细胞移植治疗椎间盘退行性变研究进展

细胞移植治疗椎间盘退行性变研究进展张琦钱济先摘要目前认为椎间盘退行性变是引起腰背痛的主要原因，也是骨科治疗的难点。临床上常采用椎管减压、腰椎融合或单纯髓核摘除手术治疗，可纠正脊柱不稳，改善临床症状，但无法使退变的椎间盘恢复正常的生理功能。应用细胞疗法治疗椎问盘退行性变，近年已成为生物学治疗领域的热点。多项研究显示，将自体椎间盘细胞或问充质干细胞作为种子细胞植入退变的椎闻盘中，可有效地补充细胞数量，增加细胞外基质含量，从而延缓椎间盘退变进程，甚至修复受损的椎间盘。关键词椎间盘退行性变；细胞移植；髓核细胞；间充质干细胞；细胞支架；椎问盘重建Ｄ讲：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｒＬ１６７３－７０８３．２０１０。０１．０１３

临床普遍认为，椎间盘退行性变（ｍＤ）是引起一系列脊柱力学功能紊乱和腰背部肌肉疼痛的源头。目前针对椎间盘突出的治疗大致分为非手术疗法和手术疗法，但手术疗法中无论是脊柱融合还是非融合技术，均只能部分缓解临床症状，无法逆转椎间盘退变进程，更无法从根本上重塑椎问盘的解剖结构和生理功能。随着对ＩＤＤ病理过程和分子机制的深入研究，应用生物学方法干预椎间盘退变进程，已成为治愈该疾病的新思路。目前相关研究主要集中在以下几个方向：①活性物质途径：直接向椎间盘内注射某种生物活性物质，如生长因子、细胞因子、基质合成代谢相关酶类等，以促进细胞外基质合成；②基因治疗途径：对椎间盘细胞进行相关基因转染，使某种活性蛋白持续高表达，以达到补充椎间盘髓核基质的目的；③细胞移植途径：包括自体椎间盘细胞移植和间充质干细胞移植，即通过补充细胞数量以增加细胞外基质合成，从而恢复椎间盘正常的结构和功能，延缓和阻止，甚至逆转椎间盘退变进程。本文就细胞移植治疗ＩＤＤ的研究进展作一综述。１椎问盘结构和功能椎间盘的生理结构特点使脊柱在一定范围内能弯曲和旋转，同时传导体重和肌肉运动所产生的负荷。椎问盘由３个高度分化的结构——终板、纤维环（ＡＦ）和髓核（ＮＰ）组成。纤维环是薄片分层纤维组织，分为外层和内层，外层主要是成纤维细胞，内层以类软骨细胞为主；髓核细胞生长在髓核凝胶状基质中，可分为脊索细胞和类软骨样细胞，髓核细胞数量较少，细胞之间相互联系Ｌ１０；髓核基质主要由髓核细胞分泌的胶原和蛋白聚糖组成，主要作用是保持正常椎间盘含水量、电离子浓度及渗透压，维持正常代谢及均匀分布椎问盘应力，维持椎间盘一定的形态和静水压，有效地承载体重和肌肉运动产生的应力［２］。成年人椎间盘组织内没有血管，氧含量较一般组织低，氧、营养物质和细胞代谢废物通过扩散作用出入椎间盘。整个椎间盘，尤其是髓核细胞处于营养匮乏、低氧分压和ｐＨ值偏低的生物学环境中，同时它也是一个天然的免疫豁免组织ｂＪ。ＩＤＤ的组织病理特征是髓核水分减少，蛋白聚糖含作者单位：７１００３８西安．第四军医大学唐都医院全军骨科中心、全军骨肿瘤研究所・３５・量下降，细胞外基质凝胶状和静力学特性改变。纤维环胶原纤维薄层结构紊乱，出现小裂隙，并向外呈放射状。髓核细胞调亡，细胞数量减少，细胞外基质的性状改变影响到营养物质和氧代谢，导致髓核细胞外环境酸化，进一步加剧了细胞死亡［４西］。椎间盘的特殊结构使得机体自身修复椎间盘十分困难，寻找新的有效方法修复椎间盘，维持相应椎间盘的高度，对稳定脊柱相当重要［６］。２细胞移植理论基础理论上，采用细胞移植手段能扩增椎间盘细胞数量，从而增加髓核基质中胶原成分和蛋白聚糖的分泌，是延缓ＩＤＤ的理想方法。目前所进行的细胞移植研究大体可分为椎间盘细胞移植和间充质干细胞移植两大类。也有研究认为，软骨细胞是细胞移植治疗ＩＤＤ的最佳种子细胞。Ｋｕｈ等［７］经体外培养纤维环细胞、软骨细胞及骨髓基质细胞，并用重组人骨形态发生蛋白一２（ｒｈＢＭＰ－２）刺激细胞生长，结果表明无论是否使用ｒｈＢＭＰ＿２刺激，软骨细胞产生的蛋白聚糖含量最多，而ｒｈＢＭＰ－２刺激后细胞能分泌更多蛋白聚糖，由此认为软骨细胞最适宜作为移植细胞。