双向电泳法问题回答
生物检测 5蛋白质双向电泳
三、实验步骤
5、染色检验 、
硝酸银染色 优点：灵敏度高， 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差， 缺点：重复性差，质谱兼容性低 硝酸银染色图谱 考马斯亮兰染色： 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好， 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点： 缺点：灵敏度低 荧光染色： 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点： 缺点：价格贵 考马斯亮蓝染色图谱 其它染色方法： 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、 胺基黑染色、印度墨水制备 、
最关键步骤之一 双向电泳的最关键 双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质， 可能简单的操作步骤， 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质。 离子等干扰物质。
第5讲 蛋白质双向电泳
肺癌细胞
膀胱腺癌
基本内容
一、蛋白质组学的相关知识 二、双向电泳的原理 三、实验步骤 四、课堂小结 五、作业
一、蛋白质组学的相关知识
1、什么是蛋白质组学？ 、什么是蛋白质组学？ 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的 一门新兴科学。 一门新兴科学。 目的是从整体的角度分析细胞内动态 是从整体的角度 其目的是从整体的角度分析细胞内动态 变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状 变化的蛋白质组成成份、 了解蛋白质之间的相互作用与联系 相互作用与联系， 态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭 示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 不同的时间和空间！ 不同的时间和空间！ 时间
三、实验步骤
3、胶条平衡
等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳之前需进 等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳之前需进 SDS 行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS充分 蛋白质与SDS 行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS充分 结合，保证SDS-PAGE电泳的顺利进行。 结合，保证SDS-PAGE电泳的顺利进行。 SDS 电泳的顺利进行
第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
第二向：
BIO-RAD公司PROTEAN II xi Cell电泳槽：
电极是直径为0.01英寸的白金电极；适用于16.5×20cm 凝胶电泳；凝胶 厚度为1.0mm；可同时运行1-2块胶；上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液1.2 L；典型SDS-PAGE电泳时间：无冷却时为5小时，带冷却时为3.5小时。配套 电源为Power Pac 1000：在进行电泳时，最大电压不超过1000V，最大功率不 超过80W，最大室温不超过50℃。
Amersham pharmcia Biotech公司Ettan DALT II System：
非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用 8M尿素 + 5%β-ME + 2%SDS进行平衡，再进行第二向SDSPAGE电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消 化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多 肽的信息。
变性2D-PAGE：样品先用2%SDS + 5%β-ME + 95℃变性5min, IEF在8M尿素 + 1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS + 5%β-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和 多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引 起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质 点少于第三种方式。
将来自于全细胞组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离检测和分析生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的ief和page电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量n端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定双向凝胶电泳的发展双向凝胶电泳的思路最早是由smithies和poulik提出smithiespoulikmd
蛋白质双向电泳、western blot原理、方法、应用
