产酸性果胶酶菌株的筛选及产酶条件的研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。
纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。
微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。
细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。
但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。
我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。
鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。
１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。
1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。
1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种得性能就是最重要得因素。
(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(２)从大自然中采集样品分离;(3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。
(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(１)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。
酶的生产和利用
酶的生产和利用一、微生物酶制剂的生产主要有以下步骤：1、目的酶生产菌株的分离筛选（1）从自然界分离筛选（2）用物理、化学因子处理诱变（3）用基因重组或细胞融合技术选育2、酶的生产（1）要选择好的培养方法，包括培养基组成配比、培养温度、pH 值、通气量等。
图:微生物在相当于三层楼高的发酵罐里生长繁殖，产生所需的酶（2）确定工业规模大量生产的一系列工程和工艺条件，以及培养罐的形式、大小、通气条件、温度和pH 值的控制等。
图：通过改变培养基类型、酸碱度、氧气浓度和温度，研究人员现了生产某种酶的微生物的最佳生长条件。
三、酶的提取、分离和纯化1、微生物酶制剂的工业提取步骤大致如下：如果是胞内酶，则首先要分离收集其菌体，使之破碎，将酶提取至液相中，此为出发酶液；如果是胞外酶，它的深层发酵液或固体培养物的抽提液则为出发酶液。
2、制取工业酶制剂的步骤：第一步——除去出发酶液中的悬浮固形物，获得澄清酶液，必要时再进行减压浓缩；第二步——根据质量要求和经济性采用适当方法（如用盐析法、有机溶剂沉淀法、丹宁沉淀法等）将酶沉淀分离；图：只有酶和水能通过转鼓式过滤机；培养基和微生物则被留在硅藻土上。
第三步——收集沉淀、干燥、研粉、加适当的稳定剂、填充剂、做成粉末制剂。
••酶粒是在大型连续运转的水平混合机内生产出来的。
提取的酶与盐、纤维素及其他成分混合形成0.5mm大小的粒状物。
然后用一种聚合体包裹，以防止酶尘在使用过程中可能引起的致敏危险。
图:用多聚体包裹酶以减少酶尘引起的致敏危险。
3、其他方法对于质量要求高可提取液中共存有妨碍目的酶工艺效果的其他酶时，常用一些特殊纯化方法将目的酶与其他酶和杂蛋分开，再分别沉淀制取。
常用的方法有：（ 1 ）蛋白质选择性变性法（ 2 ）分级盐析法•有机溶剂分级沉淀法•等电点法•柱层析法•电泳法•亲和层析法四、酶的化学修饰技术1、金属离子置换修饰2、大分子结合修饰3、肽链有限水解修饰4、侧链修饰图：微生物的基因经修饰能够产生所需的酶五、固定化酶和固定化细胞固定化酶是通过物理或化学的处理，使水溶性酶和固态的水不溶支持物（载体）相结合或被载体包埋，但仍保留酶活力。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。
常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。
2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。
3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。
二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。
常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。
2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。
3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。
三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。
2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。
3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。
4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。
综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。
