小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用与制作流程
图片简介:
本技术提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。
技术要求
1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；
所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；
所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；
所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；
所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。
三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；
优选地，所述PBS的温度为36-37℃；
优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；
优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；
优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；
优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。
4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；
优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；
优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：
(1)结剪断十二指肠韧带；
(2)结扎胆总管；
(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；
(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；
(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；
(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺
(7)结扎后腔静脉；
(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。
括肝组织分离和细胞筛分离；
所述肝组织分离包括如下步骤：将消化灌流后的肝脏分离至麻醉小鼠体外，浸入37℃的PBS溶液中，然后去除肝脏包膜、结缔组织和血管，再用移液器反复吹打，得到小鼠肝脏匀浆液；
所述细胞筛分离包括如下步骤：将所述匀浆液依次过100目、200目和400目细胞筛，得到细胞悬液，对细胞悬液进行固液分离，得到小鼠原代肝细胞；
优选地，所述固液分离方法为离心，所述离心转速为450-550g，离心时间为4-10min，首次离心后再用PBS重悬后离心，重复1-3次；
优选地，所述离心转速为500g；
优选地，所述离心是时间为5min。
6.按照权利要求5所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流采用微量注射泵；
优选地，所述原位灌流的灌流速度为1.2-1.5mL/min。
7.按照权利要求6所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述第一灌流，将第一灌流液灌流至肝脏开始膨胀时，刺破后腔静脉，释放第一灌流液；
优选地，所述第一灌流过程中，轻拍肝脏表面。
8.按照权利要求7所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎后还包括进行留置针放置，所述留置针放置包括如下步骤：
将预置缝线环绕肝门静脉背侧，并用留置针穿刺如肝门静脉，拔除留置针的硬针，然后用预置缝线固定留置针；然后放置肝素帽，并连接头皮针；
优选地，所述腹腔暴露，包括在所述麻醉小鼠腹部行Mercedes手术切口的步骤；
优选地，所述第一灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.7-0.9％、KCl0.03-0.05％、
NaH2PO4﹒2H2O0.007-0.008％、Na2HPO4﹒12H2O0.014-0.016％、EGTA0.018-0.02％、NaHCO30.03-0.04％、HEPES0.023-0.024％、Glucose0.08-0.1％，青-链霉素0.8-1.5％，余量为水；
优选地，所述第一灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.8％、KCl0.04％、
NaH2PO4﹒2H2O0.0078％、Na2HPO4﹒12H2O0.0151％、
EGTA0.019％NaHCO30.035％、HEPES0.238％、Glucose0.09％，青-链霉素1％，余量为水；
优选地，所述第二灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.7-0.9％、KCl0.03-0.05％、
CaCl20.05-0.06％、NaH2PO4﹒2H2O0.007-0.008％、Na2HPO4﹒12H2O0.014-0.016％、HEPES0.23-0.24％、NaHCO30.03-0.04％，青-链霉素0.8-1.5％，余量为水；
优选地，所述第二灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.8％、KCl0.04％、CaCl20.056％、NaH2PO4﹒2H2O0.0078％、Na2HPO4﹒12H2O0.0151％、HEPES0.238％、
