体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。
方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。
结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。
结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。
%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
细胞名词解释
细胞名词解释1.愈伤组织：原意是指植物体的局部受创伤刺激后，在其伤⼝表⾯新⽣的⼀团薄壁细胞。
在组织培养中是指在⼈⼯培养基上由已经分化的外植体的细胞重新分裂⽣长⽽形成的⼀团⽆特定形状、⽆序⽣长的薄壁细胞。
在⼀定条件下离体状态的植物组织中已经分化并停⽌⽣长的细胞重新分裂⽣长所形成的⽆组织结构的细胞团。
2.外植体：指植物组织培养中作为培养材料的离体组织块离体器官或离体细胞。
3.胚状体：由外植体或愈伤组织产⽣的与正常受精卵发育成的胚相类似的胚胎状结构。
据来源分为体细胞胚与⽣殖细胞胚。
4.极性：⾼等植物均具⼀主轴，各器官沿此主轴有顺序的进⾏⽣长分化。
主轴的⾸尾两端在⽣理形态上都有着明显差异，通常⾸段⽣芽尾端长根（形态学上端下端）这种现象叫极性。
5.植株再⽣：指通过组织培养技术将植物的细胞、组织、器官等培养成完整植株的过程。
6.形态发⽣（形态建成）：指⽣物个体发育或再⽣过程中⽣物体及其器官的形态结构的形成过程。
7.试管苗：指在⽆菌离体条件下的⼈⼯培养基上对植物细胞、组织或器官进⾏培养所获得的再⽣植株。
8.玻璃苗：指外表呈玻璃状，幼茎、叶⽚呈现半透明⽔渍状态的畸形试管植物。
9.体细胞⽆性系：指由同⼀个外植体反复进⾏继代培养后得到的⼀系列后代。
在细胞培养中，由单细胞形成的后代叫但细胞⽆性系。
10.培养基：⽤于满⾜植物正常发育所需各种营养物质的总和。
11.初代培养：指从植物体上分离外植体进⾏的第⼀次培养。
12.继代培养：将初代培养的培养物（愈伤组织、芽等）重新切割转移到新的培养基上继续扩⼤培养的过程。
13.固体培养：指加⼊琼脂等固化剂使培养基呈固体状态所进⾏的培养。
14.液体培养：指不加Agar等固化剂使培养基呈液体状态所进⾏的培养。
U11、细胞⼯程：按照⼀定的设计⽅案，通过在细胞、亚细胞或组织⽔平上进⾏实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性⽣物⼯程。
2、摇床：常⽤来进⾏细胞悬浮培养，可根据震荡⽅式分为⽔平往复式和回旋式两种，震荡速度因培养材料和培养⽬的的不同⽽不同，常⽤的震荡速度为100r/min.3、培养瓶：⼀般的植物组织和细胞培养常⽤玻璃三⾓瓶、试管、各种⼤⼩的⼴⼝玻璃瓶时，有时甚⾄⽜奶瓶和罐头瓶也都可以利⽤，特别是在进⾏快速繁殖时更常⽤造价较低的培养器⽫。
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。
通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。
建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。
同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。
将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
·1216·
中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因重编程人皮肤成纤维细胞的实验研究
ａ ｄｃｌ ｒ ｒｕ ｈａｈ ｒ ｔｉ ｕ ｕｔｒ．￣Ｔ ｅｈｍｅ ｉ ｂｏｌｓ ｅｓ ｅｅ ｎ ｃ ｄｂ ａｋｇ ｇ ｎ ｒｄｃｎ ｎ ｕｔ ｅ ｔ ｏｇ ｄ ｅ ｎ ｓ ｅｃｌ ｅ ）ｈ ｕ ｎｓ ｎｆ ｒｂａｔ ｃｌ ｒ ｉｆ ｔ ｙｐｃａｉ ｄｐｏｕｉｇ ｕ ｄｈ ｅ ｔｓ ｕ ｋ ｉ ｓ ｌｗ ｅ ｅ ｎａ
编程后形态类似 于胚胎干细胞 ， 细胞 Ａ Ｐ染色阳性 ， 内源多能基 因 Ｏ ｔ、ｏ２、 ａｏ 、 ｅｌ表达量增 高 ， ｃ Ｓｘ Ｎ ｎｇ Ｒ ｘ ４ 细胞 体内可 关键词 ： 脐带基质间充质细胞 ； 细胞编程 ； 血干细胞 ； 造 诱导性多潜能干细胞
