核酸分子杂交与应用
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释核酸分子杂交是一种重要的分子生物学技术，用于研究核酸的结构、功能和相互作用，并在基因克隆、基因表达调控等领域具有广泛的应用。
以下是与核酸分子杂交相关的重要名词的解释：1. 核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）：指将两个不同的核酸分子（DNA或RNA）通过互补的碱基配对形成双链结构的过程。
核酸分子杂交可用于分析DNA或RNA的序列、测定基因表达水平以及检测特定的核酸序列。
2. 探针（Probe）：一条含有特定序列的标记化核酸分子，用于与目标序列进行杂交。
探针通常由放射性核素、荧光染料或酶等标记物标记，以便于在实验中检测其位置和数量。
3. 靶标（Target）：指待被杂交的目标核酸分子，它可以是DNA或RNA，含有待检测或待分析的特定序列。
靶标可以来自于生物样品，如组织、细胞或血清等。
4. 互补序列（Complementary Sequence）：两条核酸分子间相互配对的碱基序列。
在DNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过双氢键相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对；在RNA分子中，腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对。
5. 杂交化（Hybridization）：指探针与靶标间通过互补序列形成双链结构的过程。
杂交化通常需要一定的时间和温度条件，以保证探针和靶标的互补碱基序列能够正确配对。
6. 杂交化条件（Hybridization Conditions）：影响探针和靶标杂交的因素，包括温度、盐浓度、引物浓度、溶液pH值等。
不同的杂交化条件可选择性地控制互补序列的结合和分离，从而改变杂交的特异性和灵敏度。
7. 杂交化信号（Hybridization Signal）：当探针与靶标杂交时，由于探针上的标记物，如放射性同位素或荧光染料的发光、发射或放射活性，而产生的信号。
通过检测杂交化信号的强度和位置，可以确定探针与靶标的结合情况，以及目标序列的存在与数量。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术一、 概述前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA 的二条单链之间进行。
由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。
使单链聚合双链的过程称为退火或复性。
用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。
核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。
该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。
Bolton 等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。
变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。
典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA 分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。
该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。
60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。
该法是研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。
剪切的DNA液（含0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或0.18mol/l Na+），经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。
然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。
核酸的杂交(分子生物学)
⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸 分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥 力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。
三。核酸杂交概念：
利用变性作用将DNA双链分开，加入不同 来源的DNA单链或RNA链，经过退火处 理，不同来源的两条多核苷酸链依靠碱 基互补关系形成杂种双螺旋的过程。
核酸分子氢键断裂，双链分开。
（2）热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变， 其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟 踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的 变性曲线或熔解曲线。
1．特点 1）增色效应：在260nm紫外吸收 值升高。 2）Tm值改变 3）粘度下降、比旋度下降、沉降 系数升高。 4）生物活性丧失。
4。离子强度（盐浓度）：适当的离子强 度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电， 减少双链间的静电斥力，有利于杂交。离 子强度过高过低则不利于杂交。
5。核酸分子：分子越大，越复杂，杂交 难度大，杂交也慢。分子越小，易杂交。
第二节 核酸探针 一、探针的概念 • 核酸探针的概念
• 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂 交，杂交后又能被特殊方法检出的已知 被标记的核苷酸链
核酸的杂交
核酸杂交基本类型
1。Southern blot
2. Northern blot
3. Western blot
应用：克隆筛选、特定基因序列测定。
3.