通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。
果胶酶简介
酶的性质
Ce—lestino等 纯化了Acrophialophora nainiana 所产胞外果胶酶，纯化酶经SDS．PAGE和质谱 得到分子量分别为35．5 kD和30．749 kD，最适 温度和pH分别为60℃ 和8．0，Km值为4．22 mg ／mL，能被L一色氨酸、DEPC、DTT、DTNB、 DTP、L．半胱氨酸、B-巯基乙醇激活，却被NBS、 Fe“ 、Cu“ 、Zn“ 、Mn“ 、A1“ 、Ca“抑制，其N端 氨基酸序列分别与来自Bacilluslicheniformis和 Xanthomonas campestris的果胶盐裂解酶有66和 68％的相似性。Lei等 研究发现固定化果胶酶和 未固定化酶的最适温度和pH相同，分别均为65℃ 和6．0。
3、固定化细胞法
果胶酶的分离纯化
常采用的分离纯化和鉴定方法 超滤、硫酸铵沉淀、离子交换层析 凝胶过滤层析、亲和层析 聚丙烯酰胺凝胶电泳、等点聚焦
（1）酸铵沉淀、DEAE．纤维素和G100凝胶过滤层析对 Aspergillusflavu, MTCC 7589所产碱性果胶裂解酶进行了分离纯化，
经SDS-PAGE显示为单一条带
果胶酶的分布
主要以曲霉和杆菌为主 包括：白绢菌 、立枯丝核菌 微小毛霉 、高大毛霉 、匐枝根霉 黑曲霉（市场上） 源于细菌杆菌属的碱性果胶酶 日益受到重视，人们常利用基因克 隆技术实现果胶酶微生物宿主的表达
发酵产酶
1、液态发酵法。 2、 固态发酵法（采用葡萄皮渣为基质
，接种一定数量Aspergillus awamori 2B．361 U2／1经固态发酵生产外切 聚半乳糖醛酸酶）
。
Байду номын сангаас
（2）纯化酶的最适温度和pH分别为50℃ 和8．0，Km
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。
一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验内容实验一工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。
1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。
1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。
实验三微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。
1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。
三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。
2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。
论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。
四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。
2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。
成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。
3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。
微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。
没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。
高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究的开题报告
高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究的开题报告
一、选题背景及意义
脂肪酶作为一种广泛存在于细菌、真菌和动植物中的酶类，在脂肪水解、饮食营养、生物转化等方面具有重要的作用。
因此，筛选高产脂肪酶的菌株具有重要的研究意义。
目前，虽然已有许多脂肪酶菌株被发现，但其产酶能力参差不齐，产酶量较少，对于一些实际应用仍然存在着不足。
因此，筛选高产脂肪酶的菌株并进行酶学性质的研究，对于进一步了解脂肪酶的生产和应用具有重大意义。
二、研究内容
1.从自然界中筛选高产脂肪酶的菌株，利用液体发酵和固体发酵技术进行发酵，并对产酶量进行分析和比较；
2.对高产脂肪酶菌株的生长条件进行研究，包括温度、pH值、培养基成分等因素对其生长和产酶能力的影响；
3.从高产脂肪酶菌株的菌体中提取酶液，进行酶学性质的研究，包括酶的催化性质、热稳定性、抗离子等性质的分析和比较；
4.开展脂肪酶的应用研究，包括对脂肪水解和饮食营养的实际应用研究。
三、研究方法和步骤
1.从自然界中筛选高产脂肪酶的菌株，采用液体和固体发酵技术进行发酵，并对产酶量进行分析和比较；
2.对高产脂肪酶菌株的生长条件进行研究，包括温度、pH值、培养基成分等因素对其生长和产酶能力的影响；
3.从高产脂肪酶菌株的菌体中提取酶液，进行酶学性质的研究，包括酶的催化性质、热稳定性、抗离子等性质的分析和比较；
4.开展脂肪酶的应用研究，包括对脂肪水解和饮食营养的实际应用研究。
四、预期研究结果和意义
通过筛选高产脂肪酶的菌株，并研究其生长条件和酶学性质，有望发现一些具有高产酶量、高催化效率、热稳定性好等优良性状的脂肪酶菌株。
