体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞
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2结果 2. 1 UMC 形态 酶消化分离脐带组织，第 2 天镜下可见少量 细胞贴壁生 长； 第 7 天 细 胞 大 小 不 一、形 态 不 规 则； 第 10 天 UMC 细胞数量增多，呈短棒状、长梭形、三角形，有突起，胞膜有 折光性，类似于成纤维细胞； 第 15 天 UMC 生长密度超过 95% ， 呈平行或漩涡状排列生长。见图 1。
1 材料与方法 1. 1 标本和主要试剂 脐带组织来源于南方医科大学第二临 床学院产科足月妊娠正常分娩的新生儿； 皮肤组织来源于南方 医科大学第二临床学院心血管内科患者。收集组织前经广州 市卫生研究院伦理委员会批准，患者及其家属同意签字后方可 进行。 高 糖 型 DMEM、DMEM / F12、10% 胎 牛 血 清 白 蛋 白 （ FBS） 、Ⅳ型胶原蛋白酶（ Collagenase Ⅳ） 、Ⅰ型脱氧核糖核酸 酶（ DNase Ⅰ） 、0. 25% 胰蛋白酶 （ 0. 25% Trypsin） 、磷酸盐缓冲
体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞
蒋知新 艾 民1 张清华 沙 杭 高 毅2 卢 海1 （ 中国人民解放军三 0 五医院，北京 100017）
来自百度文库
〔摘 要〕 目的 探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞（ UMC） 和人皮肤成纤维细胞（ HSF） 的方法。方法 用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核 糖核酸酶和 0. 25% 胰蛋白酶消化法原代分离培养 UMC 细胞，用组织块贴壁法原代分离培养 HSF 细胞，镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果
脐带组织分离培养第 3 天，有少量 UMC 贴壁生长，细胞膜周围有折光性，形态类似于成纤维细胞； 皮肤组织块贴壁培养第 7 天，有 HSF 爬出，呈长 梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长，UMC 和 HSF 数量逐渐增多，细胞生长状态良好。结论 应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培 养出 UMC 和 HSF。
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2. 2 HSF 皮肤组织块贴壁培养，第 3 天镜下可见部分组织 块周围爬出角质细胞； 第 5 天有少量脂肪细胞； 第 8 天可见少 量 HSF 爬出。随着细胞培养时间延长，HSF 数量逐渐增多，形
中国老年学杂志 2012 年 10 月第 32 卷
态呈长梭形、多边形或不规则三角形，胞核呈卵圆形； 第 16 天 部分 HSF 细胞生长密度超过 95% ，呈放射状、栅栏状或漩涡状 排列。见图 2。
〔关键词〕 细胞培养； 脐带基质间充质细胞； 人皮肤成纤维细胞 〔中图分类号〕 R39 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（2012）19-4193-02；doi：10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 19. 040
2006 年日本京都大学 Yamanaka 研究小组首先将小鼠成纤 维细胞 重 编 程 为 类 似 于 胚 胎 样 干 细 胞 （ ES ） ，简 称“iPS 细 胞”〔1〕，2009 年我国学者将基质间充质细胞 （ UMC） 细胞成功 的诱导为 iPS 细胞，并进一步向神经细胞分化〔2〕，获取可靠来 源的体细胞是细胞重编程的首要环节之一。本实验于 2011 年 2 月 20 日至 2011 年 4 月 25 日利用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧 核糖核酸酶和 0. 25% 胰酶消化分离脐带组织培养 UMC，应用 组织块贴壁法分离人皮肤成纤维细胞 （ HSF） ，镜下观察 UMC 和 HSF 生长过程。
研究。
