浙江工业大学生物化学实验论文——对啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
浙江工业大学生物与环境工程学院生物化学实验论文
姓名：
组员：
学号：学科：食品科学与工程
所在院系：生物与环境工程学院
指导教师：邱乐泉
2012 年12 月1日填
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
摘要：
为了解酶的初步提取及纯化方法，并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法；用Folin-酚试剂、微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法，SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量。除此之外，还要掌握高速离心机、Q-Sepharose柱层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。
这一系列实验需要实验预制作——酵母的自溶，大约3天以后，酵母细胞壁破裂，胞液流出，经多次分别离心得到初提液A、热提液B和乙醇提取液C。利用
Q-Sepharose柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液D并在280nm处测D的吸光值，用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试，发现洗穿透峰得到的第1、2管酶活力高，从第3管以后吸光值开始下降，且吸光值大的酶活力较大。得到4种酶提取液样品以后，便可以制作葡萄糖标准曲线，进行定量酶活力测定，葡萄糖标准曲线是一条直线，根据曲线回归方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率，比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并且知道随着酶的提纯，A、B、C、D4个样品的纯化系数升高，比活力升高，总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降，其中A的蛋白质含量最高，D的纯化程度最高。最后用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、考马斯亮蓝的染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量，得到2条蔗糖酶条带，计算的蔗糖酶相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮法；SDS-聚丙烯胺凝胶
Summary：
To understand the the enzymes preliminary extraction and purification methods, and on this basis to master the principles and methods of determination of enzyme activity; Folin-phenol reagent, trace Kay ceremony will be the principles and methods of nitrogen determination of the protein content, SDS-PAGE protein determination of therelative molecular mass. In addition, we must master the use of high-speed centrifuges, Q-Sepharose column chromatography, UV spectrophotometer, Kjeldahl instrument, distillation apparatus, electrophoresis.
This series of experiments requires experimental pre-production - yeast autolysis, about three days later, the yeast cell wall rupture, cytosolic outflow to the beginning of extracts A, after repeatedly respectively centrifugal heat extracts B and ethanol extract C. Using Q-Sepharose column chromatography to obtain an eluate D eluted ethanol extract C and the absorbance value of the 280nm measured at D, the enzyme activity test, and found to penetrate wash peak obtained with glucose tests strips
qualitative 1,2 tube enzyme activity began to decrease from the absorbance values after 3 and suck the light value greater enzyme activity. Later to obtain four kinds of enzyme extraction fluid sample, it can produce a standard curve of glucose, quantitative enzyme activity assay, the glucose standard curve is a straight line, according to the regression equation to calculate the number of units and enzyme recovery of the total activity of the four samples, and comparing the calculated results You can know are reduced as the number of units of the total activity of the purified enzyme sucrase continues and enzyme recoveries. Followed by the protein content in the measured samples of the Folin-phenol reagent method, micro Kjeldahl nitrogen method results were compared, which measured the total protein content than the former, and know with the purification of the enzyme, A, B, C, D4 samples purified coefficient increases, increased specific activity, the total enzyme activity, total protein and protein recovery is on the decline, wherein A is the highest protein content, D, the highest degree of purification. