进行离子化，然后通过质谱仪对离子进行质量分析，从而确定蛋白质的分子量、序列和修饰情况。
质谱分析可以用于研究蛋白质的组成、结构和互作关系，对于发现新的蛋白质标志物和药物靶点具有重要意义。
2. 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质检测方法。
它利用微阵列技术将大量的蛋白质分子固定在芯片上，并通过特定的探针与待测样品中的蛋白质发生特异性结合，从而实现对蛋白质的快速、高效的检测和定量。
蛋白质芯片技术可以广泛应用于蛋白质的功能研究、疾病诊断和药物筛选等领域。
3. 蛋白质组学测序蛋白质组学测序是一种用于确定蛋白质氨基酸序列的方法。
在蛋白质组学测序中，蛋白质样品首先经过蛋白质分解酶的消化，然后通过质谱分析或色谱分离技术，将产生的蛋白质片段进行逐一测序，最终得到蛋白质的完整序列信息。
蛋白质组学测序可以用于研究蛋白质的结构与功能，鉴定蛋白质的修饰和突变，进而揭示蛋白质的作用机制。
4. 蛋白质结构分析蛋白质结构分析是一种用于确定蛋白质三维结构的方法。
常见的蛋白质结构分析方法包括X射线晶体学、核磁共振和电子显微镜等。
通过这些方法，可以高分辨率地解析蛋白质的原子结构，从而深入理解蛋白质的功能和相互作用。
蛋白质结构分析对于药物设计和疾病治疗具有重要的指导意义。
5. 蛋白质互作网络分析蛋白质互作网络分析是一种研究蛋白质相互作用关系的方法。
通过蛋白质互作网络分析，可以揭示蛋白质间的相互作用网络，了解蛋白质的功能模块和信号通路，进而推断蛋白质的功能和作用机制。
蛋白质互作网络分析对于疾病的发生和发展具有重要的启示作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和靶点。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
生物芯片技术及其应用
生物芯片技术及其应用随着现代科技的不断发展，生物芯片技术也日益成为了许多领域的重要研究方向。
生物芯片技术是以微电子加工技术为基础，将各种生物分子如DNA、RNA、蛋白质等固定在芯片上，并利用微流控技术对这些生物分子进行分析和检测的一种新兴技术。
它具有高通量、高灵敏度、高精度、高速度等优点，广泛应用于医学诊断、环境监测、生命科学等领域。
一、生物芯片技术的发展历程生物芯片技术最初可以追溯到20世纪80年代，当时科学家们开始关注如何利用微观和纳米级别的生物材料进行生物分析。
20世纪90年代初期，生物芯片技术开始得到普及，并且得到了快速发展。
1993年，美国的Affymetrix公司推出了基因芯片技术，这是生物芯片技术的重要里程碑之一。
二、生物芯片技术的分类目前生物芯片技术主要分为两类：基因芯片和蛋白质芯片。
基因芯片主要用于基因表达谱分析、基因突变检测和疾病相关基因的筛查等方面。
蛋白质芯片主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白质鉴定和药物筛选等方面。
此外，还有细胞芯片和抗体芯片等。
三、生物芯片技术的应用生物芯片技术可以广泛应用于医学、环境监测、农业、食品生产等领域。
1. 医学应用生物芯片技术在医学领域有广泛的应用，例如用于癌症筛查、无孔不入诊疗、基因组学研究等。
基因芯片可以为临床用药提供个体化的药物治疗方案，这是针对疾病的精准医疗方案的一个重要方向。
此外，基因芯片也可以用于检测遗传病，进一步提高疾病的诊断和治疗效果。
2. 环境监测生物芯片技术在监测环境中的污染和生物多样性方面也很有用。
例如，通过基因芯片和微生物芯片技术可以对环境中的微生物进行高通量检测，了解污染物的来源、类别和程度等。
3. 农业生产生物芯片技术也可以应用于农业生产领域，例如利用基因芯片进行植物遗传变异筛查、耐盐性筛查等等。
这些技术将有助于提高农业生产效率和产品质量以及降低面临的挑战。
同时，他们也能保护环境并减少对食品的农药和化肥的使用。
四、生物芯片技术的发展前景生物芯片技术在生物科学、医学、环境科学和其他一些领域中的应用前景非常广泛。
蛋白质芯片在肿瘤研究中的应用
［ 文章编号 ］ １７ ７ ９ （ ００ ０ ０４ ６ ２— １３ ２ １ ）４— ７ ５—０ ３
肿瘤 作为健康的杀手正在严重威胁着人类 的生命 ， 尤其 是 恶性 肿瘤 ， 一经发现往往 已经是癌症晚期。这就需要 找到一 种
１３ 功能 ．
蛋 白质芯片 已经在蛋 白质组学 的多个研究 领域有
所应 用 ， 主要包括 ：１ 蛋 白质表达谱 的研究 ， 于生物标 志物 （） 用 的发现 ；２ 蛋 白质 一蛋 白质 、 白质 ～Ｄ Ａ以及 蛋 白质 一小 （） 蛋 Ｎ
蛋白质之 间相互作用 的关 系， 由此达到测定各种蛋 白质功 能的
徐 秀梅 ， 刘 辉 ， 志巍 何
［ 摘要 ］ 蛋 白质芯片是继基 因芯 片之后发展起 来的一项快速、 高效 、 灵敏 的蛋 白质分析技术 ， 为蛋 白质的功 能研 究提 供 了强 有力的工具 ， 在肿瘤研 究方面的应用尤为突 出。 它可 以同时检 测样 本 中多个肿瘤标志物表 达水平 的变化 ， 这些与肿 瘤相 关的标 将
１２ ３ 孵育 ．．
将芯 片和血清 、 细胞 或组织抽 提液一起孵育 ， 样
品中的蛋 白就会结合到相应的抗体上 。
１ 蛋 白质 芯 片 的原理 及创 作流 程
１ １ 原理 ． 蛋 白质芯片技术 的基本原理是 将大量不 同探针 固
１２４ 检 测 芯片经激光扫描仪 、 光成像 仪或质谱仪检 测 ， ．． 磷 所得 的信号 强度 与该 位点抗 体所 对应 的 蛋 白表达水 平 有关 。
分子之 间相互作 用的鉴定 ；３ 对蛋 白质翻译后修饰的检测 ， （） 进
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亲和结合 亲和结合
Agarose thin film 3D gel pad
扩散
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记
表面蛋白分布均一容量
无需蛋白修饰过程，高结合容量
制作难，未商品化
蛋白质芯片的应用
疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学
疾病诊断
定量检测组织提取液中的肿瘤标记物
孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原
uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子
微阵列方法与ELISA方法检出结果比较
药物开发
高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂
His6-RB/GST-E7相互作用抑 制剂筛选微阵列图
蛋白质芯片的分类
➢ 蛋白质检测芯片 ➢ 蛋白质功能芯片
Methods for Protein Analysis
Gel electrophoresis, northern/western blot (fluorescence/radio active label) X-ray crystallography 2D - mass spectrometry Protein microarrays SELDI MS protein chips
加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的 His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
蛋白质组学 人动脉平滑肌细胞蛋白谱
4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相 互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降
Thank you ！
5.微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA或Gly
蛋白质芯片比较
表面
蛋白固定方式
优点
PVDF Nitrocellulose
吸附 吸附
无需蛋白修饰过程，高结合容量 无需蛋白修饰过程，高结合容量
缺点
非特异吸附，分布随机 非特异吸附，高背景，低密度
Poly-lysine coated 吸附，共
Aldehyde-coated 价偶联
细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱
揭示了oxidized low density lipoprotein 诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式
技术难点
成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器
芯片的标准化问题
提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操 作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片 背景对于结果分析的影响等等
的相互作用关系。
蛋白质芯片的关键技术1提出源自物学问题（实验目的）2
蛋白质芯片制备
6
数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
5
样品预处理
3
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件
Epoxy-activated
PDMS nanowell
共价
偶联
Gold coated silicon
无需蛋白修饰过程，高密度，
非特异吸附，分布随机
高分辨检测
高密度，高分辨检测
分布随机，表面有吸附
高密度，适合复杂的生化分析
高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化
Avidin coated Ni-NTA coated
4
蛋白质芯片的制备
1. 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）
2. 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解
3. 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等
4.固定微阵列上的蛋 白样点
膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h
载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白
展望—蛋白质芯片未来的发展重点
建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法， 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。
改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异 性结合。
提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以 保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。
研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像 与数据分析一体化。
内容提要
➢蛋白质芯片概述 ➢蛋白质芯片的关键技术 ➢蛋白质芯片的应用 ➢展望
蛋白质的概述
蛋白质芯片，又称为蛋白质微阵列(protein micro array)是大 量的蛋白质分子(例如抗体或抗原分子)或肽链有序排列固定在 载体薄片上形成的。利用蛋白质或肽能特异性地与配体分子 (如抗体或抗原)结合的原理，芯片上的蛋白质分子或肽链与样 品中的相关成分发生反应，然后加入标记分子，并用阅读仪 分析和存储结果，这就是蛋白质芯片的工作原理。构建蛋白 质方阵需解决三个问题，一保持蛋白的活性，二保证蛋白质 正确定位，三与现存的基因微型方阵研究工具相兼容。蛋白 芯片是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法。它是在 基因芯片的基础上发展起来的。与传统的研究方法相比有以 下特点：(1)蛋白芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实 验中提供大量的信息，使我们能够全而、准确地研究蛋白表 达谱；(2)灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存 在，检测水平已达ng级；(3)所需的样品量极少。
蛋白质芯片的定义
生
基因芯片
蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列
物
蛋白质芯片
或蛋白质微阵列，是指以蛋白质
芯
分子作为配基,将其有序地固定
片
微流控芯片
在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它
分子与之作用，洗去未结合的成
分，经荧光扫描等检测方式测定
芯片上各点的荧光强度，来分析
蛋白之间或蛋白与其它分子之间