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标： • 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积 体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； • 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、 多糖和核酸等物质的去除； • 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
增加样品溶解性的手段
• 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充 分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量 域。典型代表是尿素和硫尿。 • 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏 水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的 去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。 • 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已 变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还 原。
什么是蛋白质印迹法 ？
• Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化 技术及分子亲和技术三者融为一体的综合 性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带 并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、 酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合 了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感 性和特异性，是一种能用于分析样本组分 的免疫学测定的方法。
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1× 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 • 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。
第06章 电泳技术和常用电泳仪习题
六章电泳技术和常用电泳仪首页习题习题参考答案习题名词解释选择题简答题一、名词解释1．电泳2．毛细管电泳的电场强度3．蛋白质的等电点4．电泳速度5．迁移率6．毛细管电泳技术7．电泳淌度8．迁移时间9．毛细管电泳电渗流10．焦耳热11．电渗12. 吸附作用二、选择题【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。
1．瑞典科学家A．Tiselius首先利用U形管建立移界电泳法的时间是（）A．1920年B．1930年C．1937年D．1940年E．1948年2．大多数蛋白质电泳用巴比妥或硼酸缓冲液的pH值是（）A．7.2～7.4B．7.4～7.6C．7.6～8.0D．8.2～8.8E．8.8～9.23．下列有关电泳时溶液的离子强度的描述中，错误的是（）A．溶液的离子强度对带电粒子的泳动有影响B．离子强度越高、电泳速度越快C．离子强度太低，缓冲液的电流下降D．离子强度太低，扩散现象严重，使分辨力明显降低E．离子强度太高，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断4．电泳时pH值、颗粒所带的电荷和电泳速度的关系，下列描述中正确的是（）A．pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越慢B．pH值离等电点越近，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快C．pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越少，电泳速度也越快D．pH值离等电点越近，颗粒所带的电荷越少，电泳速度也越快E．pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快5．一般来说，颗粒带净电荷量、直径和泳动速度的关系是（）A．颗粒带净电荷量越大或其直径越小，在电场中的泳动速度就越快B．颗粒带净电荷量越小或其直径越小，在电场中的泳动速度就越快C．颗粒带净电荷量越大或其直径越大，在电场中的泳动速度就越快D．颗粒带净电荷量越大或其直径越小，在电场中的泳动速度就越慢E．颗粒带净电荷量越小或其直径越大，在电场中的泳动速度就越快6．电泳时对支持物的一般要求除不溶于溶液、结构均一而稳定外，还应具备（）A．导电、不带电荷、没有电渗、热传导度小、B．不导电、不带电荷、没有电渗、热传导度大C．不导电、带电荷、有电渗、热传导度大D．导电、不带电荷、有电渗、热传导度大E．导电、带电荷、有电渗、热传导度小7．醋酸纤维素薄膜电泳的特点是（）A．分离速度慢、电泳时间短、样品用量少B．分离速度快、电泳时间长、样品用量少C．分离速度快、电泳时间短、样品用量少D．分离速度快、电泳时间短、样品用量多E．分离速度慢、电泳时间长、样品用量少8．聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，其优点是（）A．机械强度好、弹性小、无电渗作用、分辨率高B．机械强度好、弹性大、有电渗作用、分辨率高C．机械强度好、弹性大、有电渗作用、分辨率低D．机械强度好、弹性大、无电渗作用、分辨率低E．机械强度好、弹性大、无电渗作用、分辨率高9．20世纪60年代中期问世的等电聚焦电泳，是一种（）A．分离组份与电解质一起向前移动的同时进行分离的电泳技术B．