中 图分 类号 ：３ ３ Ｑ ４
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｓ ａ ｃ ｎ Ｕｍ ｂｌ ａ ｏ ｄ ｍ ａｒ ｅｌ ｒ ｐｏ ｒ ｍｍ ｅ ｙ Ｓｏ ２，ＫＩ ｉｃ ｌ ｒ ｔｉ ｃ ｌ ｅ ｒ ｇ ａ ｉ ｃ ｘ ｓ ｄｂ ｘ ｆ ４，Ｏｃ４，Ｃ Ｍｙ ｅ ｅ ｔ － ｃｇ ｎ ｓ
ｓ ｍ ｃｌ ｉＳ ｙＳｘ ， ｌ ， ｃ ， — ｃｇｎｓ ｔ ｅｓ（Ｐ ）ｂ ｏ２ Ｋｆ Ｏ ｔ ｃＭｙ ｅｅ．Ｍｅｈ ｄ ① Ｉ ｉｏ ｔｅｈｍｅ ｋｎ ｂｏｌ ｔ ｃｌ Байду номын сангаасｅｉ ｌ ｅ ｅ ｌ ４ ４ ｔｏ ｓ ｎｖｒ，ｈ ｕ ｎｓｉ ｒｂａ ｓ ｅ ｓ ｒ ｓ ａ ｄ ｔ ｉ ｆ ｓ ｌｗ ｏ ｔ
脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,具有来源丰富、免疫原性低等诸多特性
脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富、免疫原性低、移植后不需应用免疫抑制剂的情况下长期存活等诸多特性脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富、免疫原性低、移植后不需应用免疫抑制剂的情况下长期存活等诸多特性，为其应用于临床开阔了更好的前景。
学术术语来源---人脐带间充质干细胞生物特性比较：胰酶冷消化和组织块法体外培养文章亮点：1实验创新性地采用胰酶冷消化法培养人脐带间充质干细胞，从细胞形态、生长曲线、细胞表面标记物及诱导分化能力4个方面与传统组织块法比较，为不同需求的科研工作者获得较多的脐带间充质干细胞、更完整的细胞结构及其功能以满足实验要求提供一些资料。
2结果显示组织块法培养原代细胞形态优于胰酶冷消化法，第3代细胞增殖速率显著快于胰酶冷消化法，两种方法获得的脐带间充质干细胞具有相同的表面标志，经诱导后均表达神经干细胞特征性标志物nestin，说明组织块法更适合用于培养脐带间充质干细胞。
关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；胰酶冷消化法；组织块法；脐带间充质干细胞；组织工程；生物学特性主题词：脐带；间质干细胞；细胞培养技术；细胞，培养的摘要背景：以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。
目的：比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。
方法：采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞，记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期，倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况，制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线，流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达，第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。
结果与结论：使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞，胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P < 0.05)；原代培养周期差异无显著性意义(P > 0.05)。
人皮肤成纤维细胞培养
人皮肤成纤维细胞培养随着生物技术的不断发展，皮肤成纤维细胞的培养已经成为了医疗、美容等领域不可或缺的一部分。
那么，什么是皮肤成纤维细胞？它有哪些应用？下面，就来一起了解一下吧。
一、皮肤成纤维细胞的定义及工作原理皮肤成纤维细胞是一种位于真皮层的细胞，主要负责合成胶原蛋白等结构蛋白，维持皮肤组织的稳定性和弹性。
在人体的愈合过程中，皮肤成纤维细胞也扮演着至关重要的角色。
