实验一：米氏常数的测定

双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数

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【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法

【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：

[][]

S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]

S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。 过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的，因此也称为辣根过氧化物酶（horseradish

peroxidase, HRP ）。HRP 属于含血红素蛋白的一种，是由辅基——氯化血红素（铁卟啉）和脱辅基蛋白（糖蛋白）组成，分子量为44000。

HRP 是双底物酶（过氧化氢+多元酚或胺类底物），为求其对某一底物的K m ，通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量，即可把该酶促反应当作单底物反应来处理。本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB ）作为氢受体，它可被Hb 催化过氧化氢氧化生成有色产物，该产物在反应条件下（pH5-7左右）为蓝色物质（λmax =650 nm ）。实验中我们使TMB 的浓度大过量，测定HRP 对H 2O 2的K m 值（反之亦可测定HRP 对TMB 的K m 值）。

【实验仪器及试剂】

仪器：日立 UV-3010紫外可见分光光度计；石英比色皿（1 cm ）：2只；100 μL 微量取样器1支（枪头若干）；1 mL 取液器一支；电磁搅拌器1台（1 cm 聚四氟乙烯搅拌子1个 ）

试剂：过氧化物酶（HRP 溶液： mol/L ；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB ）： mol/L （DMSO 溶液）；H 2O 2溶液： mol/L ；磷酸缓冲液（PBS ）：pH= ； mol/L

【实验步骤】

在1 cm的比色皿（内置搅拌子）中加入1.7 mL PBS，然后在搅拌下，依次加入100 μL HRP、TMB和不同量的H2O2溶液，马上移入样品架，记录650 nm处吸收峰强度随时间变化的曲线。（参比：1.7 mL PBS+100 μL HRP+100 μL TMB）

【数据记录与处理】

温度：______

【注意事项】

H2O2应该配置成不同浓度，加入相同体积为佳，但是由于动力学测定本身误差较大，且H2O2本身体积所占比例不大，故采取上述步骤。

【思考题】

1. 可查阅天然的过氧化物酶对H2O2的K m并与测定值进行比较

2. 初速率的测定应注意什么问题？本实验中初速率的单位为A（吸光度）/s（秒）与米氏方程中的单位并不相同，为什么不影响k m的测定？如需测定V max，应如何进行？