微生物学检验(第3版)2012肺炎克雷伯与痰液标本检查
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➢ 如不能直接确定菌属或种的细菌，可报告 “痰液涂片查见革兰×性×菌”。如果痰片 中均为鳞状上皮细胞，则应视为不合格标本。
痰液标本检验操作流程
3、分离培养： 1）痰液标本的前处理
❖ A. 均质化法：加入等量的PH 7.6 的1% 胰 酶溶液，放置35℃、90 min使痰液均质化；
❖
痰液标本检验操作流程
革兰阴性细菌
除脑膜炎和淋病奈瑟 菌外的其他奈瑟菌、 其他嗜血杆菌
脑膜炎奈瑟菌、流感 嗜血杆菌、百日咳鲍 特菌、肺炎克雷伯菌、 大肠埃希菌、铜绿假 单胞菌
脑膜炎奈瑟菌、流感 嗜血杆菌、肺炎克雷 伯菌、大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌、产气 肠杆菌、嗜肺军团菌
直接涂片染色检 查 革兰染色 异染颗粒
初步报告
检验程序
❖ B. 洗涤法：取无菌平皿4个，加入无菌生 理盐水20ml ，将痰液标本放入第1个平皿中， 用接种环用力震摇，将脓痰分散为小块悬浮 于盐水内，将小块脓痰取出依次放入第2、3、 4个平皿中重复以上操作。最后在第4个平皿 收集脓痰小块，接种于平皿。同时接种未经 洗涤的痰液标本，作为对照。
痰液标本检验操作流程
鼻咽拭子
常规培养
血平板 巧克力平板 中国蓝平板
白喉棒状杆菌培养
血清斜面培养基 鸡蛋培养基
百日咳杆菌培养 鲍-金培养基
菌落形态、涂片染色 初步报告
亚碲酸钾血平板纯培养
菌落形态、涂片染色 生化反应、血清学鉴定
肉眼观察 涂片染色观察
初步报告
检验程序
痰液标本
血平板
普通培养 35℃、18~24h
培养前处理
巧克力平板
痰液标本检验操作流程
➢ 2、涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂 片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。
➢ 如发现形态典型、有特殊结构，初步可以 确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。
➢ 如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报 告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄 状”；
痰液标本检验操作流程
➢ 如查见革兰阳性双球菌、矛头状、有明显 荚膜时，可报告“痰液涂片查见革兰阳性双 球菌，形似肺炎球菌”。
器材和试剂
❖ 1、标本：痰液标本 ❖ 2、菌种：肺炎克雷伯菌 ❖ 3、培养基：血平板、中国蓝平板、克氏
双糖斜面培养基、半固体培养基、微量生 化管等。
器材和试剂
❖ 4、试剂：氧化酶纸片、3%过氧化氢、革 兰染色液、无菌生理盐水及生化管配套试剂。
❖ 5、其它 ：显微镜、培养箱、小试管、载 玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、非 发酵菌生化编码表等。
Biblioteka Baidu
结果报告
❖ 1.如发现可疑致病菌落，则进行涂片染色观察、 生化反应及血清学鉴定得出报告“检出x x细菌， 并报告该菌在培养基中的大慨比例”；
❖ 2.如无致病菌落生长，则继续培养至48h，平板 上均为咽部正常菌群生长，无可疑致病菌落生长， 则报告“正常菌群生长”；
（3）气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。
痰液标本常见的分离菌
正常菌群
上呼吸道 常见致 病菌
下呼吸道 常见致 病菌
革兰阳性细菌
α和γ链球菌、微球菌、 表皮葡萄球菌、四联球 菌、白喉以外的棒状杆 菌、乳杆菌
化脓性链球菌、金黄色 葡萄球菌、白喉棒状杆 菌、结核分枝杆菌、白 色念珠菌
化脓性链球菌 、金黄色 葡萄球菌、肺炎链球菌、 白喉棒状杆菌、结核分 枝杆菌、厌氧菌、放线 菌、奴卡菌
普通培养 35℃、18~24h
中国蓝平板
普通培养 35℃、18~24h
菌落形态和涂片染色 生化反应、血清学鉴定
报告
痰液标本检验操作流程
➢ 1、肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选 取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶 臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可 能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块 和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感 染有关。
标本的采集
3. 痰液标本
（1）自然咳痰法：受检者用清水溯口数次后， 用力咳嗽自气管深部将痰咳出吐至无菌容器中。 对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸入