当皮肤损伤或损失时，成纤维细胞会被吸引到受伤区域，开始合成胶原蛋白，促进伤口愈合，恢复皮肤的完整性。
为了更好地利用皮肤成纤维细胞的作用，科学家们发明了皮肤成纤维细胞培养技术。
该技术是利用类似于细胞培养的方法，通过体外培养皮肤成纤维细胞，使其不断分裂增殖，并加入适当的生长因子和激素等物质，从而达到治疗、美容等目的的一种技术。
二、皮肤成纤维细胞培养的主要应用1.治疗烧伤、创伤及手术切口愈合培养皮肤成纤维细胞可以使其快速增殖，从而在患处形成新的皮肤组织，加快创伤愈合、手术切口愈合和烧伤愈合等。
2.促进肌肤再生和修复随着年龄的增长，肌肤会出现干燥、松弛、皱纹等问题，此时，培养皮肤成纤维细胞可以帮助肌肤再生，并修复受损的组织。
3.美容和抗衰老培养皮肤成纤维细胞中添加特定的生长因子、激素等物质，可以使其具有美容和抗衰老的功能，促进胶原蛋白的合成，恢复肌肤弹性和紧致度，改善皱纹、色斑和痘印等问题。
三、皮肤成纤维细胞培养的注意事项1.体外培养时间不能过长长时间的体外培养可能导致培养皮肤成纤维细胞的质量下降，影响其应用效果。
2.质量控制需严格培养过程中需保持无菌条件，防止细菌或病毒感染。
3.技术手段需提高皮肤成纤维细胞培养技术需不断提高，以满足临床和美容上的需求。
总之，皮肤成纤维细胞作为一种重要的细胞类型，在医疗、美容等领域扮演着至关重要的角色。
其培养技术的应用和发展，将为我们的健康和美丽带来更多的机遇和可能。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蒋知新 艾 民1 张清华 沙 杭 高 毅2 卢 海1 （ 中国人民解放军三 0 五医院，北京 100017）
〔摘 要〕 目的 探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞（ UMC） 和人皮肤成纤维细胞（ HSF） 的方法。方法 用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核 糖核酸酶和 0. 25% 胰蛋白酶消化法原代分离培养 UMC 细胞，用组织块贴壁法原代分离培养 HSF 细胞，镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果
1 材料与方法 1. 1 标本和主要试剂 脐带组织来源于南方医科大学第二临 床学院产科足月妊娠正常分娩的新生儿； 皮肤组织来源于南方 医科大学第二临床学院心血管内科患者。收集组织前经广州 市卫生研究院伦理委员会批准，患者及其家属同意签字后方可 进行。 高 糖 型 DMEM、DMEM / F12、10% 胎 牛 血 清 白 蛋 白 （ FBS） 、Ⅳ型胶原蛋白酶（ Collagenase Ⅳ） 、Ⅰ型脱氧核糖核酸 酶（ DNase Ⅰ） 、0. 25% 胰蛋白酶 （ 0. 25% Trypsin） 、磷酸盐缓冲
·4194·
2. 2 HSF 皮肤组织块贴壁培养，第 3 天镜下可见部分组织 块周围爬出角质细胞； 第 5 天有少量脂肪细胞； 第 8 天可见少 量 HSF 爬出。随着细胞培养时间延长，HSF 数量逐渐增多，形
中国老年学杂志 2012 年 10 月第 32 卷
态呈长梭形、多边形或不规则三角形，胞核呈卵圆形； 第 16 天 部分 HSF 细胞生长密度超过 95% ，呈放射状、栅栏状或漩涡状 排列。见图 2。
2结果 2. 1 UMC 形态 酶消化分离脐带组织，第 2 天镜下可见少量 细胞贴壁生 长； 第 7 天 细 胞 大 小 不 一、形 态 不 规 则； 第 10 天 UMC 细胞数量增多，呈短棒状、长梭形、三角形，有突起，胞膜有 折光性，类似于成纤维细胞； 第 15 天 UMC 生长密度超过 95% ， 呈平行或漩涡状排列生长。见图 1。
脐带组织分离培养第 3 天，有少量 UMC 贴壁生长，细胞膜周围有折光性，形态类似于成纤维细胞； 皮肤组织块贴壁培养第 7 天，有 HSF 爬出，呈长 梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长，UMC 和 HSF 数量逐渐增多，细胞生长状态良好。结论 应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培 养出 UMC 和 HSF。
图 1 原代分离培养 UMC（ × 100）