NaHCO30.035g，青-链霉素1％，余量为水。
9.按照权利要求1-8任一项所述的小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原代肝细胞。
10.一种权利要求9所述的小鼠原代肝细胞在细胞生物学试验或病毒学试验中的应用；
优选地，所述细胞生物学实验包括：细胞毒性试验、细胞凋亡试验、氧化应激试验、细胞自噬试验或病毒侵染试验。
技术说明书
小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用
技术领域
本技术涉及原代细胞分离技术领域，具体而言，涉及一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用。
背景技术
小鼠原代肝细胞在生命科学技术领域应用广泛，其制备技术是目前许多科学实验中的基本流程，应用非常广泛。
目前，小鼠原代肝细胞的分离方法有以下几种：(1)液氮研磨法：该方法因使用到液氮成本较高，而且研磨时部分组织会粘在研钵和研棒上产生一定的肝组织浪费，同时在液氮研磨过程中经常由于补充液氮不及时可能导致研钵内干涸进而导致细胞受热而活性降低甚至死亡，进一步降低分离制得的原代肝细胞的细胞活性，以及存活肝细胞收率，不适于原代肝细胞的大量在制备。(2)胰酶消化法：该方法应用胰酶成本较高，而且在胰酶消化过程中，经常出现外部细胞消化过度，而内部细胞难以消化的现象，降低了分离制得的原代肝细胞的细胞活性，以及存活肝细胞收率。(3)离体灌流法：该方法在分离肝脏时，容易发生菌类污染，无菌操作不便利，而且经常导致肝被膜破碎，导致灌流失败。此外，灌流时采用后腔静脉进行灌注，后腔静脉较粗，灌流液从较粗血管进入较细的血管的过程中，可能由于灌流液速度和动力发生改变，从而导致肝细胞破损，而且灌流过程中一旦血管破损由于血压过大会导致出血过多，不易于灌流针刺入和结扎，降低实验效率，延长实验时间，时间的延长导致得到的原代肝细胞的活性降低，同时也降低存活肝细胞的收率，而且现有的灌流液经常导致消化不完全，这进一步降低了分离制得的存活肝细胞的收率。
因此，开发一种有效提高分离制得的原代肝细胞的细胞活性，使分离的细胞能够更迅速贴壁，同时能够有效提高存活肝细胞的收率，降低小鼠肝细胞的制备成本，适宜于大量小鼠原代肝细胞的制备，而且不易造成菌类污染的小鼠原代肝细胞分离方法具有重要的科研价值和实际应用价值。
有鉴于此，特提出本技术。
技术内容
本技术的目的之一在于提供小鼠原代肝细胞的分离方法，该方法将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法能有效提高分离的到的小鼠原代细胞的活性，使其贴壁更迅速，原代细胞收率高，适合较大的实验用量需求，并且分离过程中不易产生菌类污染；此外，该方法兼具程序简单，成本低的优势。
本技术目的之二在于提供上述小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原代肝细胞。
本技术的目的之三在于提供上述小鼠原代肝细胞在细胞生物学试验或病毒学试验中的应用。
为了实现本技术的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；
原位三步灌流依次包括第一灌流灌流，第二灌流和第三灌流；
第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；
第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；
第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
优选地，在本技术方案基础上，原位灌流的灌流血管为肝门静脉。
优选地，在本技术方案基础上，第三灌流，用第三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；
优选地，PBS的温度为36-37℃；
优选地，小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的 PBS预热小鼠肝脏的步骤；
优选地，第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；
优选地，IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；
优选地，第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。
优选地，在本技术方案基础上，肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；
优选地，肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；
优选地，肝周管结扎包括如下步骤：
(1)结剪断十二指肠韧带；
(2)结扎胆总管；
(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；
(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；
(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；
(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺 (7)结扎后腔静脉；
(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。
优选地，在本技术方案基础上，细胞分离依次包括肝组织分离和细胞筛分离；
肝组织分离包括如下步骤：将消化灌流后的肝脏分离至麻醉小鼠体外，浸入37℃的PBS 溶液中，然后去除肝脏包膜、结缔组织和血管，再用移液器反复吹打，得到小鼠肝脏匀浆液；
细胞筛分离包括如下步骤：将匀浆液依次过100目、200目和400目细胞筛，得到细胞悬液，对细胞悬液进行固液分离，得到小鼠原代肝细胞；
