鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究_李书丰

1 材料与仪器 1.1 主要材料
鸡蛋清 溶壁小球菌 724大孔弱酸性阳离子 交换树脂 羧甲其纤维素CMC 标准溶菌酶（酶活 力＞10000单位/mg） 牛肉浸膏 蛋白胨 NaCl(分 析纯) 琼脂 其它试剂均为分析纯 1.2 主要仪器
超净工作台 隔水式电热恒温培养箱 CHS-S 恒温振荡器
AE16电子分析平 G&G系列电子天平 FN 101-2A型鼓风干燥器
滴管滴加0.5N氢氧化钠调pH至4.5，注意应慢慢
滴加，同时用玻璃棒缓慢搅拌，以防局部过碱
使蛋白质变性。离心除去等电点在4左右的杂蛋
白，最后调pH到中性，使上清液在布氏漏斗中抽
滤。滤液应颜色透亮，澄清无杂质，收集滤液约
为600mL。
3 溶菌酶的分离纯化 实验采用724弱酸大孔阳离子交换树脂对蛋
清中溶菌酶进行吸附，再用洗脱液对树脂进行洗 脱，从而得到含溶菌酶的洗脱液。 3.1 离子交换树脂和缓冲液的选择
4.2 浓缩、脱盐 将样品盛入容器内，打开容器流出阀；调节
泵速至输出压力为20psi，缓慢顺时针调节截留阀 至截留压力为10psi；再调节泵速和截留阀，以获 得所需压力，超滤至所需体积或浓度后，关泵； 取下泵输出管放入一三角瓶；取下截留管，液体 会受重力排干。共收集浓缩液50mL。 4.3 冻干溶菌酶 4..3.1 速冻处理
时间延长，杂蛋白去除率增大，但溶菌酶活力降
低，综合考虑到去除杂蛋白的效果和溶菌酶的不
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2011.4(总第163期）
科研生产 山东食品发酵
失活，选择以下参数为最佳：
表2 预处理最佳条件
稀释倍数
热变性温度
热变性时间
2倍
75℃
5min
2.1.3 实验步骤
山东食品发酵 科研生产
2011.4(总第163期）
鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究
李书丰
（德州职业技术学院粮油食品系 山东 德州 253034）
摘 要：以新鲜鸡蛋清为原料，以溶壁小球菌的菌悬液为底物检测溶菌酶的活力。根据溶菌酶具有耐热性、等电点较高的 特点，先用1% N a C l 进行盐溶，再采用热变性（75℃，3 m i n）和等电点沉淀（4.5）法除去蛋清中大量杂蛋白，然后用7 24弱酸阳 离子树脂从蛋清液中吸附提 取 溶菌酶，起 始缓冲液 为1/15（m o l/ L）、p H 6.64的磷酸缓冲液 。再用10 %（N H 4）2S O 4溶液 进行 洗脱，采用超滤法对洗脱液进行脱盐、浓缩，再经冷冻干燥得到溶菌酶产品。采用CMC羧甲基纤维素对洗脱液进行分析 检测。 关键词：溶菌酶 蛋清 724树脂吸附 超滤 冻干
3.3.2 实验步骤 3.3.2.1 树脂装柱：
a 玻璃柱规格：φ2.6×60（cm），装柱时 交换树脂在柱内必须均匀，严防有节和气泡产 生。所谓“节”是指树脂在柱内有明显的分界 线，这是由于装柱不均匀树脂时松时紧之故。
ｂ 装柱的高度和直径比在10:1到20:1之间， 不超过柱高的2/3。
ｃ 最后用pH=6.64(25℃)1/15(mol/l)的磷酸缓 冲溶液平衡过后，备用。 3.3.2.2 连接装置：在使用前检测仪要开机稳定约 1h，待基线平直后可加样测试，把检测器出样口 接到部分收集器上，使层析柱的液体流过。
2.1.3.1 鉴别质量：鸡蛋清的稠度是最重要的指标
之一，蛋清pH的升高导致稠厚蛋清凝胶结构的破
坏。所以，蛋清的起始pH应在7～9左右。颜色、
气味无异常。
收集700mL蛋清，测其pH值为8.1（25℃），
用单层纱布过滤掉蛋清中的脐带块和碎蛋壳。
2.1.3.2 按4%柠檬酸、2%NaCl的浓度关系向
700mL蒸馏水中加入28g柠檬酸和14gNaCl，然后
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2 以蛋清为原料的制备工艺 溶菌酶的提取工艺流程
2.1 鸡蛋清的预处理工艺 2.1.1 原理
鸡蛋清中所含的蛋白质种类很多，除含有溶 菌酶外，还混有其它蛋白质。但是与这些蛋白质 相比，溶菌酶具有耐热性，它在酸性条件下能经 受较长时间的高温处理而不丧失活性，并且溶菌 酶又有特别高的等电点。因此，用热变性和等电
合并洗脱峰处的洗脱液，浓缩10倍后进行真 空冷冻干燥。 3.2 离子交换树脂的使用
724大孔弱酸性阳离子交换树脂的预处理、 转型 3.2.1 预处理：新买的树脂使用前的处理过程如 下