能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的电泳技术C．利用凝胶物质作支持物进行的电泳技术D．利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术E．用滤纸作为支持载体的电泳技术10．毛细管等电聚焦电泳具有极高的分辨率，通常可以分离的两种蛋白质其等电点差异小于（）A．0.01pH单位B．0.05pH单位C．0.10pH单位D．0.15pH单位E．0.20pH单位11．双向凝胶电泳（二维电泳），最多可以分辨出的斑点数量是（）A．500～1000B．1000～2000C．2000～4000D．4000～5000E．5000～1000012．下述免疫电泳优点的描述中，错误的是（）A．加快了沉淀反应的速度B．是将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再与抗体起反应C．本法微量化程度高D．多样化程度高E．应用范围小13．毛细管电泳技术最初发展的时期是（）A．20世纪60年代B．20世纪70年代C．20世纪80年代初期D．20世纪80年代中后期E．20世纪90年代初期14．毛细管电泳时进样体积在nL级，样品浓度可低于的数量是（）A．可低于10一2mo1/LB．可低于10一3mo1/LC．可低于10一4mo1/LD．可低于10一5mo1/LE．可低于10一6mo1/L15．毛细管电泳的特点（）A．容易自动化，操作繁杂，环境污染小B．容易自动化，操作简便，环境污染大C．容易自动化，操作繁杂，环境污染大D．不易自动化，操作简便，环境污染小E．容易自动化，操作简便，环境污染小16．毛细管等速电泳常用于分离（）A．小离子、小分子、肽类及蛋白质B．大离子、小分子、肽类及蛋白质C．小离子、大分子、肽类及蛋白质D．小离子、中分子、肽类及蛋白质E．大离子、中分子、肽类及蛋白质17．理想的毛细管柱除应具有一定的柔性、易于弯曲，还应是（）A．化学和电惰性的、紫外光可以透过、耐用又便宜B．化学和电惰性的、红外光可以透过、耐用又便宜C．化学和电惰性的、可见光可以透过、耐用又便宜D．化学和电惰性的、紫外和可见光可以透过、耐用又便宜E．化学和电惰性的、紫外和红外光可以透过、耐用又便宜18．目前所使用的毛细管柱内径是（）A．5μm～25μmB．15μm～35μmC．25μm～75μmD．30μm～80μmE．50μm～100μm19．最初出现的电泳毛细管直径为（）A．1mm～2mmB．1mm～3mmC．2mm～4mmD．3mm～5mmE．3mm～6mm20．毛细管电泳紫外检测器质量检测极限为（）A．10-10～10-12B．10-13～10-16C．10-14～10-17D．10-15～10-18E．10-16～10-1921．毛细管电泳紫外检测器浓度检测极限为（）A．10-1～10-3B．10-2～10-6C．10-5～10-8D．10-7～10-9E．10-10～10-1222．稳压稳流电泳仪属于中压电泳仪。
6第四节 双向电泳(2DGE)-生化分析
二、 双向电泳技术
1．ISO-Dalt系统 向将不同pI的蛋白质通过等电聚焦电泳分离，获
得了按等电点差异分离的蛋白质组分，然后再经 SDS-PAGE，将等电点相同或相近的、相对分子质 量有差异的蛋白质组分分开，最终得到不同相对分 子质量的蛋白质组分。
一般情况细胞内同时具有pI和相对分子质量都相同的 蛋白质，其概率是非常少的。所以，双向电泳得到的蛋白 质组分绝大部分都是单一组分。
2．IPG-Dalt系统 原理：固相pH介质是丙烯酰胺的衍生物，通过化学 方法以共价键的形式结合到聚丙烯酰胺凝胶上。pH 梯度在凝胶聚合时就已经形成，所以，该pH梯度不 受脱水、重新水化和电场等因素的影响，能得到很 稳定的pH梯度，不会产生pH漂移，电泳时不同pI的 蛋白质，根据其pI聚焦在相应的位置。
5 000～8 000多种蛋白质，这是其他任何分析鉴定技 术无法与其相比的。所以，双向电泳在样品的全组分 鉴定中占有重要的地位。
1970年Kaltschimidt 和Wittmann提出了用双向电 泳技术分离有效组分的研究。 双向电泳(two-dimensional electrophoresis，简称 2DE)分离技术是将样品进行一次电泳后，再沿它 的直角方向进行一次电泳。 随着双向电泳第一向的等电聚焦技术的发展，等 电聚焦形成的pH梯度有载体两性电解质pH梯度、 固相pH梯度及二者的“杂交”技术形成的pH梯 度。这些技术被引入双向电泳中以后，大大提高 了双向电泳的分辨率和重复性。
双向电泳的原理应用
双向电泳的原理应用1. 原理介绍双向电泳是一种用于分离和分析蛋白质的技术。
它利用电场的力作用将蛋白质分子根据其大小和电荷分离成不同的带状条带，从而实现对蛋白质的分离和分析。
在双向电泳中，电泳液在两个方向（水平和垂直）上施加电场。
水平的电场用于推动蛋白质分子在凝胶中移动，而垂直的电场用于将蛋白质分子根据其电荷进行分离。
2. 双向电泳的步骤双向电泳通常包括以下几个步骤：2.1 凝胶制备首先制备凝胶，常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶和聚酰胺凝胶。
凝胶的选择取决于所要分析的蛋白质的分子量范围。
2.2 样品制备将待分析的蛋白质样品进行处理，通常包括蛋白质提取、蛋白质纯化和蛋白质标记等步骤。
2.3 水平电泳将样品加载到凝胶上，并将凝胶放入水平电泳槽中。
施加水平电场后，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，形成水平方向上的分离。
2.4 凝胶固定水平电泳后，将凝胶固定，通常使用乙醇或甲醛进行固定，以防止蛋白质在后续步骤中的移动。
2.5 垂直电泳固定后的凝胶被垂直放置，然后施加垂直电场。
此时，蛋白质会根据其电荷进行进一步的分离。
2.6 染色和可视化分离完成后，凝胶通常会被染色，以便观察和分析分离的蛋白质条带。
常用的染色方法包括银染和荧光染色。