RNA
1） DNA杂交—探针为DNA
2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA
具体了解Southern杂交技术
Southern Blotting的过程
1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测
具体了解Southern杂交技术
四、Southern杂交的应用
– DNA指纹分析
具体了解Southern杂交技术
滤膜（固相）杂交
具体了解Southern杂交技术
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类： ③ 膜 杂 交 ： 用 标 记 DNA
或RNA探针检测固定在 硝酸纤维素（NC）膜 上 的 DNA 序 列 。 Brown 等应用这一技术评估 了 爪 蟾 rRNA 基 因 的 拷 贝数。
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ③探针的种类
cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针等。
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
④放射性探针标记物
[α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、 125I(60d)、14C、131I
胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜：
–硝酸纤维素膜 (NC) 、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空
转移法
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
具体了解Southern杂交技术
三、Southern 杂交的主要步骤
第16讲
核酸分子杂交 ------Southern杂交
核酸分子杂交
RNA提取
RNA变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交
RNase 具有活性高，不 易灭活 抑制RNase活 性
所有的试剂和器皿都 必须进去除RNase 处理！！
变性处理：甲醛、乙二醛
破坏RNA二级结构
洗膜
放射自显影或化学显色
基本步骤
1. RNA经变性电泳完毕后，可立即将RNA转 移至硝酸纤维素滤膜上。 2. 将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱 于80℃干燥0.5-2小时。 3. 预杂交，时间为1-2小时。 4. 杂交 过夜 5. 洗膜 6. 用X光片进行放射自显影，附加增感屏于70℃曝光24-48小时。
Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主 要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变 性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构， 保证RNA 完全按分子大小分离。
变性电泳主要有3 种:
甲醛变性电泳 乙二醛变性电泳
羟甲基汞变性电泳
电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相 同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上, 然后与探针杂交。
3. 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物 质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐 减弱的原理，可以设置一定的屏障物来 进行防护。常用的材料有水、砖、大理 石、混凝土、重金属铅等。
32P
有机玻璃版 铅衣
4. 利用衰变：可利用放射性物质存在自发 衰变，其活性随之减少的原理进行外照 射防护。如：半衰期小于15天的放射性 废物，允许放置10个半衰期后作一般废 物处理。
注意事项 1. DNase I的量 2. dNTP a-P 3. 温度4-16℃
Pol I DNase I
两条链都可 被标记
随机引物合成法
核酸分子杂交及芯片技术(共68张PPT)
〔二〕标记法
•酶反响法 将标记物〔放射或非放射〕预先标记在核
苷酸分子上，然后通过酶促反响将标记的核 苷酸分子渗入探针分子中。
•化学反响法 利用标记物(非放射为主)分子上的活性基团
与核酸分子上的基团发生化学反响而将标记物 结合到探针分子上。
1、随机引物法〔random priming〕 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新
Vacuum blotting 30~60分钟
–more efficient and quantitative than capillary –must apply vacuum evenly and not too strongly
3．印迹类型
• Southern印迹杂交
• Northern印迹杂交 • 斑点及狭缝印迹杂交
1、利随用机D引N物A聚法用合〔酶ra特来nd合o异m成p与性ri模mi板n的g互〕补细的菌新的、DNA病链。毒的核酸作为探针对组织细胞进
行杂交，确定有无该病原体的感染。
FISH(荧光原位杂交)结果
地高辛标记的探针用抗地高辛-罗丹明显示(红色)
生物素标记的探针，用抗生物素蛋白-FITC显示(绿色)
在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。
核酸原位杂交的根本步骤
1.细胞或组织的固定：载玻片 2.组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸外表蛋白质 3.探针的选择和标记
4.杂交 5.杂交结果检测
应用：