优选地，固液分离方法为离心，所述离心转速为450-550g，离心时间为4-10min，首次离心后再用PBS重悬后离心，重复1-3次；
优选地，离心转速为500g；
优选地，离心是时间为5min。
优选地，在本技术方案基础上，原位灌流采用微量注射泵；
优选地，原位灌流的灌流速度为1.2-1.5mL/min。
优选地，在本技术方案基础上，第一灌流，将第一灌流液灌流至肝脏开始膨胀时，刺破后腔静脉，释放第一灌流液；
优选地，第一灌流过程中，轻拍肝脏表面。
优选地，在本技术方案基础上，肝周管结扎后还包括进行留置针放置，留置针放置包括如下步骤：
将预置缝线环绕肝门静脉背侧，并用留置针穿刺如肝门静脉，拔除留置针的硬针，然后用预置缝线固定留置针；然后放置肝素帽，并连接头皮针；
优选地，腹腔暴露，包括在麻醉小鼠腹部行Mercedes手术切口的步骤；
优选地，第一灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.7-0.9％、KCl0.03-0.05 ％、
NaH2PO4·2H2O0.007-0.008％、Na2HPO4·12H2O0.014-0.016％、EGTA0 .018-0.02％、NaHCO30.03-0.04％、HEPES0.023-0.024％、Glucose0.08-0.1％，青-链霉素0.8-1.5％，余量为水。
优选地，第一灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.8％、KCl0.04％、NaH2P
O4·2H2O0.0078％、Na2HPO4·12H2O0.0151％、EGTA0.019％NaHCO30.035 ％、HEPES0.238％、Glucose0.09％，青-链霉素1％，余量为水；
优选地，第二灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.7-0.9％、KCl0.03-0.05 ％、CaCl20.05-0.06％、NaH2PO4·2H2O0.007-0.008％、Na2HPO4·12H2O0.014- 0.016％、HEPES0.23-0.24％、NaHCO30.03-0.04％，青-链霉素0.8-1.5％，余量为水；
优选地，第二灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.8％、KCl0.04％、CaCl20.056％、NaH2PO4·2H2O0.0078％、Na2HPO4·12H2O 0.0151％、HEPES0 .238％、
NaHCO30.035g，青-链霉素1％，余量为水。
第二方面，提供了小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原代肝细胞。
第三方面，提供了小鼠原代肝细胞在细胞生物学试验或病毒学试验中的应用；
优选地，细胞生物学实验包括：细胞毒性试验、细胞凋亡试验、氧化应激试验、细胞自噬试验或病毒侵染试验。
与已有技术相比，本技术具有如下有益效果：
(1)本技术的小鼠原代肝细胞的分离方法，该方法采用原位三步灌流对小鼠肝脏进行灌流，原位灌流相对于现有技术中的离体灌流不易造成菌类污染，不易造成肝被膜的破坏，灌流成功率高，有效降低成本；此外，本技术采用三步灌流的方式对小鼠肝脏进行灌流，依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流。该方法相对于现有技术，将灌流分为三步，第二灌流过程中去除抗凝剂，并初步消化，第三灌流过程中进一步消化，这种灌流方式细胞消化效果更好，有效缓解了细胞过度消化和消化不充分的现象，分离制得的原代肝细胞的细胞活性得到提高，分离的肝细胞能够更迅速贴壁，配合原位灌流的方法，更有效提高存活肝细胞的收率。此外，该方法能够一次性获得大量的原代肝细胞，适合较大规模的实验应用，并且兼具程序简单，成本低的优势。
(2)本技术的小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原代肝细胞贴壁迅速，细胞活性高；本技术的小鼠原代肝细胞能够在细胞生物学试验或病毒学试验中应用。
附图说明
图1为本技术实施例1暴露肝门静脉图；
图2为本技术实施例1肝门静脉灌流图；
图3为本技术实施例1制得的小鼠原代肝细胞12h贴壁图；
图4为本技术对比例1制得的小鼠原代肝细胞12h贴壁图；
图5为本技术对比例2制得的小鼠原代肝细胞12h贴壁图；
图6为本技术实施例1制得的原代细胞在试验例中对照组及1、10、 100、1000nM T-2剂量组培养24h的细胞活性(％)；
图7为本技术对比例1制得的原代细胞在试验例中对照组及1、10、100、1000nM T-2剂量组培养24h的细胞活性(％)；
图8为本技术对比例2制得的原代细胞在试验例中对照组及1、10、 100、1000nM T-2剂量组培养24h的细胞活性(％)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不应视为限制本技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
根据本技术的第一方面，提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；
原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；
第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；
第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；
第三灌流，用第三灌流液进一步消化。