3. 双向电泳的应用双向电泳在蛋白质分离和分析方面具有广泛的应用。
3.1 蛋白质组学研究双向电泳可以用于研究蛋白质组学，包括蛋白质的组成、结构和功能等。
通过双向电泳可以分离出不同的蛋白质条带，从而有助于研究蛋白质的表达和变化。
3.2 蛋白质质量测定双向电泳可以用于测定蛋白质的质量。
通过与已知质量的蛋白质进行比较，可以确定待测蛋白质的质量范围。
3.3 蛋白质互作研究双向电泳还可以用于研究蛋白质之间的相互作用。
通过在凝胶中一同加载多个蛋白质样品，可以观察到不同蛋白质之间的相互作用。
3.4 蛋白质标记双向电泳常常与蛋白质标记技术结合使用。
通过将蛋白质样品与荧光染料或同位素标记剂结合，可以在凝胶上可视化和定量分析蛋白质。
蛋白样品制备
双向电泳之样品的制备2008-04-02 21:58:37| 分类：默认分类|举报|字号订阅一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。
目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。
当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。
通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。
在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。
样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。
脂类和多糖都可以通过超速离心除去。
透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
电泳知识总结
1.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生定向迁移（与其本身所带电荷相反的电极移动）的现象。
利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。
2。
生物大分子在电场中移动的速度由什么决定？答：样品性质方面：粒子大小,形状,带电荷多少，带电性质;电泳条件方面:介质阻力,电场强度,溶液黏度。
3。
粒子的移动速度（泳动速度V)与电场强度(E)、粒子所带电荷量(Q）成正比,而与粒子半径（r)及溶液粘度（η）成反比。
非球形分子(如线状DNA)在电泳过程中受到更大的阻力,即粒子的泳动速度与粒子形状有关。
4.迁移率与下列（ D ）因素无关？A。
电荷数量B。
粒子大小 C.溶液黏度D。
电场强度电泳迁移率（/泳动度/淌度）μ:带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。
μ= V/E = Q/6πrη【影响迁移率的因素：1. 待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快；2。
缓冲液pH和离子强度：pH值距pI愈远,Q越大,V越大；pH过高或过低☞蛋白变性☞缓冲液；缓冲液通常要保持一定的离子强度；离子强度过低或过高的不利影响；3。
电场强度：E高，带电颗粒泳动快。
过高，产生焦耳热,样品和Buffer扩散增加,条带增宽;蛋白变性。
过低，电泳时间增加，扩散。
当需要增大电场强度以缩短电泳时间时,需附有冷却装置；4. 电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度；5。
支持介质：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大；介质的纯度影响聚焦效果；介质的非特异性吸附会增大电渗.】5.等电点的定义？蛋白质在等电点时有哪些特点？答：当溶液的pH为一定数值时,其中的蛋白质正负电荷相等,即净电荷为零,此时的pH值就是该蛋白质等电点pI.蛋白质在等电点时的溶解度最小。
6。
下列不是区带电泳的是( C ）A。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
双向电泳法
双向电泳法是一种用于分离蛋白质的方法，它可以将复杂的蛋白质样
品划分成更小、更简单的部分。
通过该方法，人们可以更深入地研究
蛋白质的结构、功能以及表达。
双向电泳法包括两个主要步骤：等电聚焦和SDS-PAGE。
等电聚焦利
用电场的不同电势将蛋白质分离成在不同等电点停留的充电种类。
这
些蛋白质将从水面通过凝胶的毛孔流动到其他场中。
最外部的电极会
使凝胶中的这些蛋白质向相反方向移动，然后再进行SDS-PAGE步骤，通过蛋白质的大小来将它们分类。
尽管双向电泳法已经存在了很长时间，但它仍然是生物学研究人员中
非常受欢迎的技术之一。
它可以用于各种样品，如人类组织、细胞培
养物、微生物以及植物，这些样品都可以用来进行不同范围和实验室
需求下的研究。
相比于其他蛋白质分析技术，双向电泳法具有许多优点。
例如：
1. 高解析度。
双向电泳法可以将复杂的蛋白质混合物分离成百上千的
谱带。
这使得研究人员可以在不同的谱带上针对不同的蛋白质进行研究。
2. 对小分子靶标进行优化。
一些较小的蛋白质，像激素和细胞因子，
往往不能被其他分离技术轻易捕捉。
双向电泳法可以确保在凝胶中打
出一个小谱带，并通过调整电泳参数来使这些小蛋白质也可以被检测到。
3. 无需标记。
使用双向电泳法，不需要先对样品进行标记，因为样品
中的蛋白质被用电势和电压从样品移动到凝胶上。
虽然双向电泳法已经成为了研究蛋白质及蛋白质体系结构的主要方法，但是其也带来了许多挑战。
其中最重要的是凝胶表面的不均匀性，以
及分子的截断现象。
凝胶表面的不均匀性会影响蛋白质的分离，而分
子的截断现象则意味着某些蛋白质的片段可能比完整的蛋白质更容易
被检测到。
总的来说，双向电泳法是对蛋白质研究进行更深入了解的重要工具。
它提供了高分辨率、高通量和无需标记的优点，仍在各种研究领域广
泛应用。
随着基因和蛋白质测序技术的快速发展，相信它也将在不远
的将来得到不断地改进和提升。