这些研究成果将有助于推进脂肪酶的生产和应用，为提高脂肪水解和饮食营养等方面做出贡献。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求（一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定:生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种的性能是最重要的因素。
（二）、微生物工业对菌种的要求是：(1)菌株高产,在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力；（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物；（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力；（4)能够高效地将原理转化为产品;（5）能利用广泛的原材料,并对发酵原料成分的波动敏感性小；（6)对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用；（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;（8)具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性,二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2)从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
(二)微生物工业菌种的分离1、野生菌株的分离、筛选过程（1)新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下:标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中,雨量不多的秋初为好.采土方式：在选好适当地点后,用小铲子除去表土，取离地面5—15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
②标本预处理④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种.还要对菌种进行发酵性能测定，⑥毒性试验:据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
产脂肪酶菌株的筛选、鉴定以及酶学性质的研究
产脂肪酶菌株的筛选、鉴定以及酶学性质的研究段盈伊;赵淑琴;韩生义;王琨;高兴富【摘要】[Objective] To screen and identify lipase producingstrain,determine the biology activity of the enzyme produced by the strain.[Method] Lipase producing microbial in oil-rich soil were cultured in neutral red oil medium with olive oil as the sole carbon source for initial screening,the improved copper soap-photometric method was used for secondary screening;the species of the lipase producing strain was identified by morphological observation,physiology biochemistry and 16S rDNA sequence analysis;activity of the lipase was determined by improved copper soap-photometric method.Effect of metal ion,organic solvent and surfactant was assayed on activity of lipase [Result] A lipase producing strain was screened,named as LZ-5.16S rDNA sequence analysis indicated that the strain belong to Staphylococcus epidermidis.The activity of lipase produced by the strain was 4.78 U/mL.The optimum pH and temperature of the lipase were 9.0 and 40 ℃.Lipase activity was stimulated byCa2+,Mg2+ and inhibited by Fe2+,Zn2+,EDTA,SDS,methyl alcohol and ethyl alcohol.The lipase showed better tolerance to glycerol,Na+,andK+.[Conclusion] The strain LZ-5 shows a better lipase activity.%[目的] 筛选高产脂肪酶菌株并鉴定其种属,研究脂肪酶的酶学性质.[方法] 以橄榄油为唯一碳源对富含油污土壤中产脂肪酶微生物进行富集培养,用中性红平板进行初筛,结合改进铜皂分光光度计法测定酶活力;对筛选的高产脂肪酶菌株进行形态学观察和相关生理生化实验,再结合16S rDNA序列分析确定其种属;确定该菌株所产脂肪酶的最适作用温度和pH值,并研究金属离子、有机溶剂以及表面活性剂对酶活的影响.