腹腔暴露，即暴露出小鼠腹腔，进而暴露小鼠肝脏的过程；肝周血管结扎，是指将肝脏周围不用于灌流的主要血管进行结扎，进而对后续灌流过程灌流液的流向进行一定的控制；原位三步灌流，原位是相对离体灌流而言，是不取下肝脏直接进行灌流的方法，三步灌流是指灌流过程分为三个步骤，分别用不同的灌流液进行灌流，即第一灌流，第一灌流液中含有抗凝剂，防止血液凝固，抗凝同时去除红细胞的灌流过程，第一灌流液流经小鼠肝脏的血管，将红细胞去除，从而有效避免避免后续分离得到的细胞中混有红细胞；第二灌流，第二灌流液含有抗凝剂和消化酶，能够防止肝脏中的血液发生凝固，避免血液凝固对血管造成堵塞，进而对后续消化灌流过程产生阻碍，是抗凝并同时进行初步消化的过程；第三灌流，第三灌流液中主要含有消化酶，经过一些毛细血管，能够更充分地作用于肝细胞，是进一步消化的过程，相对传统的同时进行抗凝和消化，消化液能更充分地作用于肝细胞，消化更迅速，更充分，消化效果更好，后续获得的细胞活性更好，贴壁更迅速；典型但非限制性的消化液例如为：IV型胶原酶、II型胶原酶、胰蛋白酶等。这三个过程是依次进行的，先在抗凝的同时去除红细胞，然后去除残留抗凝剂，并进行初步消化，再进行进一步消化。
在一种优选的实施方式中，原位灌流的灌流血管为肝门静脉。
现有技术中经常采用后腔静脉进行灌注，但是后腔静脉较粗，一旦操作时刺破血管由于血压过大，会导致出血过多，不易于灌流针刺入和结扎，因此，对操作人员的技术要求较高，而且操作需要谨慎，耗时往往较长。肝门静脉易寻找，而且固定方便，不易滑脱，穿刺过程中出血量较少，不会影响穿刺视野，提高了灌流的效率，而且肝门静脉对相对容易刺入灌流针，结扎容易，操作便利，进一步节省了操作时间，这样有利于后续获得的肝细胞的活性，制得的肝细胞贴壁更迅速。
在一种优选的实施方式中，第三灌流，用第三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤。用PBS (Phosphate Buffered Saline)即磷酸盐缓冲液进行清洗，能够去除残留的第三灌流液含有的消化酶，防止细胞过度消化。
优选地，PBS的温度为36-37℃；PBS的温度在36-37℃于小鼠的肝组织温度接近，能够有效维持肝组织细胞活性。
优选地，小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；在第二灌流以后，用37℃的PBS对小鼠肝脏进行预热，防止操作过程中肝脏组织逐渐冷却，一方面维持细胞活性，更重要的是37℃预热，在37℃条件下消化酶的活性最好，能够迅速消化肝组织细胞，使酶的活性充分发挥，提高消化效率。
优选地，第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％。市售常见的IV型胶原酶通常包含至少7种蛋白酶成分，它对小鼠肝脏组织的消化作用良好，消化的过程引起细胞死亡量较少，消化后收获的活细胞收率高，消化过程较为温和，消化效果好，收获的细胞活性好，贴壁迅速。温度为37℃更接近小鼠体温，对于肝脏组织的刺激较小，有利于保留肝细胞的活性，IV型胶原酶溶液浓度控制在 0.03-0.05％，消化更充分，且不易引起细胞死亡，消化效果好，不易过度消化，灌流后细胞活性更好。典型但非限制性的IV型胶原酶的浓度例如为： 0.03％、0.04％或0.05％等。
优选地，IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％。当IV型胶原酶浓度为 0.048％时，消化效果更好，无需消化过长时间，后续获得的细胞活性更好地保持，贴壁更迅速。
优选地，第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。根据实际经验，第一灌流液，抗凝并去除红细胞，根据小鼠的肝脏血液量和肝脏体积，通常灌流150-200mL 即可充分去除红细胞，更多的第一灌流液进行灌流会浪费更多时间，不利于细胞活性的保持。为了避免肝脏中的血管因凝固而堵塞，尤其是一些细小的血管，堵塞会造成后续消化不充分，影响存活细胞的收率，浪费肝脏组织，第二灌流液中也加入抗凝剂，在初步消化的同时也起到抗凝作用，根据实际经验，灌流150-200mL即可。第三灌流液，其实质是用起到消化作用的消化液进行灌流，灌流150-200mL 通常能够较为充分消化小鼠肝组织。典型但非限制性第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液的分别灌流例如：150mL、160mL、170mL、180mL、190mL 或200mL等。
在一种优选的实施方式中，肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；上述肝周管包含是肝周围的主要血管和胆管，将上述肝周管结扎能够更好地控制灌流液的流向，灌流更迅速，更充分。
优选地，肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；
优选地，肝周管结扎包括如下步骤：
(1)结剪断十二指肠韧带；
(2)结扎胆总管；
(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；
(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；
(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；
(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺 (7)结扎后腔静脉；
(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。
按照上述步骤进行结扎，其实质是由外向内的顺序进行结扎，在结扎过程中肝脏游离性增加，不易导致肝脏被膜破裂。灌流成功率高，不易造成肝组织浪费。
在一种优选的实施方式中，细胞分离依次包括肝组织分离和细胞筛分离；
肝组织分离包括如下步骤：将消化灌流后的肝脏分离至麻醉小鼠体外，浸入37℃的PBS 溶液中，然后去除肝脏包膜、结缔组织和血管，再用移液器反复吹打，得到小鼠肝脏匀浆液；
细胞筛分离包括如下步骤：将匀浆液依次过100目、200目和400目细胞筛，得到细胞悬液，对细胞悬液进行固液分离，得到小鼠原代肝细胞；