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel sample screening separation test brilliant blue staining, elution step measurement of protein molecules and dye migration distance Indirect determination of the relative molecular mass of sucrase get two the sucrase strip sucrase relative molecular mass, the calculated
Keywords: sucrase; extraction and purification; enzyme activity assay; Folin-phenol reagent; micro-Kjeldahl method; SDS-polyacrylamide gel
正文：
1、文献综述
1.1
蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖[1]。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
2、实验原理、材料和方法
2.1 蔗糖酶的提取及初步提纯
2.1.1实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。
2.1.2 试剂与器材
2.1.2.1试剂
①新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；
②醋酸钠（AR）；
③甲苯（AR）；
④4mol/L醋酸；
⑤95%乙醇（<-20℃）；
⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏
水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀
释10倍即得。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.1.2.2器材
①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；
②量筒10ml（×1）25ml（×1）;
③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；
④具塞试管10 ml（×3）；
⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；
⑥培养箱；
⑦恒温水浴箱；
⑧磁力搅拌器，搅拌子；
⑨高速冷冻离心机。
2.1.3操作方法
1．酵母的自溶：培养60小时
2．初提取液A
在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，经操作取上层液体记体积为VA=14.8ml。
3．热提取液B：V B=13.0ml。
4．乙醇沉淀提取液C
将热提取液B 倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加98%的冰乙醇，30min后继续搅拌5min，离心，平衡（用50%的乙醇，对方加），用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得Vc=5.0ml。
2.1.4结果与分析
2.1.4.1结果
表2-1
提取液颜色状态体积（ml）分析评价
A 棕黄色液体25.62 过大
B 橙黄色液体24.00
C 淡黄色液体 6.10 过小
V A总=V A=25.62ml
V B总=V B·[V A/(V A-3)]=24.0ml
V C总=V c·[V A/(V A-3)] ·[V B/(V B-3)]=V c·[V B总/(V B-3)]=6.1ml
2.1.4.2分析
在这次试验中，数据为初始数据，实验结果的真实可靠是以后实验的保障。我们的数据在A的时候偏大，C偏小，可能是因为我们离心过程的操作不是很正确，但是这不会影响到后续实验。
2.1.4.3结论
V A总=25.62ml ；V B总=24.0ml ；V C总=6.1ml。
2.1.5 注意事项
①第一次离心后取液体时要小心。重新离心后倒出液体留下固体。
②水浴时的温度不要超过50℃。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰
浴时要迅速操作。
③冰浴操作过程中加缓冲液使固体充分溶解，减少损失。
2.2 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法
2.2.1实验原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
2.2.2试剂与器材
2.2.2.1试剂
①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
②1mol/LNaCl的0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
③0.5mol/LNaOH；
④Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.2.2.2器材
①层析柱；
②梯度混合器;
③磁力搅拌器，搅拌子；
④紫外分光光度计；
⑤点滴板；
⑥尿糖试纸、擦镜纸；
⑦止水夹；
⑧烧杯、试管。
2.2.3操作方法
1．离子交换柱的填充
将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。
2．缓冲液盐度梯度发生器的安装
在低浓度一段装入搅拌子。且要形成梯度。
3．柱的平衡
将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4．加样
缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一
5．洗脱
为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。
6．测OD值
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下：表2-2
试管号OD值试管号OD值
1 0.630 13 0.528
2 0.237 14 0.551
3 0.145 15 0.198
4 0.16
5 1
6 0.094
5 0.121 17 0.174
6 0.114 18 0.174