45℃左右的10%氯化钠水溶液，使痰容易排出。
对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部气管，使其咳 嗽而取之。
标本的采集
（2）气管镜采集法：用气管镜在肺部内病灶处直 接吸取标本，或用气管刷采取标本。
标本的采集
1. 鼻咽拭子
采集时，患者用清水漱口，对光而坐，头向 上仰张大口，用压舌板轻压舌根，取无菌鼻咽拭子 绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次 小心取出，避免接触口腔部其他组织。
2．咽拭子 将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌
根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后 弃去，再取1支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压 出的分泌物，或擦取伪膜等病变部位。
肺炎克雷伯菌革兰染色
肺炎克雷伯菌荚膜染色
肺炎克雷伯菌的菌落特征（血琼脂平板）
肺炎克雷伯菌的菌落特征（MAC）
肺炎克雷伯菌粘丝试验
肺炎克雷伯菌KIA（A A＋＋ ）、MIU（－－＋）
目的要求
❖ 掌握呼吸道标本的细菌学检验和报告方法 ❖ 掌握肺炎克雷伯菌的培养特征、主要微生
物特性及鉴定方法。 ❖ 了解呼吸道标本的采集方法。
❖ 2.嗜肺军团菌培养：取气管分泌物接种于活性炭酵 母琼脂(CYE)或费-高(F-G)平板，35℃、2.5%CO2培 养，每天用肉眼观察，直至第14天；
❖ 3.百日咳鲍特菌的培养：将标本直接接种在鲍-金 培养基上，置有盖的玻璃缸（缸内加少量的水，并 在水中加少许硫酸铜，防止细菌及霉菌生长）中， 35℃ 孵育3—5天。
特殊菌的培养
❖ 4. 白喉棒状杆菌培养：将标本接种于血清斜面或 鸡蛋培养基，35℃ 孵育8-10h观察；
❖ 5.流感嗜血杆菌培养：将标本接种于血平板和巧克 力平板，并在平板中央接种一直线金黄色葡萄球菌 （或四角点种），35℃、5%-10% CO2环境孵育1824h。
❖ 6.脑膜炎奈瑟菌培养：将鼻烟拭子接种于已保温在 350C的卵黄双抗平板上，35℃、5%-10% CO2环境孵 育18—24h。
❖ 2）取经过前处理的痰液标本分别接种血平 板、巧克力平板和中国蓝平板。巧克力平板 置5%—10% CO2 环境培养，其他平板于普通 环境35℃孵育18—24h 。根据菌落形态，细 菌染色观察，进一步进行鉴定。
特殊菌的培养
❖ 1.结核分枝杆菌培养：无菌吸管加前处理标本2-3 滴于罗-琴培养基35℃孵育至8周，每周观察一次；
痰液标本检验操作流程
3、分离培养： 1）痰液标本的前处理
❖ A. 均质化法：加入等量的PH 7.6 的1% 胰 酶溶液，放置35℃、90 min使痰液均质化；
❖
痰液标本检验操作流程
革兰阴性细菌
除脑膜炎和淋病奈瑟 菌外的其他奈瑟菌、 其他嗜血杆菌
脑膜炎奈瑟菌、流感 嗜血杆菌、百日咳鲍 特菌、肺炎克雷伯菌、 大肠埃希菌、铜绿假 单胞菌
脑膜炎奈瑟菌、流感 嗜血杆菌、肺炎克雷 伯菌、大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌、产气 肠杆菌、嗜肺军团菌
直接涂片染色检 查 革兰染色 异染颗粒
初步报告
检验程序
❖ B. 洗涤法：取无菌平皿4个，加入无菌生 理盐水20ml ，将痰液标本放入第1个平皿中， 用接种环用力震摇，将脓痰分散为小块悬浮 于盐水内，将小块脓痰取出依次放入第2、3、 4个平皿中重复以上操作。最后在第4个平皿 收集脓痰小块，接种于平皿。同时接种未经 洗涤的痰液标本，作为对照。
痰液标本检验操作流程
鼻咽拭子
常规培养
血平板 巧克力平板 中国蓝平板
白喉棒状杆菌培养
血清斜面培养基 鸡蛋培养基
百日咳杆菌培养 鲍-金培养基
菌落形态、涂片染色 初步报告
亚碲酸钾血平板纯培养
菌落形态、涂片染色 生化反应、血清学鉴定
肉眼观察 涂片染色观察
初步报告
检验程序
痰液标本
血平板
普通培养 35℃、18~24h
培养前处理
巧克力平板
痰液标本检验操作流程
➢ 2、涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂 片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。
➢ 如发现形态典型、有特殊结构，初步可以 确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。
➢ 如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报 告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄 状”；
痰液标本检验操作流程
➢ 如查见革兰阳性双球菌、矛头状、有明显 荚膜时，可报告“痰液涂片查见革兰阳性双 球菌，形似肺炎球菌”。
器材和试剂