肝组织的分离即分离整体肝脏组织的过程，细胞筛分离是获得分散的细胞的过程。这个过程中，先将肝脏分离，然后放入37℃的PBS溶液中能更好地保持肝脏细胞的活性，除去肝脏包膜、结缔组织和血管组织，消化过的组织在反复吹打过程中很容易破碎，然后得到小鼠肝脏匀浆液。
优选地，所述固液分离方法为离心，所述离心转速为450-550g，离心时间为4-10min，首次离心后再用PBS重悬后离心，重复1-3次；离心能够较为迅速的分离细胞，有利于保持原代肝脏细胞的活性，迅速获得高活性的小鼠原代肝脏细胞，此外，离心力过大容易造成细胞损伤，离心力过小细胞不易沉降，PBS重悬后，重复离心2-3次，沉降更完全。
优选地，离心转速为500g；以500g转速细胞沉降速度较快又不易造成损伤。
优选地，离心是时间为5min；离心时间不宜过长或过短，过长容易对细胞造成损伤，过短容易沉降不完全，5min的离心时间相对保证了沉降的完全性，又不会造成细胞损伤。
在一种优选的实施方式中，原位灌流采用微量注射泵。采用微量注射泵，能够更好地对流速进行控制，灌流效果更好，而且微量注射泵成本较低。
优选地，原位灌流的灌流速度为1.2-1.5mL/min。灌流速度在 1.2-1.5mL/min之间，过快容易破坏肝脏组织内部的血管，而且灌流用到的各种灌流液不能充分作用于肝组织，尤其是消化过程，灌流速度的控制非常重要，当灌流速度在1.2-1.5mL/min时候，消化较为充分，而且对细胞的破坏较小，典型但非限制性的灌流速度例如为：1.2mL/min、
1.3mL/min、 1.4mL/min或1.5mL/min等。在一种优选的实施方式中，第一灌流，将第一灌流液灌流至肝脏开始膨胀时，刺破后腔静脉，释放第一灌流液；这个过程是将肝脏组织内部血管里的红细胞去除的过程。
优选地，第一灌流过程中，轻拍肝脏表面。轻拍肝脏表面，能促进肝脏组织内部的液体流动，有效避免红细胞去除液在灌流过程中流动不畅造成的红细胞去除效果不好，加速肝内血细胞排出。
在一种优选的实施方式中，肝周管结扎后还包括进行留置针放置，留置针放置包括如下步骤：
将预置缝线环绕肝门静脉背侧，并用留置针穿刺如肝门静脉，拔除留置针的硬针，然后用预置缝线固定留置针；
将预置缝线环绕肝门静脉背侧，并用留置针穿刺如肝门静脉，拔除留置针的硬针，然后用预置缝线固定留置针；应用留置针能有效避免普通硬针在灌流过程中由于一些机械碰撞或运动导致的血管被刺破现象的发生，进而导致灌流的失败，能够有效提高成功灌流的概率，避免不必要的浪费，节省肝脏组织。
然后放置肝素帽，并连接头皮针；肝素帽是与留置针相连的装置，可以防止液体回流并具有一定的抗凝血作用。
优选地，腹腔暴露，包括在麻醉小鼠腹部行Mercedes手术切口的步骤；该切口更加充分暴露腹腔脏器，便于手术和灌流。
优选地，第一灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.7-0.9％、 KCl0.03-0.05％、
NaH2PO4·2H2O0.007-0.008％、Na2HPO4·12H2O0.014-0.016 ％、EGTA0.018-0.02％、NaHCO30.03-0.04％、HEPES0.023-0.024％、Glucose0.08 -0.1％，青-链霉素0.8-1.5％，余量为水。
第一灌流液里加入青-链霉素0.8-1.5％进一步降低了灌流过程中受菌类污染的概
率，EGTA起到抗凝作用，其余的盐共同组成中性的灌流液，同时具有一定的缓冲作用，对细胞具有一定保护作用。
优选地，第一灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.8％、KCl0.04％、NaH2P
O4·2H2O0.0078％、Na2HPO4·12H2O0.0151％、EGTA0.019％NaHCO30.035 ％、HEPES0.238％、Glucose0.09％，青-链霉素1％，余量为水。优选特定组方的第一灌流液，能够更好地发挥抗凝作用，抗生素浓度以及盐溶液浓度更合理，对细胞保护作用更好。
优选地，第二灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.7-0.9％、KCl0.03-0.05 ％、CaCl20.05-0.06％、NaH2PO4·2H2O0.007-0.008％、Na2HPO4·12H2O0.014- 0.016％、HEPES0.23-0.24％、NaHCO30.03-0.04％，青-链霉素0.8-1.5％，余量为水。
第二灌流液里加入青-链霉素0.8-1.5％同样是降低菌类污染概率，Cacl2 起到去除EGTA的作用，其余的盐共同组成中性的灌流液，具有一定的缓冲作用，对细胞具有一定保护作用。
优选地，第二灌流液以质量百分比计包括：NaCl0.8％、KCl0.04％、CaCl20.056％、NaH2PO4·2H2O0.0078％、Na2HPO4·12H2O 0.0151％、HEPES0 .238％、
NaHCO30.035g，青-链霉素1％，余量为水。
优选特定组方的第二灌流液，能够更好地发挥清楚第一灌流后残留的第一灌流液当中的抗凝剂，同时对抗生素浓度以及盐溶液浓度进行优化，对细胞保护作用更好。
根据本技术的第二方面，提供了小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原代肝细胞。
本技术提供的小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原代肝细胞贴壁迅速，细胞活性高。
根据本技术的第三方面，提供了小鼠原代肝细胞在细胞生物学试验或病毒学试验中的应用。
本技术提供的小鼠原代肝细胞能够在细胞生物学试验或病毒学试验中应用。
优选地，细胞生物学实验包括：细胞毒性试验、细胞凋亡试验、氧化应激试验、细胞自噬试验或病毒侵染试验。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本技术，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本技术。
实施例1
实施例1应用试剂配制如下：