7 0.066 19 0.099
8 0.049 20 0.041
9 0.082 21 0.051
10 0.169 22 0.006
11 0.350 23 0.012
12 0.431
7．酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取13 、
14、19管进行测试。
酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
将其合并成一管，V D=5.6ml
2.2.4结果与分析
2.2.4.1结果
V D =5.6ml
V D总=V D·V C总/V样=5.6×6.1/0.5=68.32ml。
由数据得表如下：
0.10.20.30.40.5
0.60.71
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
试管号
O D 值
系列1系列2
图2-1 Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
2.2.4.2分析
先用25mlTris-HCl 洗穿透锋，得到8只试管。但是如果在用量筒接的时候每管不是3ml ，那么也许就没有8只了，这是实验的大忌。会造成很大的误差，用梯度洗脱时，测得的OD 值会成波动形式，而不是直线上升或者直线下降。
如果上提取液c 中的酶浓度不够高，也可能导致提纯酶浓度不够高，以后在检验活力的时候会发现D 根本就没有酶活力，于是实验重做，我们在做这个实验的时候应该想到各种情况带来的实验误差。
在收集D 时，我们不小心到出了些，考虑到 可能不够用，所以多取了一试管的D 液。
在使用Q-Sepharose 纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAE Sepharose 层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose 纯化方法有如下特点： (1) 提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。
(2) 缩短实验时间。梯度洗脱时间由原来的100min 缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。 (3) 节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH 改变,不能承受0.1M 以上NaOH 清洗,重生效果差,寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH 的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。
2.2.4.3结论
V D 5.6ml
V D 总 =68.32ml 。
2.2.5注意
①在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。当液面低
于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果。
②加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯。
③恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下
滴过快而引起干柱。是绝对不能干柱。
2.3 蔗糖酶活力的测定
2.3.1实验原理
本实验用DNS法测还原糖的含量，进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。
酶活力单位数（U）：在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。
总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*(试管溶液总体积/2)*V总*n V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=（各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活）*100%
2.3.2试剂与器材
2.3.2.1试剂
①3,5-二硝基水杨酸
（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
（2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7~10天后使用。
②葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml）准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先
在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；
③0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml
的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L；
①5%蔗糖用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置；
②2mol/L NaOH 溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。
2.3.2.2器材
①电炉；
②恒温水浴;
③紫外分光光度计；
④试管、吸管；
2.3.3操作方法
1．葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。
表2-3 葡萄糖标准曲线的制作
试管号0 1 2 3 4 5
葡萄糖0.0 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
蒸馏水 3.0 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 DNS 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
总体积 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 OD 0.000 0.121 0.236 0.359 0.482 0.599 2．酶活力测定
①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：
200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：20）。
②取8支试管，按表3-2加入各种试剂。
表2-4 酶的催化反应
项目A（1：200）B(1:200) C（1：200）D（1：20）
加样A对A样B对B样C对C样D对D样
酶液/ml 2 2 2 2 2 2 2 2
2N NaOH 0.5 —0.5 —0.5 —0.5 —
35℃预热10min，同时预热5%蔗糖
5%蔗糖 2 2 2 2 2 2 2 2