液（ PBS） 、10% 明胶（ 10% Gelatin） 、青霉素-链霉素溶液等。 1. 2 方法 1. 2. 1 UMC 原代培养〔3 ～ 5〕 手术切取脐带，PBS 液清洗，剪碎 组织，加 Collagenase Ⅳ（ 2 mg / ml） 混匀消化 4 h，离心弃上清液。 加 DNase Ⅰ （ 1 mg / ml） 混匀消化 15 min，离心弃上清液。加 0. 25% 胰酶 消 化 15 min，离 心 弃 上 清 液，添 加 UMC 培 养 液 （ DMEM / F12 + 10% FBS） ，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 2 HSF 原代培养 切取患者上臂内侧 2 cm2 皮肤组织 块，PBS 清洗，组织切碎至 0. 5 ～ 1. 0 mm2 ，转移铺有明胶的培养 皿中，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 3 细胞传代 细胞生长密度达 95% ～ 100% 时进行传代。 应用 PBS 清洗细胞，添加 0. 05% 胰酶消化 2 min。终止胰酶消 化，离心弃上清液。添加培养液重悬细胞，根据细胞计数情况 按比例将其接种至培养皿中，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 4 细胞冻存 冻存方法与细胞传代基本相同，但是离心 弃上清 液 后，添 加 细 胞 冻 存 液〔二 甲 基 亚 砜 （ DMSO） + 10% FBS〕重悬细胞分装至冻存管，在 － 80℃ 冰箱过夜，第 2 天转移 到液氮中保存。
图 1 原代分离培养 UMC（ × 100）
图 2 原代分离培养 HSF 细胞（ × 100）
3讨论 体外原代分离培养细胞常用酶消化培养法和（ 或） 组织块
贴壁培养法两种，这 两 种 方 法 各 有 利 弊，应 根 据 细 胞 种 类 和 生 长特点，选择不同的细胞分离培养方法。脐带应用 Collagenase Ⅳ、DNase Ⅰ、0. 25% 胰酶消化分离，可获得原代培养的 UMC。 第 2 天镜下可见少量的悬浮细胞贴壁生长，细胞形态呈短棒 状、有突起、胞膜有折光性； 随着培养时间的延长，细胞数量增 多，细胞形态多样、大小不一，但是多数细胞形态呈梭形、棒状、 三角形、锥形，而宽大、扁平、不规则形状的细胞数量相对较少； 第 15 天 UMC 细胞生长密度达 95% 左右，进行第一次细胞传代 培养和冻存。随着细胞培养时间的延长和细胞代数的增加，细 胞形态趋于单一，类 似 于 成 纤 维 细 胞，那 些 宽 大、扁 平、不 规 则 形状细胞明显减少，可能为衰老的细胞，UMC 对数生长期一般 为 3 ～ 5 d。
基金项目： 全军医药卫生科研基金项目（ No. 08Z017 ） ； 科学技术部 867 计划项目（ No. 2006AA02A141）
1 南方医科大学 2 南方医科大学再生医学研究所 通讯作者： 张清华（ 1950-） ，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事
老年冠心病研究。 第一作者： 蒋知新（ 1963-） ，男，主任医师，硕士生导师，主要从事老年病
1 材料与方法 1. 1 标本和主要试剂 脐带组织来源于南方医科大学第二临 床学院产科足月妊娠正常分娩的新生儿； 皮肤组织来源于南方 医科大学第二临床学院心血管内科患者。收集组织前经广州 市卫生研究院伦理委员会批准，患者及其家属同意签字后方可 进行。 高 糖 型 DMEM、DMEM / F12、10% 胎 牛 血 清 白 蛋 白 （ FBS） 、Ⅳ型胶原蛋白酶（ Collagenase Ⅳ） 、Ⅰ型脱氧核糖核酸 酶（ DNase Ⅰ） 、0. 25% 胰蛋白酶 （ 0. 25% Trypsin） 、磷酸盐缓冲
体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞
蒋知新 艾 民1 张清华 沙 杭 高 毅2 卢 海1 （ 中国人民解放军三 0 五医院，北京 100017）
来自百度文库
〔摘 要〕 目的 探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞（ UMC） 和人皮肤成纤维细胞（ HSF） 的方法。方法 用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核 糖核酸酶和 0. 25% 胰蛋白酶消化法原代分离培养 UMC 细胞，用组织块贴壁法原代分离培养 HSF 细胞，镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果
脐带组织分离培养第 3 天，有少量 UMC 贴壁生长，细胞膜周围有折光性，形态类似于成纤维细胞； 皮肤组织块贴壁培养第 7 天，有 HSF 爬出，呈长 梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长，UMC 和 HSF 数量逐渐增多，细胞生长状态良好。结论 应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培 养出 UMC 和 HSF。