❖ 1、标本：痰液标本 ❖ 2、菌种：肺炎克雷伯菌 ❖ 3、培养基：血平板、中国蓝平板、克氏
双糖斜面培养基、半固体培养基、微量生 化管等。
器材和试剂
❖ 4、试剂：氧化酶纸片、3%过氧化氢、革 兰染色液、无菌生理盐水及生化管配套试剂。
❖ 5、其它 ：显微镜、培养箱、小试管、载 玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、非 发酵菌生化编码表等。
Biblioteka Baidu
结果报告
❖ 1.如发现可疑致病菌落，则进行涂片染色观察、 生化反应及血清学鉴定得出报告“检出x x细菌， 并报告该菌在培养基中的大慨比例”；
❖ 2.如无致病菌落生长，则继续培养至48h，平板 上均为咽部正常菌群生长，无可疑致病菌落生长， 则报告“正常菌群生长”；
（3）气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。
痰液标本常见的分离菌
正常菌群
上呼吸道 常见致 病菌
下呼吸道 常见致 病菌
革兰阳性细菌
α和γ链球菌、微球菌、 表皮葡萄球菌、四联球 菌、白喉以外的棒状杆 菌、乳杆菌
化脓性链球菌、金黄色 葡萄球菌、白喉棒状杆 菌、结核分枝杆菌、白 色念珠菌
化脓性链球菌 、金黄色 葡萄球菌、肺炎链球菌、 白喉棒状杆菌、结核分 枝杆菌、厌氧菌、放线 菌、奴卡菌
普通培养 35℃、18~24h
中国蓝平板
普通培养 35℃、18~24h
菌落形态和涂片染色 生化反应、血清学鉴定
报告
痰液标本检验操作流程
➢ 1、肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选 取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶 臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可 能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块 和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感 染有关。
标本的采集
3. 痰液标本
（1）自然咳痰法：受检者用清水溯口数次后， 用力咳嗽自气管深部将痰咳出吐至无菌容器中。 对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸入
45℃左右的10%氯化钠水溶液，使痰容易排出。
对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部气管，使其咳 嗽而取之。
标本的采集
（2）气管镜采集法：用气管镜在肺部内病灶处直 接吸取标本，或用气管刷采取标本。
标本的采集
1. 鼻咽拭子
采集时，患者用清水漱口，对光而坐，头向 上仰张大口，用压舌板轻压舌根，取无菌鼻咽拭子 绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次 小心取出，避免接触口腔部其他组织。
2．咽拭子 将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌
根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后 弃去，再取1支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压 出的分泌物，或擦取伪膜等病变部位。
肺炎克雷伯菌革兰染色
肺炎克雷伯菌荚膜染色
肺炎克雷伯菌的菌落特征（血琼脂平板）
肺炎克雷伯菌的菌落特征（MAC）
肺炎克雷伯菌粘丝试验
肺炎克雷伯菌KIA（A A＋＋ ）、MIU（－－＋）
目的要求
❖ 掌握呼吸道标本的细菌学检验和报告方法 ❖ 掌握肺炎克雷伯菌的培养特征、主要微生
物特性及鉴定方法。 ❖ 了解呼吸道标本的采集方法。
❖ 2.嗜肺军团菌培养：取气管分泌物接种于活性炭酵 母琼脂(CYE)或费-高(F-G)平板，35℃、2.5%CO2培 养，每天用肉眼观察，直至第14天；
❖ 3.百日咳鲍特菌的培养：将标本直接接种在鲍-金 培养基上，置有盖的玻璃缸（缸内加少量的水，并 在水中加少许硫酸铜，防止细菌及霉菌生长）中， 35℃ 孵育3—5天。
特殊菌的培养
❖ 4. 白喉棒状杆菌培养：将标本接种于血清斜面或 鸡蛋培养基，35℃ 孵育8-10h观察；
❖ 5.流感嗜血杆菌培养：将标本接种于血平板和巧克 力平板，并在平板中央接种一直线金黄色葡萄球菌 （或四角点种），35℃、5%-10% CO2环境孵育1824h。
❖ 6.脑膜炎奈瑟菌培养：将鼻烟拭子接种于已保温在 350C的卵黄双抗平板上，35℃、5%-10% CO2环境孵 育18—24h。
❖ 2）取经过前处理的痰液标本分别接种血平 板、巧克力平板和中国蓝平板。巧克力平板 置5%—10% CO2 环境培养，其他平板于普通 环境35℃孵育18—24h 。根据菌落形态，细 菌染色观察，进一步进行鉴定。
特殊菌的培养
❖ 1.结核分枝杆菌培养：无菌吸管加前处理标本2-3 滴于罗-琴培养基35℃孵育至8周，每周观察一次；