[结果] 筛选得到一株高产脂肪酶菌株LZ-5,其所产脂肪酶的酶活力为4.78 U/mL;菌种鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis).该酶最适作用温度为40 ℃,最适pH值为9.0;Ca2+、Mg2+对酶活力有促进作用,Fe2+、Zn2+、EDTA、SDS、甲醇和乙醇对酶活力有抑制作用,对Na+、K+、丙三醇的耐受力较高.[结论] 成功分离一株表皮葡萄球菌高产脂肪酶菌株.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2017(052)002【总页数】7页(P146-151,160)【关键词】脂肪酶;筛选;鉴定;酶学性质【作者】段盈伊;赵淑琴;韩生义;王琨;高兴富【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q93-331脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一类可以在油水界面上高效的将三脂酰甘油酯酯键水解，释放脂肪酸和甘油的生物酶类，广泛存在于动物、植物各种组织及微生物中，是最早研究的酶类之一[1].脂肪酶最早是从动物中发现，1834年Eberl发现了兔胰脂肪酶，1864年发现了猪胰脂肪酶，1871年在植物种子中发现了脂肪酶.微生物脂肪酶直到1901年才被发现，当时的研究人员观察到粘质沙雷氏菌、绿脓假单胞菌及荧光假单胞菌能够产生脂肪酶[2].产脂肪酶微生物种类多、来源广、繁殖周期短，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等反应，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效性、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件[3]，比动物、植物脂肪酶具有更高的研究和开发利用价值.许多脂肪酶具有较宽的底物范围，因此它们被认为在进化过程中逐步形成了具备利用碳源的能力或与分解代谢途径有关[4]，这使得脂肪酶成为在许多工业加工过程中具有巨大潜力的生物催化剂，用于化学选择性、区位选择性和对映选择性的水解作用及一系列化合物的合成中，如食品调味料的合成，作为添加剂应用于洗涤剂中，并在造纸业和医药领域等相关行业具有多种工业应用价值，已成为人们普遍选择的生物催化剂之一[5].近年来随着非水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了油水界面上进行水解反应的范围，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、肽合成、生物能源的生产等方面，是继蛋白酶，淀粉酶之后上第三大工业用酶[6].目前研究发现，约有65个属的微生物可以产生脂肪酶，细菌28个属，酵母菌10个属，放线菌4个属，其它真菌23个属.微生物脂肪酶的研究主要集中于根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicilliffm)、毛霉属(Mucor)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)等具有工业应用价值的菌株[7].但实际上能产生脂肪酶的微生物菌种分布远不止这个数目[8]，对脂肪酶微生物资源的开发与利用，特别是低温、高温、动物肠道等一些极端环境中脂肪酶微生物资源具有重大开发潜力，因此在了解脂肪酶催化特性的基础上，筛选具有活力高、产量高等新特性的产脂肪酶菌种，并在获得产脂肪酶菌株后进一步探索其产酶的最适条件，如培养基的配方[9]、最适温度、最适pH值[10-12]等，可以使脂肪酶的应用范围得到进一步的拓展.1.1 试验材料1.1.1 样品在兰州市区餐馆、加油站周边采集被油脂污染的表层土壤样品20份.用灭菌袋子封存，分别编号LZ-1～20，带回实验室进行分离筛选.1.1.2 培养基富集培养基:蛋白胨1 g，葡萄糖1.5 g，牛肉膏0.5 g，NaCl 0.25 g，蒸馏水加至100 mL，pH值为7.5中性红油脂平板:蛋白胨5 g，牛肉膏2.5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液60 mL，NaCl 2.5 g，MgSO4 0.25 g，琼脂7.5～10 g，1.6%中性红溶液0.5 mL，蒸馏水加至500 mL，pH 7.0～7.5发酵培养基:蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液12 mL，NaCl 0.25 g，(NH4)2SO4 0.2 g，k2HPO4 0.1 g，MgS04 0.05 g，蒸馏水加至100 mL，pH值为7.0～7.5.1.1.3 试剂葡萄糖、乳糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、明胶、琼脂、橄榄油、聚乙烯醇、乙醚、95%乙醇、异辛烷及其他无机盐.1.2 试验方法1.2.1 高产脂肪酶菌株的初筛将采集的土样称1 g重悬于10 mL蒸馏水中，充分搅拌使其溶解，静置20 min，吸取上清液1 mL加入有100 mL细菌富集培养基的三角瓶中，32 ℃、180 r/min摇床发酵培养2 d.用灭菌水将富集培养液分别稀释至10-4、10-5、10-6倍，涂布于中性红油脂平板上，32 ℃培养2 d左右.选取有明显红色变色圈或透明圈的菌落作为目的菌株.1.2.2 高产脂肪酶菌株的复筛将初筛出目的菌株转接入发酵培养基，放入摇床，32 ℃、180 r/min培养5 d，使用改进铜皂-分光光度计法测酶活力[13].