培养细胞常用酶消化培养法和（ 或） 组织块
贴壁培养法两种，这 两 种 方 法 各 有 利 弊，应 根 据 细 胞 种 类 和 生 长特点，选择不同的细胞分离培养方法。脐带应用 Collagenase Ⅳ、DNase Ⅰ、0. 25% 胰酶消化分离，可获得原代培养的 UMC。 第 2 天镜下可见少量的悬浮细胞贴壁生长，细胞形态呈短棒 状、有突起、胞膜有折光性； 随着培养时间的延长，细胞数量增 多，细胞形态多样、大小不一，但是多数细胞形态呈梭形、棒状、 三角形、锥形，而宽大、扁平、不规则形状的细胞数量相对较少； 第 15 天 UMC 细胞生长密度达 95% 左右，进行第一次细胞传代 培养和冻存。随着细胞培养时间的延长和细胞代数的增加，细 胞形态趋于单一，类 似 于 成 纤 维 细 胞，那 些 宽 大、扁 平、不 规 则 形状细胞明显减少，可能为衰老的细胞，UMC 对数生长期一般 为 3 ～ 5 d。
〔关键词〕 细胞培养； 脐带基质间充质细胞； 人皮肤成纤维细胞 〔中图分类号〕 R39 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（2012）19-4193-02；doi：10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 19. 040
2006 年日本京都大学 Yamanaka 研究小组首先将小鼠成纤 维细胞 重 编 程 为 类 似 于 胚 胎 样 干 细 胞 （ ES ） ，简 称“iPS 细 胞”〔1〕，2009 年我国学者将基质间充质细胞 （ UMC） 细胞成功 的诱导为 iPS 细胞，并进一步向神经细胞分化〔2〕，获取可靠来 源的体细胞是细胞重编程的首要环节之一。本实验于 2011 年 2 月 20 日至 2011 年 4 月 25 日利用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧 核糖核酸酶和 0. 25% 胰酶消化分离脐带组织培养 UMC，应用 组织块贴壁法分离人皮肤成纤维细胞 （ HSF） ，镜下观察 UMC 和 HSF 生长过程。
基金项目： 全军医药卫生科研基金项目（ No. 08Z017 ） ； 科学技术部 867 计划项目（ No. 2006AA02A141）
1 南方医科大学 2 南方医科大学再生医学研究所 通讯作者： 张清华（ 1950-） ，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事
老年冠心病研究。 第一作者： 蒋知新（ 1963-） ，男，主任医师，硕士生导师，主要从事老年病
研究。
液（ PBS） 、10% 明胶（ 10% Gelatin） 、青霉素-链霉素溶液等。 1. 2 方法 1. 2. 1 UMC 原代培养〔3 ～ 5〕 手术切取脐带，PBS 液清洗，剪碎 组织，加 Collagenase Ⅳ（ 2 mg / ml） 混匀消化 4 h，离心弃上清液。 加 DNase Ⅰ （ 1 mg / ml） 混匀消化 15 min，离心弃上清液。加 0. 25% 胰酶 消 化 15 min，离 心 弃 上 清 液，添 加 UMC 培 养 液 （ DMEM / F12 + 10% FBS） ，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 2 HSF 原代培养 切取患者上臂内侧 2 cm2 皮肤组织 块，PBS 清洗，组织切碎至 0. 5 ～ 1. 0 mm2 ，转移铺有明胶的培养 皿中，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 3 细胞传代 细胞生长密度达 95% ～ 100% 时进行传代。 应用 PBS 清洗细胞，添加 0. 05% 胰酶消化 2 min。终止胰酶消 化，离心弃上清液。添加培养液重悬细胞，根据细胞计数情况 按比例将其接种至培养皿中，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 4 细胞冻存 冻存方法与细胞传代基本相同，但是离心 弃上清 液 后，添 加 细 胞 冻 存 液〔二 甲 基 亚 砜 （ DMSO） + 10% FBS〕重悬细胞分装至冻存管，在 － 80℃ 冰箱过夜，第 2 天转移 到液氮中保存。