然而我们研究认为，软骨细胞在体内含量稀少，且自身增殖能力有限，因此将软骨细胞作为种子细胞应用于临床存在困难。尽管该实验结果显示骨髓基质细胞在体外分泌蛋白聚糖和胶原的能力不如其余两种细胞，但是体外的平面培养并不能模拟体内髓核组织的理化特性。不应仅观察骨髓基质细胞本身的分泌能力，还应该关注其在体内的分化潜能，因为向髓核细胞方向分化会增加蛋白聚糖等细胞外基质的分泌。２．１椎间盘细胞移植Ｇａｎｅｙ等［８］从犬模型上采集自体髓核细胞和纤维环细胞，体外培养１２周后移植入相关椎间盘髓核区，随后进行的形态学、影像学和免疫组化分析表明，移植的椎间盘细胞成活并具有分化能力，细胞外基质成分正常，且椎间盘大体高度得到维持。但有报道发现，直接注射椎问盘细胞悬液会在注射处发生细胞溢出，形成漏液。该现象提示直接注射细胞悬液，会造成细胞的流失。采用合适的细胞支架，不仅有利于移植细胞的生长分化，而且可有效地减少直接注射导致的细胞流失。Ｇｒｕｂｅｒ等一１制作椎间盘毁损的沙鼠模型，将自体椎间盘细胞植入三维明胶支架中，并将其移植到病变椎间盘内，移植后３３周检测发现，退变模型中可看到标记的椎间盘

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细胞，同时观察到细胞外基质成分也没有异常改变，椎间盘细胞成活。Ｓａａｄ等【１∞采用胶原一氨基葡聚糖支架将椎问盘细胞移植到受损椎间盘，８周后检测结果显示移植后的细胞不仅成活增殖，并合成了基质蛋白质。将椎间盘细胞在体外三维支架中培养一段时间，然后移植入病变椎间盘，可能有利于细胞存活。ｓａｔｏ等ｕ¨从日本兔体内分离出纤维环细胞，在体外经过荧光标记后植入三维立体胶原基质支架中培养１周，１周后将细胞支架移植入病变椎间盘模型内，并通过连续的Ｘ线摄片观察椎间盘高度和采集组织标本，观察细胞形态和数量，结果显示移植细胞在椎间盘内成活并具有透明软骨样细胞的增殖能力，可有效地防止椎间盘退变进一步发展。自体椎间盘细胞移植往往需要采集足够多的种子细胞，才能在体外成功地培养成活，而体内髓核细胞数量稀少，采集的细胞数量往往有限，无法维持体外培养。基因工程的方法也许可以解决这个难题。１ｗａｓｈｉｎａ等［１２１在这方面作了有益探索，利用腺病毒载体将猿猴病毒４０Ｔ抗原转染人体外培养的健康人髓核细胞中，获得永生化人髓核细胞系，再将该细胞系的细胞植入退变椎间盘，免疫组化分析和形态学观察发现移植组椎间盘髓核与纤维环结构完整，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达明显高于对照组。这项试验结果提高了利用髓核细胞移植治疗ＩＤＤ的可行性。目前对椎间盘细胞移植的研究，还处于初步阶段。移植自体椎问盘细胞在临床应用中存在很多实际问题：①从自身获取髓核细胞时不可避免地会破坏纤维环结构，造成新的损伤，而这种损伤往往会加速病变椎间盘退化。②髓核细胞在椎间盘内含量稀少，自然分布密度很低，很难在微创的前提下获得足够多的种子细胞，用于体外培养。③髓核细胞分裂增殖能力有限，生存环境特殊，体外培养条件要求比较高，细胞增殖缓慢，难以在短时间内得到大量种子细胞，因而临床应用受到很大限制。④现阶段研究对回植细胞的营养代谢情况报道较少。未来研究方向：①寻找合适的介入方式，尽量减少细胞采集和移植过程中对病变椎问盘产生的损伤。②细胞移植可与基因工程结合，通过对髓核细胞进行适当的基因改造，提高其体外增殖能力和细胞外基质分泌能力。③椎间盘细胞移植必须与合适的生物支架、有效的细胞因子和良好的营养供给相结合。④椎间盘细胞移植可与间充质干细胞移植联合，提高移植效率。２．２间充质干细胞移植间充质干细胞（ＭＳＣ）是一类定植于骨髓基质［１３１和其他器官，如肝脏、脐带、胚胎和脂肪组织等［１４’１卯的多能干细胞。它具有分化为多种成熟组织的潜能，在一定的诱导条件下体外培养可呈现出骨、软骨、脂肪和肌腱等中胚层来源器官的细胞表型［１６｜。