新出厂的树脂→水浸泡24h→倾去水后洗至 澄清→除去水后加2~3倍量2mol/lHCl→搅拌（或 梳洗）2h →除酸后水洗至中性→除水后加2~3倍 量2mol/l NaOH→搅拌（或梳洗）2h→除碱水洗 至中性备用 3.2.2 转型：本实验使用的是弱酸性离子交换树 脂，选择4~5倍量的2mol/l NaOH转型处理，然后 用蒸馏水洗至中性，即成为Na型树脂，最后用 pH=6.46(26.9℃)1/15（mol/l）的磷酸缓冲溶液平 衡过后即可使用。 3.3 上柱吸附 3.3.1 实验装置如图：
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3.3.2.3 上柱吸附：将600mL蛋清液在室温下用恒
流泵在一定流速下，泵入柱内进行吸附。
下面是对上样速度所做的几组实验
表格2 上样速度对吸附效果的影响
树脂体积 （mL）
233.5
221
经过前处理的酶液需要进行冻结后再升华干 燥，冻结温度必须低于酶液的相点温度。需要速 冻，冻结越快，酶制品中结晶越小，对其结构破 坏越小。 4..3.2 真空干燥
冷冻后的酶制品必须迅速进行真空升华干 燥，在升华过程中，由于酶制品中的溶剂不断升 华将热带走，因此，在整个升华过程中需要给升 华供热，来维持升华温度不变。
10mL，通过核酸蛋白检测仪检测溶液，当洗脱
液中无明显蛋白质时，停止洗脱。对含有蛋白质
的各管，要进行酶活力测定，从而确定酶峰，合
并酶峰部分的洗脱液，留样待用。
4 超滤方法脱盐、浓缩 4.1 超滤的原理
超滤的截留分子量（500Da以上）范围正好 是生物大分子所处的范围，超滤器的工作原理如 图，即在一定的压力作用下，当含有大、小分子 物质混合的溶液流过被支撑的膜表面时，溶剂和 小分子溶质（如无机盐）将透过膜，作为滤液被 收集起来，大分子溶质在被滤膜截留而作为浓缩 液被回收。
表1 预处理工艺条件的确定
加热时间 (min)
加热温度(℃)
蛋白质含量 （μg/mL）
溶菌酶活力 (u/mL)
70
4316
931
3
75
4253
898
80
4124
823
70
4211
920
4
75
4165
856
80
3926
782
70
4063
897
5
75
3455
820
3129
734
从表中可以看出，随着加热温度升高，加热
泵速
10×10（约 2.5mL/min）
8×10
吸附时间 （min）
77
95
最大吸附量 （mL）
wenku.baidu.com76
90
221
6×10
142
97
由上表可知，流速越慢，吸附效果越好，可
是耗时越长，所以在实验中确定吸附时泵速为
8×10mL/min。
3.4 洗脱
洗脱步骤：洗脱前应先用足够量的起始缓冲
液洗去未吸附的组分，然后才用10%(NH4)2SO4 开始正式洗脱，用部分收集器收集洗脱液，每管
点沉淀相结合的方法可除去大部分杂蛋白，去除 蛋清的粘度，使溶菌酶得到初步的分离和纯化。 2.1.2 预处理条件的确定
预处理的工艺流程：
为了得到蛋清液最佳的加热温度和时间，对 这几个因数作如下实验：
将蛋清用等量的2% NaCl溶液稀释后,调节 pH=3，加热，然后用流动水冷却，离心去掉杂蛋 白后，测定不同处理方法的蛋清液中蛋白质含量 和溶菌酶活力，结果如下：
参考树脂的类型与性能表，确定选择724弱 酸性大孔阳离子交换树脂作为本次实验的交换 剂，其官能团为－COOH，形状为球状，粒度为 16~50目，含水量≥60%，全交换量≥9mmol/g，最 高操作温度（Na＋与H+）150~190℃，允许pH范 围5~14，树脂母体或原料为聚丙烯酸；缓冲液选 择1\15(mol/l)，pH为6.64的磷酸缓冲液。
将该盐溶液与蛋清混合均匀，这时会出现絮状蛋
白沉淀。
2.1.3.3 将上述蛋清液放入75℃水浴锅中进行加热，
维持5min，这时有大量杂蛋白沉淀出来。立刻用流
动水将蛋清液迅速冷却至30℃以下。
2.1.3.4 在4000rpm离心10min，收集上清液约为
600mL，测其pH值为3.11温度25℃，慢慢用胶头
5 实验结果及讨论
表格3 溶菌酶的提取分离结果
测定项目
纯 化 步 骤
总 体 积
mL
酶浓 度 mg/
mL
蛋白 质浓 度
mg/
mL
酶活 力 U/
mg
总酶 活力
U
总蛋 白量
mg
比活 力
回收 率
%
纯化 倍数
原 蛋 700 1.47 97 873 10592 67900 0.156 100 1 清
预 处 600 1.50 19.8 898 8565 11880 0.721 80.5 4.6 理
洗 脱
500
5.63
7.2 3309 2901
3600 0.806 33.8
1.1
超 滤
50 15.44 5600 5600
57
70 0.815 2.0 1.0
为：以鸡蛋清为原料，预处理过程在 pH=3.3，1%NaCl盐溶液中进行。根据溶菌酶耐 温、等电点高、酸性条件下稳定性好的特点，采 用热变性和等电点沉淀的方法除去大量杂蛋白， 处理后的蛋清液用724树脂进行溶菌酶吸附，然 后用10%(NH4)2SO4溶液将树脂上的溶菌酶洗脱下 来；洗脱液用超滤法进行脱盐、浓缩，再经冷冻 干燥得到溶菌酶产品。