立即摇匀，准确计时，反应3min
2N NaOH —0.5 —0.5 —0.5 —0.5
总体积/ml 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
③取反应液A 0.25ml，B 0.25ml，C 0.20ml，D 0.3ml进行DNS反应，
测定540nm处OD值。
得到OD
A =0.193 OD
B
=0.161 OD
C
=0.306 OD
D
=0.284
2.3.4结果与分析
2.3.4.1结果
①绘制葡萄糖标准曲线
图2-2
总活力单位数=mg/V 测·4.5/2·V 总·n
酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A 的总酶活）·100%
本次试验最终结果：表2-5
2.3.4.2分析
本次实验基本还算成功，葡萄糖标准曲线的线性较好，乙醇提取液C 的回收率较低，可能实验操作带来的误差。本次试验的计算公式有严格的要求，经过反复演
算方才能得出实验结果。 实验公式可以改为：总活力单位数=mg/V 测*4.5/V 配*V 总/V 取 其中，V 取 表示稀释时的取样数 V 配 表示稀释后的毫升数
这是第一次用办公软件处理数据，感到很新鲜，也意识到计算机在科学研究中的重要性。
2.3.5注意
①做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。要求测得的OD
值在0.1~0.7
②测定酶活力时，要准确反应3min ，这个反应时间应该精确把握，不要
项目 初提液A
热提取液B
乙醇提取液C
柱分离液D
V 测/ml 0.25 0.25 0.2 0.3 mg 0.185 0.174 0.222 0.215 V 总/ml
25.62
24
6.1
68.32
总活力单位数/U 8531.46 7516.8 3046.95 2203.32 回收率/%
100
88.1
35.7
25.8
多1秒也不要少1秒
③测得在线性范围外的OD值，需重新配液显色反应。
2.4 蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算
2.4.1实验原理
比活力是指单位质量（mg）蛋白质中酶的含量（U），常用来表示酶的纯度。
比活力=酶的含量（U）/蛋白质含量（mg）
测定蛋白质含量的方法有福林-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、考马斯亮法等，本实验采用的是福林-酚试剂法，或称Lowry法，蛋白质与Folin-酚A试剂（碱性）在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物，然后加入Folin-酚B（酸性），铜-蛋白质复合物将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。因为Folin-酚B 中的磷钼酸-磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物。蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的吸光值。故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值，然后据此测出未知样品的蛋白质浓度[5]。
2.4.2试剂与器材
2.4.2.1 试剂
①试剂A（碱性铜试剂）取Na2CO3（AR）10g和NaOH（AR）2g，加蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠（Na2C2H3O3?2H2O，AR）0.1g和CuSO4?5H2O （AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至100ml，即为试剂A。该试剂为含10% Na2CO3，0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料试剂瓶中，24℃至少可使用1个月。溶解于500毫升蒸馏水中。；
②试剂B（酚试剂）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。
③标准浓度牛血清白蛋白溶液（200μg/ml）精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。；
2.4.2.2器材
①分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；
②刻度吸管0.5ml（×1），2ml（×1），5ml（×1）;
③试管1.5 cm×15cm（×8）；
④具塞试管10 ml（×3）；
⑤恒温水浴箱（55℃）；
2.4.3 操作方法
1．标准曲线的制作
表2-6 标准曲线的配置加样表
管号0 1 2 3 4 5 BSA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
水 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5
试剂A 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
静置10min（立即充分混匀）
试剂B 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
静置10min（立即充分混匀）
试剂B 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
混匀55℃水域5min,测A660
OD600 0.000 0.191 0.346 0.502 0.646 0.789
2.未知蛋白浓度的测定
按A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）进行稀释，A稀释液去0.4ml，B、C、D稀释液各取5ml测定OD
660
(所得数据如上表所示)。
【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定，而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚B试剂加入后，应迅速摇匀（加一管，摇一管），使还原反应产生在试剂被破坏之前。
2.4.4结果与分析
2.4.4.1结果
表2-7实验结果数据记录表
标准牛血清蛋白（ml) 标准牛血清蛋白
(μg) OD660
0.2 40 0.191
0.4 80 0.346
0.6 120 0.502
0.8 160 0.646
1 200 0.789
样品A1 B1 C1 D1 OD660 0.412 0.303 0.277 0.156
图2-3
表2-8实验处理结果总汇表
总体积/ml 总酶活/u 总蛋
白/mg
比活力
/u/mg
蛋白回
收率/%
酶活回
收率/%
纯化倍
数/倍
初提取
液A
25.62 8531.46 506.87 16.83 100 100 1.00
热提取
液B
24 7516.8 333.41 22.54 65.9 88.1 1.339
乙醇提
取液C