第一灌流液：称取1.6g NaCl、0.08g KCl、0.0156g NaH2PO4·2H2O、
0.0302gNa2HPO4·12H2O、0.038g EGTA、0.07g NaHCO3、 0.476gHEPES、
0.18gGlucose，青-链霉素0.5g，加超纯水定容至200mL。
第二灌流液：称取1.6g NaCl、0.08g KCl、0.112g CaCl2、0.0156g NaH2PO4·2H2O、0.0302g Na2HPO4·12H2O、0.07g NaHCO3、0.476gHEPES、青-链霉素0.5g，加超纯水定容至200mL。
消化液：0.048％的IV型胶原酶。
一种小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：
腹腔暴露：将ICR小鼠按照0.3mg/g陆眠宁进行腹腔注射，待完全麻醉后固定于手术台。先用75％酒精消毒全身消毒，然后将无菌纱布覆盖小鼠周围仅暴露术部，Mercedes手术切口(人字形切口)，随后剪开肌肉与腹膜，暴露腹腔。
肝周管结扎：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6) 结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，见附图1，图1为暴露肝门静脉图，然后注射肝素100U。
原位三步灌流：将预置缝线环绕门静脉背侧，并用26号留置针穿刺入门静脉见附图2，肝门静脉灌流图，拔除留置针内部的硬针，然后用预置缝线固定留置针。放置肝素帽，并连接头皮针。采用微量注射泵以1.5mL/min 速度灌流第一灌流液200mL，当肝脏开始膨胀时用针头刺破后腔静脉，释放第一灌流液，第一灌流过程中，用手轻轻拍打肝脏表面至肝内血细胞完全灌流出肝脏；然后用微量注射泵以1.5mL/min速度灌流第二灌流液200 mL；将提前配制的0.048％的IV型胶原酶和PBS置于37℃水浴锅中预热，用预热的PBS浸泡原位肝脏，用微量注射泵以1.5mL/min速度用0.048％ IV型胶原酶进行第三灌流的，同样灌流200mL步骤。用微量注射泵以1.5 mL/min速度泵入PBS将IV型胶原酶清除。
细胞分离：将消化后的肝脏分离至体外，并浸泡入37℃PBS中，将分离的小鼠肝脏转至细胞间，并置于灭菌平皿上，用眼科镊取出肝脏包膜，分离结缔组织和血管，然后向分离后的肝组织中加入PBS，用移液枪反复吹打小鼠肝脏组织至无明显结块，得到小鼠肝脏匀浆液。然后将小鼠肝脏匀浆液分别过100目、200目及400目细胞筛；收集细胞悬液，细胞悬液转至10mL离心管中，500g离心5min，PBS重悬后离心，重复3次，弃上清液。
制得的小鼠原代肝细胞经DMEM培养基，37℃，5％CO2培养12h，见附图3，制得的小鼠原代肝细胞12h贴壁图。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于，采用离体灌流的方式进行灌流。
制得的小鼠原代肝细胞经培养12h贴壁，见附图4。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于，灌流分为两步，将抗凝液和消化液混合，抗凝灌流和消化灌流统一进行。
制得的小鼠原代肝细胞经培养12h，见附图5。
试验例
将实施例1和对比例1-2获得的小鼠原代肝细胞分别以浓度为5×105个·mL-1细胞接种96孔细胞培养板，每孔200μl，置于5％CO2恒温培养箱中，37℃培养，然后分别于0h、24h、48h 及72h，显微镜观察细胞状态。
将实施例1和对比例1-2获得的小鼠原代肝细胞以浓度为5×105个· mL-1细胞接种96孔细胞培养板，每孔200μl，置于5％CO2恒温培养箱中， 37℃培养12小时后，进行T-2毒性实验。各实施例得到的小鼠原代细胞接种10个孔，实验分为五组，每组2个孔，分别是：对照组、1、10、100 及1000nM T-2毒素剂量组，用不同浓度T-2毒素处理贴壁后的细胞，并于处理后的24h，进行毒性试验，利用MTT法测定24h，不同毒素组肝细胞的细胞活性，活性测定结果见图6-8；图6为本技术实施例1制得的原代细胞在试验例中对照组及1、10、100、1000nM T-2剂量组培养24h的细胞活性(％)；图7为本技术对比例1制得的原代细胞在试验例中对照组及1、 10、100、1000nM T-2剂量组培养24h的细胞活性(％)；图8为本技术对比例2制得的原代细胞在试验例中对照组及1、10、100、1000nM T-2剂量组培养24h的细胞活性(％)。
由是实施例1和对比例1的检测结果对比可见，采用离体灌流的方式，制得的小鼠原代细胞贴壁效果相对较差，视野中贴壁细胞较少，制得的原代活性较差，贴壁较慢，细胞存活率更低。
由实施例1和对比例2的检测结果对比可见，采用两步灌流的方式，即将抗凝灌流和消化灌流统一进行，制得的小鼠原代肝细胞经培养以后，视野中贴壁细胞相对较少，制得的原代活性较差，贴壁较慢，细胞存活率更低。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本技术，然而应意识到，在不背离本技术的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本技术范围内的所有这些变化和修改。
原代心肌细胞培养技巧【转】
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳. 2消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性 分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染. 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择 成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞. 7换液时间 进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响. 8抗污染措施
