第21章常用分子生物学技术的原理及其应用

目录常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology

第21章目录

第一节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录

核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。

一、分子杂交与印迹技术的原理目录

复性

RNADNA目录

（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。目录

用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

（二）探针技术目录

二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹(Southern Blotting)

（二）RNA印迹(Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹(Western Blotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。目录

（一）DNA印迹技术Southern blotting

又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。将待测DNA序列结合到特定的固相支持物上，

然后与液相中的核酸探针进行杂交的过程.

是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。目录

主要步骤：1.基因组DNA的制备2.DNA的限制性酶切3.电泳分离酶切的DNA片段并进行碱变性处理4.转移并固定于硝酸纤维素膜上5.预杂交以封闭非特异性结合位点6.用标记的探针进行杂交7.杂交后在一定的条件下洗膜8.通过放射自显影或显色反应检测DNA限制性酶切片段的位置．目录分子杂交实验

①

②③目录Paper Towels

Southern BlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿

无水乙醇

离心目录（二）RNA印渍技术Northern blotting

又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。目录

（三）蛋白质印渍技术Western blotting

又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。

应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。目录

三种印迹技术的比较目录

第二节

聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction目录

PCR技术polymerase chain reaction

PCR即聚合酶链反应技术，通过一对特异引物选择性体外扩增DNA片段的方法。是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。

理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。目录目录

5Primer 15Primer 2

Cycle 2Cycle 1

555

5

55

Template DNA

一、PCR技术的工作原理

55555555目录Cycle 3

5555555555

55

5555

25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录

•模板DNA•特异性引物•耐热DNA聚合酶•dNTP•Mg2+

PCR体系基本组成成分目录

PCR的基本反应步骤变性95˚C

延伸72˚C退火

Tm-5˚C目录

PCR的基本原理类似于DNA的天然复制过程，实际上是在模板、引物和四种dNTP存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①变性（denaturation)：通过加热使DNA双链间的氢键断裂，形成单链DNA；②退火(annealling)：将反应混合液冷却到某一温度，使引物与靶序列退火；③延伸（extension)：在TaqDNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+的作用下，退火引物沿5‘-3’方向得以延伸。以上每三步为一循环，由于上一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环，就基本上使目的DNA产物增加一倍。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。目录

•利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；

•利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；

•利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。

二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆目录利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。

PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

（三）DNA和RNA的微量分析

（二）基因突变目录

将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；

待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。

PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。

（四）DNA序列测定（五）基因突变分析目录•逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。

•RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。

（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术目录

RT-PCR 概念（原理）先将mRNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，这项技术称为RT-PCR目录

RT-PCR 操作程序•提取组织或细胞总RNA或mRNA•↓•逆转录合成cDNA第一条链

•↓•95℃加热5min灭活逆转录酶•↓•加入特异引物和Taq DNA聚合酶进行PCR•↓•产物分析目录

•原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。

•原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。

（二）原位PCR技术目录

第四节基因文库Gene Library目录•基因组DNA文库(genomic DNA library)

•cDNA文库(cDNA library)

基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。目录

一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。

用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。