6.1 3046.95 9.52 320.06 1.87 35.7 19.02
柱分离
液D
68.32 2203.22 0.81 2720.14 0.16 25.8 161.61
2.4.4.2分析
此实验标准曲线线性较好，从纯化倍数来看，A与B似乎没有进行提纯，而C与D都大大的增加。但是就蛋白质的回收率来看几乎为0，由此可见蛋白质的回收与总酶活之间没有绝对的联系，可能回收的蛋白质不一定都是具有酶活的。这也证明了蛋白质的多样性。
此次方法的优点是操作简单，灵敏度高；缺点是蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格，而且不同的蛋白质会因Tyr和Trp的含量不同，造成显色程度有差异。
2.4.5注意
①试剂A加完后，立即充分混匀，静置10min。再向各管加B后放置10min，
再加第二次。
②每次加A、B后应立即迅速充分混合。
2.5微量凯氏测总蛋白
2.5.1实验原理
凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首创，是一种元素分析方法。根据取样量分类，可以分为常量和微量。
而不同蛋白质中含氮量平均16%，凯式定氮仪测定含氮量，然后乘以蛋白质
换算系数6.25，得到蛋白质含量。N / 16% = N × 6.25 = 蛋白质含量
实验共需消化、蒸馏、滴定3个步骤，其中消化是为了将有机氮转化为无机氮，
然后在碱性条件下蒸馏，让无机氮转化成氨气出来，用硼酸试剂吸收，最后用盐
酸滴定。滴定指示剂在碱性条件下是绿色，当溶液由绿色--灰色--红色时可认为
是滴定完全。
NH2CH2COOH + H2SO4 → 2 CO2 + 3 SO2 + H2O + NH3
2 NH
3 + H2 SO
4 →（NH4）2 SO4
（NH4）2 SO4 + Na OH → Na 2 SO4 + 2 H2O + 2 NH3
2 NH
3 +
4 H3BO3 →（NH4）2B4O7 + 5H2O （NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O → 2NH4Cl + 4H3BO3
2.5.2试剂与仪器
2.5.2.1试剂
①蛋白样品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100ml；
②浓硫酸；
③硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量分数）混合研磨成粉末；
④30%NaOH溶液:30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml；
⑤2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100ml；
⑥混合指示剂：0．1％甲基红酒精溶液和0．1％甲基蓝酒精溶液临时
按2:1的比例混合。或0．1％甲基红酒精溶液和0．1％溴甲酚绿酒
精溶液临时按1:5的比例混合
2.5.2.2器材
①改良式凯氏定氮仪；
②克氏烧瓶50ml（×2）;
③移液管；
④锥形瓶50ml（×3）；
⑤吸球、玻棒、滴管、量筒；
2.5.3操作方法
1．消化
凯氏瓶内加入A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化剂，消化至淡绿色，定容至50ml。
2.洗涤定氮仪
实际操作时，观察到随着锥形瓶内水量增多，指示剂变棕红色。
第三次洗涤后，指示剂不变色。
3．蒸馏
实际操作时，在加反应液后，反应室内液体变成棕黑色，液体反应剧烈。
指示剂有红色变成棕色，最后变成绿色。
4．滴定
用0.01N HCl将锥形瓶中的指示剂滴定至淡紫色，记录消耗HCl的量。
2.5.4结果与分析
2.5.4.1结果
表2-9
次数 1 2 3
HCl消耗量/ml 0.26 0.26 0.28
HCl消耗量（同组）/ml 0.26 0.27
样品含氮量=(A-B) ×N=84.1mg/ml
样品含蛋白质量=525.6502mg/ml
2.5.4.2分析
本次实验是两组合作共同完成，同组者由于实验失误，只有两组数据，但是他们的数据与我们的非常接近，说明本次试验我们组实验做得很好。
本次试验与上次实验测定的结果由较大的出入，其影响结果的主要因素有：1.收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸PH影响较大；2.蒸汽洗涤时间不够长也可以大致实验结果偏大；3.最后滴定过程中，滴定操作的标准与否也对实验的结果影响较大。
该实验仅用到的是热提取液B，这是因为A里面的蛋白质含量太高了，微量法测出来的误差大，而样品C、D中均有Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液是含有氮元素的。微量凯氏定氮仪测蛋白质法比福林-酚法操作复杂，但干扰小，精密，精确，只是灵敏度差了，只适用于0.05--3.0mg。
2.5.4.3结论
样品含氮量=84.1mg/ml
样品含蛋白质量=525.6502mg/ml
2.5.5注意
常量凯氏定氮法测总蛋白氮时可用强酸，微量凯氏定氮法测总蛋白氮必须用弱酸。
2.6 SAS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量
2.6.1实验原理
电泳是指溶液中带点粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象。蛋白质的电泳迁移率主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶孔径大小可通过改变Acr和Bis浓度来调节。浓度越大，孔径越小，颗粒穿过网孔的阻力越大，反之亦然。网孔大小根据所分离物的分子量的大小来选择。本实验选择分离胶浓度12%。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续的凝胶电泳两类。
不连续凝胶电泳有三大效应：
（1）浓缩效应：①两层凝胶的孔径不同（孔径的不连续性）；
②缓冲液与凝胶离子成分和pH不同（缓冲系统的不连续性）（2）分子筛效应：颗粒小，圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大，形状不规则的分子阻力较大，移动较慢。
（3）电荷效应：大部分蛋白质在pH8.3带负电，电荷多迁移快
SDS即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂。它可以破坏蛋白质分子之间的非共价键，形成带大量负电荷的蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧失了原有的
电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷的差异；引起蛋白质分子构象的改变。
2.6.2试剂与器材
2.6.2.1试剂
①30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，
先用80ml双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水稀释至100ml，过滤。用棕色瓶中，4℃保存一个月。