淋巴细胞的分离方法
1、淋巴细胞的来源： 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法： 1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2） 3、20℃，1500r/min，离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%～95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。 该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型
小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型 （2013/6/20 廖翔） 一．材料 1. 所需液体：K-H液（NaCl 118, NaHCO3 24, CaCl2 2.5, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, Glucose 11, EDTA 0.5 （in mM））、低分子肝素溶液（500IU/ml）、戊巴比妥钠液、碳酸氢钠液、盐酸液。 2. 取鼠：标准C57小鼠（20-25g）。 3. 物品： ?手术剪、血管钳 1套，用于开腹、开胸 ?眼科剪、眼科镊 1套，用于开胸后取心、剔除心缘纤维组织 ?小圆培养皿 2个，培养皿内加4°K-H液，先后装取出的心 ?1000ml烧杯 2个 +小转子，一个用于配制H-K液，一个装双蒸水，清洗灌注仪器 ?500ml烧杯 1个，用作废液缸。 ?50ml烧杯 1个（用于少量的药物灌注） ?吸管 2个，分别滴加碳酸氢钠液、盐酸液 ?持针器1把，夹持带针7号线 ?尖镊2把，夹持主动脉 ?大镊子1把，持物 ?1mL注射器 2个，分别用于注射麻药、肝素 ?5mL注射器 1个，用于加CaCl2液 ?50mL注射器1个，用于加K-H液 ?5mL注射器针头自制灌注针 1个（用于挂小鼠心脏，尖端磨平，距针尖2mm出磨出刻痕以便打结固定） ?6号线（用于固定心脏）、带针7号线（用于结扎LCD） ?氧气罐（95% O2 +5% CO2） ?20X20cm泡沫板1个+大头针4枚，用于固定麻醉后的小鼠 ?泡沫盒1个，装冰块 ?橡皮泥，用于固定挂心脏的自制注射器 4. 仪器：手术显微镜、langendorff离体灌注装置（灌注系统、恒温装置、灌注泵） 5. 另外准备手套、口罩、棉签等 注：现在差的物品有：尖镊2把（夹持主动脉） 二．操作方法： 1、打开离体灌注装置，设备自检。注意灌注压调零；配制K-H液，调pH为7.4左右（7.35-7.43），加入灌注装置恒温至37°，运行灌注泵，排空灌注系统的气泡。加适量K-H液于小圆培养皿中放于冰块上（4°），打开显微镜，将需要使用的工具摆放到位。 2、小鼠称重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg)进行麻醉，予以普通肝素(300IU/kg)肝素化，待小鼠麻醉完全后，固定小鼠于泡沫板上。迅速开腹，迅速开胸，切断主动脉和上下腔静脉，取出心脏，立即放入4°K-H液中（此过程<15s），冲洗掉残留在主动脉内的血液，寻找升主动脉，镊子夹住升主动脉血管壁并固定于自制针头，插入灌注针至主动脉瓣上方，6号丝线结扎后，迅速移至灌注装置上，用K-H液灌注，整个灌注期间用医用氧气进行鼓泡式氧合。必要时可切开右心耳，使冠
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒
原代小鼠肝细胞制备
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
原代肝细胞培养
原代肝细胞培养 原代肝细胞培养 1．实验材料 灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。 消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。 Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。 实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备 1) 灌流液 Perfusion Solution NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose 离子）。用前37℃温育。 每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液 100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。 消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。 每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9 调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3- 16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液） 每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。
心肌细胞2
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】 ：目的 乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但 是心肌细胞成活率、 搏动率， 纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。 本文 探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠 心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和
Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。 因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套， 操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段 除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。 4．心肌细胞纯化 在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力， 且生长迅速， 比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离， 成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想 方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c) ，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine， BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常
原代肝细胞
原代肝细胞分离培养与方法 肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 1 非酶分离细胞法 1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。 1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。 2．离体肝脏酶消化分离法 2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。肝细胞产率高、损伤小，且保持特异性功能的时间长。但胶原酶价格比较昂贵，成本高。胰蛋白酶既消化细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜，但胰酶消化的条件极难把握而使该法未被广泛应用 L8．9_。 2．2 胰蛋白酶、胶原酶消化的组织块法：处死小鼠，无菌分离肝脏，置 D-Hanks液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成 1 mm。的组织块，在 37℃下用胰酶或(和)胶原酶消化后，加人培养基终止消化，自然沉降后，取下层组织块，再用培养基洗涤数次即可将肝组织块贴壁于培养瓶中，每个培养瓶放组织块 30~35块，加少许培养基。该法分离效果、纯度较单纯的组织块法好，且细胞从组织块爬出时间相对短。但消化酶的用量和时间不易控制：消化过度，形成的絮状组织块不能分离；消化不充分，酶没有发挥其作用[10~12]。 2．3 在体肝脏酶灌注法 2．3．1 Seglen灌注法：即经典的二步胶原酶灌注法。两步灌注即经门静脉以无钙缓冲液和胶原酶恒流、恒温灌注，这是目前国际上公认的方法。首先用不含 Ca 的离子螯合剂(EDTA等)移走肝组织中的 Ca ，从而打破固定细胞的细胞桥粒样结构；再用胶原酶进行蛋白分解
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
原代心肌细胞培养方法探讨
原代心肌细胞培养方法探讨1 邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014） 周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021） 摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。 关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠 Explore a method of neonatal rat myocardial cells in culture ZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, China Abstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity. Key words Myocardial Cells; Culture; Rat 随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。 1材料与方法 1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰 1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）
小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养 ㈠、概述 整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。 ㈡、[试剂] 1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。 2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。 3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L ㈢、[实验步骤] 1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心
脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中 （37℃5%CO2）培养。