探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列
3、复性 变性DNA经过一定处理通过碱基互补重新形成双螺旋的过程。
杂交根本流程
〔一〕核酸分子与固相介质的结合
1.噬菌体/克隆的转移
2.从凝胶上转移DNA:毛细转移、真空转移、 电转移 〔二〕核酸的固定：烘烤〔80℃，2h〕、紫 外、碱
核酸的分子杂交
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
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应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
核酸分子杂交概念解释
核酸分子杂交概念解释
核酸分子杂交是指两条核酸链（通常是DNA或RNA链）通过互相结合，形成一个稳定的双螺旋结构的过程。
这种结合是通过碱基间的氢键形成的，碱基之间的配对是高度选择性的。
DNA分子的碱基配对规则是腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键。
核酸分子杂交在生物学和分子生物学中有许多应用，其中最为著名的是分子杂交技术（molecular hybridization technique）。
这一技术可用于检测和分析DNA或RNA 的序列相似性，以及研究基因表达、基因组结构等方面。
以下是核酸分子杂交的一些关键概念：
1. 碱基配对：核酸分子的稳定性来自于两条链之间的碱基配对。
在DNA中，A与T 形成两个氢键，G与C形成三个氢键。
RNA中的规则类似，但是T被替换为尿嘧啶（U）。
2. 选择性：核酸分子杂交的过程是高度选择性的，只有符合碱基配对规则的两条链能够结合。
这种选择性是生物体内DNA复制和RNA转录的基础。
3. 热力学稳定性：杂交的稳定性受到环境条件的影响，尤其是温度。
高温通常会导致核酸分子的解离，而低温则有助于形成更稳定的双链结构。
4. 杂交实验：分子生物学中的分子杂交实验利用了核酸分子的互补配对性质。
例如，通过将待测的DNA或RNA与已知序列的标记分子杂交，可以用于检测目标序列的存在、测定相对丰度等。
5. 应用领域：核酸分子杂交技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等方面有广泛应用，为研究生物学和遗传学提供了重要工具。
核酸分子杂交的原理
核酸分子杂交的原理DNA杂交，又称为核酸杂交，是一种利用序列非常相似的两种DNA片段结合在一起的技术，用于识别和对比细胞中的核酸或基因，用于定位基因变异。
DNA杂交是获得分子进化关系的重要工具，以及用于检测转基因作物的生物技术的发展工具。
它的主要原理是将两种单链DNA片段（母本DNA和一个变异DNA片段）合并在一起形成双链，然后将该双链暴露在特定的酶环境中，并配备合适的引物，以自发结合引物介导的方式发生酶切，最终产生不同大小的片段，以及小片段和大片段是否具有相同类型的序列。
实验中，DNA受体片段先在受体片段介导下按一定规律结合引物，然后由特定酶将受体片段酶切，产生了双链DNA杂交物，由于这种杂交物具有不同DNA序列，因此下一步可以用对应的引物获得更多的片段，以进行进一步的检测。
由于杂交检测的特性可以作为定点突变的检测工具，因此DNA杂交可以在大规模基因组测序和表型分析中发挥重要作用，目前已经发展出了多种杂交技术，例如逆转录杂交（RT-PCR），聚合酶链反应（PCR），表达型修饰-聚合酶链反应（ER-PCR），质粒直接DNA杂交（Direct DNA hybridization），基因检测-聚合酶链反应（TG-PCR）等，可以应用于疾病的基因学研究、基因芯片芯片技术及代谢组学等领域。
DNA杂交也可用于生物技术的应用，例如可以利用质粒直接DNA杂交技术，结合十字花科植物田间转座子表型分析，进行秸秆细胞壁合成物质，蛋白质及DNA等各类生物活性组分的高效检测，也可以直接鉴定物种间亲缘关系。
在DNA序列比较方面，DNA杂交可以用于检测不同物种的DNA相似性，以及检测甲基化印迹技术（MSP）和其它所有基因组学分析应用。
从而，可以定位某一特定DNA片段中的核苷酸序列变异，并确定这些变异可能引起的表型变化，从而为基因功能鉴定及深入基因分析，以及因果性分析提供有价值的信息。
核酸分子杂交
59 59
marker 样品
转膜
凝胶
膜
滤纸 滤纸
marker 样品
Western
蛋白质 样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳
缓冲液
marker
样品
marker 样品
一抗
二抗
X胶片 曝光
marker 样品
53 53
（二）Northern Blot
是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固相支 持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂 交，检测RNA （mRNA）的方法。
➢ 样品是RNA。
➢ 电泳前，不酶切。
➢ 电泳前，样品变性。
➢ 电泳过程中，样品保 持变性状态。
➢ 电泳后，样品不再变 性，直接转膜。
2. 复性过程：
（1）单链分子间碰撞形成局部双链
（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
（4）形成完整的双链分子
13
复性过程中的碱基配对
14
Hybridization
15
❖ 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双 链，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡 核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，该特性是体外杂 交技术的基础。
EE
E
EE H
E H
DNA片段：
（最长的DNA片段控制在大约2 kb）
38
2.待测DNA样品的电泳分离
12
2000
1000 750 500
250 100
0.8 ~ 1％ 非变性琼脂糖凝胶