②10%的TEMED；
③10%过硫酸铵（AP）：现用现配。；
④分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tris 9.08g
溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH8.8，用双蒸水定容至50mL，4℃保存；
⑤浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g
溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH6.8，用双蒸水定容至50mL，4℃保存；
⑥2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，
pH6.8）+4ml10%SDS+1ml巯基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(质量浓度)溴酚蓝，加双蒸水定容至10mL，4℃保存。
⑦SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，
pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml双蒸水中，加入50ml 10%(质量分数)SDS贮存液，加双蒸水定容至1000mL则成5×SDS-电极缓冲液。
⑧10%SDS：25gSDS用双蒸水定容至250mL，室温保存。
⑨染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL 冰乙酸，用滤纸过滤。
2.6.2.2器材
①垂直板型电泳槽；②玻璃板; ③大培养皿；④烧杯；吸量管；滴管
2.6.3 操作方法
1．分离酸制备
装配制胶工具，按表比例配制分离胶，小心加满水，待聚合好后，倾去水，用滤纸片吸干胶面。
2.浓缩胶制备
按表配置浓缩胶，迅速混匀，倒在分离胶上层，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用滤纸片去除齿孔中的气泡。
3.加样
取100μL样品与100μL样品缓冲液混合，沸水浴3-5min，取20μL 各样品加入齿孔中，加一孔Marker，将电极缓冲液倒入电泳槽。
4.电泳
调节电流，电泳至溴酚蓝距酸前沿1.5cm左右，停止电泳。
5.染色和脱色
小心取出凝胶，置于平皿中，加染色液中过夜，用脱色液脱色，换两次脱色液，至背景透明。
6．计算样品相对分子质量。
2.6.4结果与分析
2.6.4.1 结果
表2-10 蛋白质分子
迁移距离/cm 染料迁移距离/cm 相对迁移率
标准蛋白分
子量
标准蛋白分子量的对数 3.00 5.3 0.566 14400 4.158362492 2.25 5.3 0.425 20100 4.303196057 1.42 5.3 0.268 31000 4.491361694 0.93 5.3 0.175 43000 4.633468456 0.30 5.3 0.057 66200 4.820857989
标准蛋白质分子迁移数据表
图2-4电泳标准曲线图
由电泳迁移率图得到蛋白质相对分子质量： 表 2-11
样品 蛋白质分子迁移率/cm 染料迁移距
离/cm
相对迁移率
蛋白质分子量对数 蛋白质分子量
B 1.08 5.3 0.204 4.604 40152.208 B 0.69 5.3 0.130 4.699 50012.144 B 0.40 5.3 0.075 4.770 58882.831 B 0.25 5.3 0.047 4.807 64071.947
C 0.65 5.3 0.123 4.709 51151.292 C 0.30 5.3 0.057 4.794 62293.325
D 1.15 5.3 0.217 4.587 38600.458 D 0.72 5.3 0.136 4.692 49174.463 D 0.27 5.3 0.051
4.802 63354.484
样品蛋白质分子迁移数据及分子量表
实际试验图：图2-5
2.6.4.2分析
该试验比较复杂，在操作过程上必须依靠两个人合力才能完成，所以在分析实验结果误差的时候可能有很多因素，这里只分析一些主要的：1.配置凝胶过程中加样是否合理，在加样之后应该立即搅拌均匀，如果没有搅拌均匀的话会导致凝胶密度不均，从而电泳过程就不能很好进行，实验必然失败；2.染色后是要进行脱色的，这会影响对实验结果的观察判断；3.凝胶不能用手使劲拿捏，不然以后测量的蛋白质电泳位移无法测量导致实验失败。
因为R^2=0.9913，远小于1，所以此次实验结果的曲线线性程度低，回归系数小，原因分析：染色液和洗脱液未及时更换，使得凝胶颜色很深，测量时误差较大；电泳时染料距凝胶底部不到0.5cm,使得染色洗脱时染料与蛋白质分子未完全分开，导致有的条带很少甚至没有条带；浓缩胶不够浓等。
2.6.4.3 结论
电泳迁移率图得到蛋白质相对分子质量。如上表所示。
2.6.5注意
①N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时
应避免其直
接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。
②凝胶模的装配也起到相当重要的作用。保证玻璃板的干净、干燥。
③配置分离胶和浓缩胶时，最后加TEMED。混合后迅速加入玻璃槽中。
参考文献：
[1]庄苏星,丁益；《酵母蔗糖酶的提取方法李楠》；南京大学生命科学学院；医药
生物技术国家重点实验室,江苏南京210093)
[2]许培雅, 邱乐泉;《离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究》；(浙江工业大学生物与环境工程学院
[3]孙培龙，吴石金；《生物化学实验技术指导》；化学工业出版社
生物化学实验报告
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
酵母蔗糖酶的提取工艺
酵母蔗糖酶的提取工艺 摘要 蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。 采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。 蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述
生物化学实验内容
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
【免费下载】生物化学实验示范报告 蔗糖酶的提取与纯化正确
生物化学实验示范报告: 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的: 1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离 提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉 淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶 蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质 的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置； 9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