取试管加入2.5 mL缓冲液和2 mL乳化液在40 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入0.5 mL目的菌株的发酵培养液，继续水浴恒温反应15 min，用1 mL浓盐酸和6 mL 95%的酒精终止反应，再用3 mL异辛烷萃取试管内生成的脂肪酸，将上层清液吸出移至离心管，4 000 r/min离心1 min，使有机相和水相分离澄清.取1 mL 上层清液加入1 mL显色剂和4 mL异辛烷，用分光光度计在714 nm处测D值.空白对照组为先在0.5 mL预热的发酵培养液中加入1 mL浓盐酸和6 mL95%的乙醇，振荡混匀，再将预热的底物-缓冲液加入其中，40 ℃恒温反应15 min，其他后续操作相同.根据酶活计算公式X=(D试验-D对照) ×3/(tV×0.021 )(X为脂肪酶活力U/mL，t为作用时间min,V为酶液用量mL)，计算出酶活力，筛选出酶活力较高的菌株.1.2.3 目的菌株的形态学观察及生理生化试验将分离筛选出的目的菌株接种在LB 平板上，37 ℃培养1～2 d，观察菌落形态，挑取一环细菌材料用压片法进行革兰氏染色，镜检.通过多种糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇)、精氨酸水解试验、明胶液化试验、硝酸盐试验、触酶试验、吲哚试验、淀粉酶试验和柠檬酸盐试验测定其生理生化特性，并参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]的相关描述进行鉴定.1.2.4 目的菌株的分子学鉴定本试验采用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，首先提取目的菌株的基因组DNA作为模板，再用16S rDNA保守序列的通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)作为引物，进行PCR扩增[15]，扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃再延伸10 min.用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对 PCR 扩增产物进行胶回收，将回收产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序.将测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对，选取并下载相似性99%以上的序列，用Clustal W将目的序列和已下载的序列进行多序列比对，再用MEGA5.10构建系统发育树.1.2.5 目的菌株最适温度测定取试管加入缓冲液和乳化液分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入目的菌株的发酵培养液，恒温反应15 min，在714 nm处测得D值.计算出酶活力，并以在40 ℃、pH为7条件下测出的酶活为标准酶活计算出相对酶活，确定其最适反应温度.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行F检验.1.2.6 目的菌株最适pH值测定配置柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，按不同比例配成pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的缓冲液.配置巴比妥钠-盐酸缓冲液，按不同比例配成pH为7.0、8.0的缓冲液.配置碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，按不同比例配成pH为9.0、10.0、11.0的缓冲液.取试管加入不同pH缓冲液和乳化液在40 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入目的菌株的发酵培养液，恒温反应15 min，在714 nm处测得OD值.计算出酶活力，并以在40 ℃、pH为7条件下测出的酶活为标准酶活计算出相对酶活，确定其最适反应pH值.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行F检验.1.2.7 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响在有底物和缓冲液的试管中，先加入目的菌株发酵培养液，再分别加入终浓度为2 mmol/L的各种金属离子(Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Zn2+)测定其酶活力，再加入EDTA至最终浓度为2 mmol/L，测定其酶活力.再分别加入各种有机溶剂(甲醇、乙醇和丙三醇)至体积分数5%，测定其酶活力.再加入表面活性剂SDS至体积分数1%，测定其酶活力[16].以不加金属离子、有机溶剂和表面活性剂的菌株发酵培养液为对照组.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行t检验.2.1 菌株筛选通过初筛，分离筛选出5株在中性红油脂平板有变色圈或透明圈的菌株.再经过复筛测定它们水解甘油三酯的相对酶活力，其中编号为LZ-5菌株的酶活力较高，为4.78 U/ml.该菌株在中性红油脂平板上有明显的透明变色圈(图1).2.2 形态学鉴定菌株LZ-5在培养基上的菌落圆型，凸起，表面光滑或稍呈颗粒状，边缘完整.