ＭＳＣ目前没有特征性的细胞表面抗原标志物，学界普遍认为ＭＳＣ表达ＣＤｌ０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０，而ＣＩＮ５、ＣＤ３４、ＣＤｌ４、ＣＤｌｌｂ、ＣＤ７９ａ或ＣＤｌ９和ＨＬＡ－ＤＲ表达阴性［１引。近期研究Ｌ１乩１９］发现，阶段特异性胚胎抗原（ＳＳＥＡ）一１和ＳＳＥＡ－４在鼠和人的ＭＳＣ中表达。在体外，ＭｓＣ可方便地从骨髓中分离、培养和增殖，且来源稳定可靠，这些特性使ＭＳＣ大规模地应用于临床治疗成为可能∞］。免疫学研究［２１。厕表明，Ｍｓｃ能够抑制Ｔ细胞、自然杀伤细胞和Ｂ细胞的免疫活性。在鼠、猪、狒狒等动物模型实验［２４３中也证实，同种异体移植ＭｓＣ未引起宿主的免疫应答。ＭＳＣ的这种免疫特性使其成为细胞移植的理想种子细胞。椎间盘组织结构和基质微环境特殊，而ＭＳＣ的增殖分化依赖于细胞所处的微环境。Ｒｉｓｂｕｄ等醢５瑚１研究发现，ＭＳＣ在模拟的椎间盘低氧环境中可向髓核样细胞分化，将三维藻酸盐凝胶作为支架培养大鼠骨髓基质细胞，并添加转化生长因子（ＴＧＦ）一８诱导，分别在低氧（２％０２）和正常氧（２０％０２）含量环境下培养，结果在低氧条件下诱导后的干细胞表达的蛋白与生理状态下髓核细胞在椎间盘内分泌的蛋白基本一致，低氧环境下ＭｓＣ表达ＳＯＸ－９、蛋白聚糖和胶原的量高于正常氧含量组，同时发现分裂原激活蛋白激酶（ＭＡＰＫ）出现上调，这表明ＭＳＣ可向具有髓核样细胞分子表型的细胞分化。细胞因子参与ＭＳＣ的分化和增殖。Ｓｔｅｃｋ等田１在骨髓基质细胞三维培养基中加入ＴＧＦ－岛，成功诱导了骨髓基质细胞向软骨样细胞分化。作者采用互补脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）阵列技术检测与骨、软骨和干细胞相关的４５个基因的表达，结果显示分化后的骨髓基质细胞基因表达特征更接近椎间盘细胞，同时发现椎间盘细胞在单层培养过程中会丢失部分分化的标志物，并可能发生软骨细胞样改变。理论上，为了得到足够用于移植的细胞数量，种子细胞在移植前必须体外培养扩增，但是培养扩增后的椎间盘细胞不一定再适合用于体内移植，而ＭＳＣ具有强大的增殖能力，可在诱导分化前先无限扩增细胞数量，再经ＴＧＦ－ｔ３诱导成为髓核样细胞用于体内移植。因此，ＭＳＣ作为移植种子细胞也许比椎问盘细胞更合适。

Ｋｕｈ等［２胡应用ｒｈＢＭＰ－２和ＴＧＦ－序两种细胞因子分别或联合作用于ＭＳｃ，诱导干细胞向髓核样细胞分化，结果证实经过诱导分化的ＭＳＣ分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原显著增加，且两种细胞因子联合应用效果更加明显，说明ＭＳＣ已发生向髓核细胞方向的分化。除了应用生物活性物质诱导ＭＳＣ分化外，与椎间盘细胞共同培养也可达到促进干细胞分化的目的。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等Ｌ２９Ｊ研究发现，将髓核细胞与ＭＳＣ按７５：２５比例经细胞－细胞接触式培养７天，定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）显示髓核一标记基因在干细胞有显著增加，ＭＳＣ分化出髓核细胞样表型。髓核细胞作用于ＭＳＣ的实验也提示，部分分化或全分化的干细胞移植入椎间盘后，在周围细胞和分子环境影响下分泌髓核样基质，进而重塑椎间盘结构和功能。ｌｅＶｉｓａｇｅ等［３叩将人退变髓核细胞、纤维环细胞与ＭＳＣｓ按１：１的比例混合培养，通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和免疫蛋白印记法测定糖胺聚糖和脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）含量，并以免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达，结果发现含有ＭＳＣ的混合细胞培养标本的体积是所有实验组中最大的，且高表达糖胺聚糖，说明ＭＳＣ与纤维环细胞共同培养可提高糖胺聚糖和Ⅱ型胶原