实验3 酵母蔗糖酶的制备
实验3 酵母蔗糖酶的制备 一、实验目的 1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶 2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量 二、实验原理 酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。 三、实验器材 1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。 2、材料：啤酒酵母、 3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。 四、实验步骤 1 研磨水提取 (1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。 (2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。 (3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。 (4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。 (5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。 (6) 将上清液转入量筒，量出体积。用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。 2 热处理和乙醇沉淀 (1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
酵母蔗糖酶提取方法的研究
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
蔗糖酶的提取分离
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生化大实验实验报告材料
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
生物化学实验内容
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
酵母蔗糖酶的固定化
酵母蔗糖酶的固定化 实验三酵母蔗糖酶的固定化 一、实验原理 1.固定化酶 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。 2.酶活测定 蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。二、实验材料、仪器和试剂 1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液 2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等 3.试剂
(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 (2)10%蔗糖溶液 (3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液 (4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至 100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液 三、实验步骤 1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联 (1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。 (2)称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。 1 (3)将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。 注意:为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。 (4)壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。 2.固定化酶的制备 (1)将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。
生物化学实验内容
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生化实验报告模版
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究
论文 论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 作者姓名周柱林 指导教师钟莉 学科专业食品科学与工程1102 所在学院生物与环境工程学院 提交日期 2013年12月
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 周柱林 生物与环境工程学院食品科学与工程1102班 摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用Q Sepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660. 关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量 1.前言（文献综述）： 啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β -D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。 目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多 , 有SDS抽提法，正交法等等，其中以甲苯自溶法最为常见。本实验采用此自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，利用有机溶剂将胞内蔗糖酶释放，经过初提取的离心去杂和等电位沉淀，制得的粗酶经醇沉后，采用Q Sepharose-柱层析法纯化，利用DNS法测定其酶活力，利用Folin-酚法测定蛋白质的含量及比活力，利用微量凯氏定氮法测总蛋白氮，以及用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究，也为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的技术开发提供了实验依据。