荧光分析法
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荧光法荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。
2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。
3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。
（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。
5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。
（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。
（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。
（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。
磷光的坡长比荧光更长。
9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。
激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S1的最低振动能级。
②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。
③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。
10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。
荧光分析法
404nm 356nm 321nm 286nm 278nm 205nm 0.36 0.29 0.11
2.分子的刚性 分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰
撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧
光长移。
3.取代基 给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。 同电子体系相互作用小的取代基对荧光影响
荧光分析法（fluorescence)
教学目标：
掌握分子荧光产生机理 掌握激发光谱和发射光谱的产生以及发射光谱 特征 掌握荧光与分子结构的关系以及荧光强度的影 响因素
熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计
了解分子荧光分析法的应用
荧光棒发光原理 荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧 化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发 光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反 应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目 前市场上常见的荧光棒中通常放臵了一个玻璃管夹层， 夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓， 两种化合物反应使得荧光染料发光。
3.联立方程式法 两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 分别在各自的l荧波长处测定,求出它们的含量 两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区 别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分 不产生荧光;选用不同的激发光进行测定
第三节 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
用于测量荧光强度的仪器有： 1.滤光片荧光计
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 S0 T1 发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
l1
l2
l 2
l3
辐射能量传递过程
荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振 动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐
荧光分析法
光致发光：
吸收某种波长的光后发射出比吸 收波长更长的光的现象。 (荧光和磷光)
荧光分析法 (fluorormetry)
荧光光谱→定性分析 荧光强度→定量分析 分类： 原子荧光分析、分子荧光分析
紫外-可见荧光分析 红外荧光分析 X射线荧光分析
第一节 基本原理 一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程
=
hc
E
2、荧光的产生
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
振动驰豫
发生在同一电子能级内，分子通过
碰撞以热的形式损失部分能量，从较高
振动能级下降到该电子能级的最低振动
能级上。无辐射跃迁。
内转换
即激发态分子将多余的能量转变 为热能，从较高电子能级降至较低的 电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。
OHH+
NH-
pH<2
pH7~12 兰色荧光
pH>13
荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与 溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度 降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭 的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以 及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
外转换
荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降 至第一电子激发单重态的最低振动能 级后，仍不稳定，停留较短时间后
（约 10-8 s ，称作荧光寿命），以光
辐射形式放出能量，回到基态各振动
能级，这时所发射的光称为荧光。
系间跨跃
第一电子激发态的最低振动能级经过另一 个无辐射跃迁转移至激发三重态，称为系间跨 跃。
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法ppt
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
荧光分析法
四氯化碳的拉曼光与激发光波长相近，即与 荧光波长相差较大，对荧光检测干扰较小。
影响荧光强度的主要因素
是波长比入射光较 长的拉曼散射光。因为物质发射的荧光波长比 激发光（即入射光）波长长。
• 消除溶剂拉曼光干扰的方法： - 选择合适的溶剂
- 改变激发光波长，使拉曼光向短波方向移动 如硫酸奎宁的测定
1.荧光检测的基本原理
14
2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图 ，便可得到荧光物质的荧光光谱。
（四）、影响荧光强度的外部因素
温度
溶剂
酸度
01
02
03
荧光熄 灭剂
散射光
04
05
1. 温度的影响
• 随温度降低，荧光强度增加。如荧光素钠在 0℃以下，每降10℃荧光效率增加3％。-80 ℃ 时达到100％。
• 原因是温度升高，分子运动速度加快， 碰撞机率增加，使无辐射跃迁增加，因 而降低了荧光；
常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长
激发光 波长 248 水 271 溶剂拉曼光波长 乙醇 环己烷 267 四氯化碳 － 氯仿 －