革兰氏染色后，镜检发现为阳性球菌(图2)，单个、成对排列形成不规则的堆团，染色均匀.2.3 生理生化试验结果生化试验(表1)表明，该菌株发酵葡萄糖，乳糖，麦芽糖产酸不产气，硝酸盐还原试验呈阳性，淀粉酶试验呈阴性，触酶试验呈阳性，吲哚试验呈阴性，能水解精氨酸，能液化明胶,不能利用柠檬酸盐作为碳源.2.4 分子学鉴定LZ-5菌株的16S rDNA测序结果表明其为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis strain，序列登陆号：KU950368)，BLAST比对结果表明与Staphylococcus epidermidis strain (CIFRIH-TSB-12-ZMA),Staphylococcus epidermidis strain M-T-MRS 62位于同一族群，16S rDNA序列相似性99%，系统进化树(图3)也支持了这一结论.2.5 脂肪酶最适温度环境在不同温度条件下测定该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，F检验的结果表明P<0.05，说明温度对相对酶活有显著性影响.发现该酶在30～45 ℃范围内活性较高，最适作用温度为40 ℃(图4).2.6 脂肪酶最适pH环境在不同pH值的缓冲液中测定该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，F检验的结果表明P<0.05，说明pH值对相对酶活有显著性影响.发现pH值为6.0～9.0的范围内酶活性较高，最适pH值为9.0(图5).2.7 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活的影响测定金属离子、有机溶剂和表面活性剂对该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，t检验的结果表明，Ca2+、Mg2+对酶活有较明显的激活作用；Na+对酶活有微弱的刺激作用；K+对酶活的刺激作用不显著；Fe2+，Zn2+对酶活有抑制作用；EDTA则使脂肪酶基本失活；脂肪酶对甲醇、乙醇耐受力较差，但对丙三醇的耐受力较高，而SDS也使脂肪酶基本失活(图6).初筛菌株选用的是中性红油脂平板，菌落产脂肪酶可利用作为碳源的橄榄油底物生长并且水解其产生脂肪酸，使菌落周围变为酸性环境，中性红指示剂显深红色，从而在菌落周围形成红色透明圈.通过这种方法筛选目的菌株灵敏度高且操作以及观察起来较方便.在以橄榄油为底物的脂肪酶酶活检测方法中，主要是通过检测脂肪酸的生成速度来测定酶活，用铜离子对萃取出的脂肪酸显色测定脂肪酶活力的方法，避免了直接酸碱滴定法中缓冲液的缓冲性和乳液对滴定结果的影响，并在改进方法中采用无毒的异辛烷代替苯萃取乳液中的脂肪酸，由于该方法的测定不受反应体系的缓冲溶液的影响，测得的酶活力曲线更准确.改进的铜皂法具有毒性小、结果稳定、重复性好的优点.最终筛选到的产脂肪酶菌株LZ-5，经形态学观察，生理生化试验，16S rDNA分子鉴定，证实为表皮葡萄球菌.细菌类产脂肪酶的菌属种类较多，主要分为两大类：革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌.革兰氏阳性菌包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、微球菌属等，革兰氏阴性菌包括假单胞菌属、气单胞菌属等.葡萄球菌是人和动物的临床条件致病菌，目前为止，已有来自10种不同葡萄球菌种的13个胞外脂肪酶在基因水平上得到了鉴定，其中3个分离自表皮葡萄球菌，2个分离自金黄色葡萄球菌，各1个分别来自其他葡萄球菌.大多数细菌脂肪酶最适作用温度和pH范围分别为35～45 ℃和8.0～9.0，个别如洋葱伯克霍尔德菌ZYB002最适温度达65 ℃.而葡萄球菌脂肪酶最适pH高达10.0，在30～60 ℃和pH 4.0～10.0之间，具有较好的稳定性，体现其较好的耐碱性.不同细菌脂肪酶底物特异性不同，如Burkholderia cepacia对中短碳链脂肪酸(C8～C12)有特异性，而Staphylococcus epidermidis则对长链脂肪酸(C18：0)有特异性[17].表皮葡萄球菌作为近年来发现的产脂肪酶菌种，为皮肤表面条件性致病菌株来研究较多.筛选出的表皮葡萄球菌在脂肪酶研究方面具有一定的价值.表皮葡萄球菌脂肪酶具有的水解酯类特性使得其能够作为酶添加剂应用于洗涤剂中.酶添加剂相比传统合成洗涤剂，其优势在于酶能够在更广的温度范围下催化油脂的分解，除此之外还减少了对环境的污染[18].而且在造纸业中，在纤维素酶和木质纤维素酶的辅助作用下，用脂肪酶处理纸浆能够去除树脂和蜡等物质，避免纸张严重破裂，不仅减少了处理树脂所需要的化学品的用量，还能够保持纸的质量和产量[19].另外每年由于各种原因排入海中的石油达200万t，如不及时处理，不仅会造成鱼类的大量死亡，而且石油中的有害物质也会通过食物链进人人体.这时用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石油，可以将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良的养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达到快速降解石油的目的.脂肪酶生物技术应用于被污染环境的修复以及废物处理是一个新兴的领域，还需要进一步研究和开发.【相关文献】[1] Qu Yen D T,Sshimdt-Dannert C,Sxhmid R D.High-level expression of a lipase from Bacillus 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