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2. 2 HSF 皮肤组织块贴壁培养，第 3 天镜下可见部分组织 块周围爬出角质细胞； 第 5 天有少量脂肪细胞； 第 8 天可见少 量 HSF 爬出。随着细胞培养时间延长，HSF 数量逐渐增多，形
中国老年学杂志 2012 年 10 月第 32 卷
态呈长梭形、多边形或不规则三角形，胞核呈卵圆形； 第 16 天 部分 HSF 细胞生长密度超过 95% ，呈放射状、栅栏状或漩涡状 排列。见图 2。
〔关键词〕 细胞培养； 脐带基质间充质细胞； 人皮肤成纤维细胞 〔中图分类号〕 R39 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（2012）19-4193-02；doi：10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 19. 040
2006 年日本京都大学 Yamanaka 研究小组首先将小鼠成纤 维细胞 重 编 程 为 类 似 于 胚 胎 样 干 细 胞 （ ES ） ，简 称“iPS 细 胞”〔1〕，2009 年我国学者将基质间充质细胞 （ UMC） 细胞成功 的诱导为 iPS 细胞，并进一步向神经细胞分化〔2〕，获取可靠来 源的体细胞是细胞重编程的首要环节之一。本实验于 2011 年 2 月 20 日至 2011 年 4 月 25 日利用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧 核糖核酸酶和 0. 25% 胰酶消化分离脐带组织培养 UMC，应用 组织块贴壁法分离人皮肤成纤维细胞 （ HSF） ，镜下观察 UMC 和 HSF 生长过程。
研究。
液（ PBS） 、10% 明胶（ 10% Gelatin） 、青霉素-链霉素溶液等。 1. 2 方法 1. 2. 1 UMC 原代培养〔3 ～ 5〕 手术切取脐带，PBS 液清洗，剪碎 组织，加 Collagenase Ⅳ（ 2 mg / ml） 混匀消化 4 h，离心弃上清液。 加 DNase Ⅰ （ 1 mg / ml） 混匀消化 15 min，离心弃上清液。加 0. 25% 胰酶 消 化 15 min，离 心 弃 上 清 液，添 加 UMC 培 养 液 （ DMEM / F12 + 10% FBS） ，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 2 HSF 原代培养 切取患者上臂内侧 2 cm2 皮肤组织 块，PBS 清洗，组织切碎至 0. 5 ～ 1. 0 mm2 ，转移铺有明胶的培养 皿中，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 3 细胞传代 细胞生长密度达 95% ～ 100% 时进行传代。 应用 PBS 清洗细胞，添加 0. 05% 胰酶消化 2 min。终止胰酶消 化，离心弃上清液。添加培养液重悬细胞，根据细胞计数情况 按比例将其接种至培养皿中，置于 37℃ ，5% CO2 培养箱培养。 1. 2. 4 细胞冻存 冻存方法与细胞传代基本相同，但是离心 弃上清 液 后，添 加 细 胞 冻 存 液〔二 甲 基 亚 砜 （ DMSO） + 10% FBS〕重悬细胞分装至冻存管，在 － 80℃ 冰箱过夜，第 2 天转移 到液氮中保存。
图 1 原代分离培养 UMC（ × 100）
图 2 原代分离培养 HSF 细胞（ × 100）
3讨论 体外原代分离培养细胞常用酶消化培养法和（ 或） 组织块
贴壁培养法两种，这 两 种 方 法 各 有 利 弊，应 根 据 细 胞 种 类 和 生 长特点，选择不同的细胞分离培养方法。脐带应用 Collagenase Ⅳ、DNase Ⅰ、0. 25% 胰酶消化分离，可获得原代培养的 UMC。 第 2 天镜下可见少量的悬浮细胞贴壁生长，细胞形态呈短棒 状、有突起、胞膜有折光性； 随着培养时间的延长，细胞数量增 多，细胞形态多样、大小不一，但是多数细胞形态呈梭形、棒状、 三角形、锥形，而宽大、扁平、不规则形状的细胞数量相对较少； 第 15 天 UMC 细胞生长密度达 95% 左右，进行第一次细胞传代 培养和冻存。随着细胞培养时间的延长和细胞代数的增加，细 胞形态趋于单一，类 似 于 成 纤 维 细 胞，那 些 宽 大、扁 平、不 规 则 形状细胞明显减少，可能为衰老的细胞，UMC 对数生长期一般 为 3 ～ 5 d。
基金项目： 全军医药卫生科研基金项目（ No. 08Z017 ） ； 科学技术部 867 计划项目（ No. 2006AA02A141）
1 南方医科大学 2 南方医科大学再生医学研究所 通讯作者： 张清华（ 1950-） ，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事
老年冠心病研究。 第一作者： 蒋知新（ 1963-） ，男，主任医师，硕士生导师，主要从事老年病