267
313
365 405 436
350
416 469 511
344
405 459 500
344
408 458 499
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共振荧光 与激发光具有相同波长的荧光称为共振 荧光 4.瑞利散射光和拉曼射光 瑞利散射光 激发光的频率太低，其能量不足以使 分子中的电子跃迁到电子激发态但可将电子激发至 基态中转变的振动能级，假如电子在受激后能量没 有损失，并且在瞬时返回原来的能级，于是便在各 个不同的方向发射和激发光相同波长的辐射，这种 辐射称为瑞利散射光 拉曼光 被激发到基态中其它转变振动能级的电子， 当它返回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着 产生波长略长或略短于激发光波长的拉曼散射光
能级跃迁 1发生S1→S0的辐射跃迁而伴随荧光现象 2发生S1→S0的内转化过程 3发生S1→T1的体系间窜跃而处于T1态的
最低振动能级的激发分子，则可能发 生T1 →S0的辐射跃迁而伴随燐光现象 也可能发生T1 →S0的体系间窜跃
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三、分子发光类型
1.按激发模式 光致发光（吸收光） 化学发光或生物发光（化学能或生物能） 热致发光（热） 场致发光（电场和磁场）和摩檫发光 2.按分子激发态的类型来划分 荧光 由第一电子激发单重态所产生的辐射
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Au,As 分别表示待测物质和参比物质的该 激发波长的射光的吸光度(A=εbc)
3.荧光量子产率和荧光寿命之间有如下关 系
YF=τ/τ0 内在的寿命:指没有非辐射去活化过程存在
的情况下荧光分子的寿命
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六.荧光强度与溶液浓度的关系
1.在稀溶液(εbc<0.05) F=2.3YFI0εbc YF:荧光量子产率; ε:摩尔吸光系数; I0:入射光强度; b:液池厚度 ;C:溶液中荧
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YF=发射的光子数/吸收的光子数 YF=kf/(kf+ΣK) 荧光量子产率的数值，可以用参比法加以 测定，测量结果按下式计算待测荧光物质 的量子产率 Yu=YsFu As/Fs Au
Yu ,Ys: 分别表示待测物质和参比物质的 荧光量子率 Fu ,Fs 分别表示待测物质和参比物质的 积分荧光强度
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后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各 种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪 记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得 到的谱图称为荧光光谱
功能 鉴别荧光物质 在进行荧光测定时，可 选择适宜的测定波长和滤光片
“表现”荧光光谱 荧光光谱特征 在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总
第三章
荧光分析法
Flourescence Spectrmetry
第一节 荧光分 析导论
一、荧光分析法发展概述 二、分子的激发与去活化 三、分子发光类型 四，荧光的激发光谱和发射 光谱 五，荧光的寿命和量子产率 六,荧光强度与溶液浓度的 关系 七 荧光分析方法的特点
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一、荧光分析法发展概述
是大于激发光的波长 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 与吸收光谱的镜像关系
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五.荧光的寿命和量子产率
1.荧光寿命 激发态返回基态之前耽搁在激发态的平均时
间 τ=1/(kf+ΣK) 经验：荧光寿命：10-8s
燐光寿命：10-2s 2.荧光量子产率
荧光物质吸收光所发射的荧光的光子 数与所吸收的激发光的光子数与所吸收的 激发光的光子数之比值
跃迁而伴随的发光现象称为荧光 燐光 由最低的电子激发三重态所产生的辐
射跃迁，其按时间分为:瞬时荧光和迟滞荧光 按波长分类 stokes荧光:溶液中观察到的荧光，通常称为
stokes荧光，即荧光发射的光子能量低于 激发光的光子能量，即荧光比激发光具有 更长的波长. 反stokes荧光:假如在吸收光子的过程中又附 加热能给激发态分子，那么所发射的荧光 波长可能比激发光的波长来得短.在高温的 稀薄气体中可能观察到这种现象
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四，荧光的激发光谱和发射光谱
1.荧光的激发光谱 定义：荧光的激发光谱简称激发光谱，它是
通过测量荧光体的发光通量随波长变化而 获得的光谱，它反映了不同波长激发光引 起荧光的相对效率 作用：鉴别荧光物质，选择适宜的激发波长 “表观”激发光谱: 2.荧光的发射光谱（荧光光谱、发射光谱） 定义：使激发光的波长和强度保持不变，而 让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器
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激发三重态 电子在跃迁过程中伴 随着自旋方向的改变，这时分子具有 两个自旋不配对的电子，称分子处于 激发三重态用T表示
2.激发分子的去活化 辐射跃迁的去活化过程，发生光子的 发射，伴随着荧光或燐光现象
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非辐射跃迁的去活化过程，把激发能转 变成振动能或转动能 非辐射跃迁包括内转化(ic)和体系间窜 跃 (isc) 内转化(internal conversion)过程指 的是相同多重态的两个电子间的非辐射 跃迁. 体系间窜跃(intersystem crossing)过 程指的是不同过重态的两个电子生态间 的非辐射跃迁 02:36:34
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1.共轭键体系 ①大部分荧光物质都有芳环,芳环越大,荧 光峰越移向长波方向,荧光强度增大.这 是由于芳环越大,共轭体系也越大,离域 电子越容易激发,荧光越容易产生 ②同一共轭环数的芳族化合物,线性环结 构者荧光波长比非线性者要强 2刚性平面结构
光物质的浓度 2.在浓溶液中
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七 荧光分析方法的特点
• 1.特点 • ①灵敏度高 • ②选择性高 • ③重现性好 • ④取样量少 • ⑤仪器设备不太复杂 • 2.缺点
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第二节 荧光与结构的关系
一.有机物的荧光 (1)具有大的共轭π键结构 (2)具有刚性的平面结构 (3)最低激发单重态S1为π→π*型 (4)取代基团为给电子取代基
1.荧光
当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质 会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而 当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快 地消失，这种光线称为荧光。
2.发展概况
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二、分子的激发与去活化
1.分子的激发 单重态 分子中全部轨道里的电子都是 自旋配对的，即S=O，该分子便处于单 重态（大多数有机物分子的基态是处于 单重态） 激发单重态 分子吸收能量后电子在跃 迁过程中不发生自旋方向的变化，这时， 分子处于激发单重态，用S表示