单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则
单核细胞李期特菌质谱操作法流程
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乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验
乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验YLNB 4.6 1. 仪器及器材1.1 恒温培养箱：30±1℃、24±1℃1.2 恒温水浴锅：46±1℃。
1.3 显微镜：10×～100×1.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。
1.6 灭菌平皿：直径90mm。
1.7 灭菌试管： 16mm×160mm1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL 刻度）。
1.9 冰箱：0－4℃1.10 锥形瓶：100mL、500mL。
1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。
1.12 离心管：30mm×300mm。
1.13 灭菌注射器：11.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
1.15 马红球菌。
1.16 小白鼠：16g～18g。
2. 培养基和试剂2.1含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。
2.2含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。
2.3 EB增菌液：见附录A3。
2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。
2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。
2.6 SIM动力培养基：见附录A5。
2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。
2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。
2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中3.17。
2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/T4789.28中3.4。
2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中3.2。
2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。
2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。
2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。
3. 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：检样25g(ml)EB增菌液225ml LB1增菌液225ml30℃,48h 30℃,24h30℃,24h30℃,24～48h25℃ 2d ～5d(伞状)30℃,24h30℃,24hLB2增菌液225ml选择性培养基(MMA)SIM 动力培养基 TSI 琼脂TSA-YE 培养基显微镜下观察运动硝酸盐还原实验 过氧化氢酶实验 甘露醇 木醇 鼠李糖 七叶苷 溶血实验协同溶血实验 小鼠致病力实验 革兰氏染色 MR-VP 实验4. 方法4.1 样品的收集及处理无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究
单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。
因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。
本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。
一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。
在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。
由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。
二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。
然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。
三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。
以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。
qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。
2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。
8.单增李斯特检测
血平板
英诺克李斯特氏菌 ATCC 33090
36h，35℃培养
血平板
绵羊李斯特氏菌 ATCC 19119
24h，35℃培养
血平板
单增李斯特氏菌 ATCC 19117
36h，35℃培养
API Listeria
VITEK
结果报告
❖ 报告： 25g(ml)样品中检出或未检出单核细胞增生李 斯特氏菌。
步骤3---初筛试验
❖ 分别挑取5个以上的可疑菌落；初筛
木糖
阴性（-）
鼠李糖 阳性（+）
注意：①在接种糖发酵管的同事时，接种一个
TSA-YE平板用于生化试验，
②选择上述结果的菌株进行系统生化鉴定
步骤4—鉴定
❖ 传统生化 ❖ 生化鉴定系统 如API 10300 ❖ 全自动微生物鉴定系统
动 力 试
30℃±1 ℃24h
木糖—、鼠李糖+
鉴定
结果报告
❖ 步骤1 ❖ 步骤2 ❖ 步骤3 ❖ 步骤4
检验步骤
增菌 分离培养 初筛 鉴定
步骤1---增菌
1、称取样品25 g（mL）于225 mL LB1中，均质， 30±1℃ 24h培养
2、吸取LB1培养物 0.1 mL，转种于10 mL LB2 内，30 ℃±1 ℃ 18 - 24h
通常只有单增李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌 症相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是 单核细胞增生李斯特氏菌。
概况
❖ 1981年加拿大由卷心菜引起的一次单增李 斯特氏菌引起的食物中毒爆发流行后，首 次明确了该菌是食源性病源菌
❖ 1981以后发生了多次世界范围的大流行 ❖ 2001年后我国检测机构多次从美国、加拿
❖ PALCAM培养基，分离原理主要是基于李斯特菌具 有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七 叶灵，产生并七叶苷并与铁离子产生颜色反应，使 菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈。但所有的李斯特 氏菌都能发生这种反应
单增李斯特氏菌检测详解优品文档
李斯特氏菌斜面和底层产酸，不产硫化氢。 monocytogenes
Listeria monocytogenes monocytogenes 每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。 VIDAS快速筛选（可选） 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）培养48h。 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。 菌落形态：24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环。 （设标准菌株对照）
225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二 次增菌25h±1h。
VIDAS快速筛选（可选）
FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。
分离培养
取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。
鉴定
溶血试验 VIDAS快速筛选（可选）
协同溶血试验（cAMP）
刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。
可代替硝酸盐还原、MR-VP、三糖铁、糖发酵、尿素酶和CAMP等试验。
英诺克李斯特氏菌 L. innocua
威尔斯李斯特氏菌 L. welshimeri
西尔李斯特氏菌 L. seeligeri
格氏李斯特氏菌 L. grayi
蓝 典 过 革 溶 动 尿 硝 MR
色型氧兰血力素酸∣
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析
乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析单核细胞（monocytes）是一类存在于人体血液和组织中的白细胞（leukocytes）。
它们作为免疫系统中的重要成分，具有很强的吞噬能力和免疫调节功能。
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，它能够引起严重的人类食物中毒，尤其是婴儿和免疫缺陷患者。
乳粉作为婴幼儿的主要食物，其安全性尤为重要。
为了对乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌的能力进行验证，可以进行以下步骤：1.材料准备:-乳粉样品- 特定培养基（如Listeria Enrichment Broth）-李斯特氏菌（已知培养物）-离心管-培养皿2.试验步骤:a.预处理乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入适量的特定培养基-将混合物在摇床上以适当速度摇匀-使用离心机将样品离心，以除去悬浮的杂质b.培养李斯特氏菌:-取一定量的已知培养物，加入特定培养基中-在适当的温度和湿度下，培养李斯特氏菌至适宜的生长期c.接种乳粉样品:-取适量的乳粉样品，加入特定培养基中-添加已培养的李斯特氏菌（适量）到乳粉样品中-使混合物充分混合d.孵化和观察:-将接种混合物接种到适当的培养皿中-将培养皿置于适当的环境中（温度、湿度等）-在一定时间内观察培养皿中是否有李斯特氏菌的生长3.结果与分析:通过观察培养皿中的生长情况，可以得出以下结论和分析：-如果培养皿中出现了李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-如果培养皿中未观察到李斯特氏菌的生长，说明乳粉样品中不存在单核细胞增生的李斯特氏菌能力。
-结果应与对照组进行比较，以确定是否存在显著差异。
需要注意的是，这是仅仅通过培养方法进行初步验证，不能判断乳粉样品的感染风险和食用安全性。
为了更准确地评估乳粉中李斯特氏菌的存在和潜在传播风险，还需要进一步的实验和分析方法，如PCR检测、测定菌群数量等。
同时还应结合临床和流行病学调查数据，做出综合评估和判断。
食品中单增李斯特菌检测
食品中单增李斯特菌检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测实验目的1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。
2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。
基本原理单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。
单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。
李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。
此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。
人也可作为无症状携带者。
据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。
李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5μm ′0.5～2.0μm。
多单在，有时是V字型排列。
无芽孢，不产生荚膜。
在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20μm 或更长的丝状。
在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。
本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。
对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。
加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。
在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。
在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。
在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。
不形成菌环、菌膜。
在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。
新版单核细胞增生李斯特氏菌的测定1
一、编制目的为规范本单位单核细胞增李斯特氏菌的检验方法，编制本指导书。
二、适用范围本指导书规定了食品单核细胞增李斯特氏菌的检验方法。
第一法适用于食品中单核细胞增李斯特氏菌的定性检验；第二法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数；第三法适用于单核细胞增李斯特氏菌含量较低（<100CFU/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增李斯特氏菌的计数，特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品。
三、编制依据GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。
四、设备和材料4.1冰箱:2℃一5℃。
4.2恒温培养箱:30℃±1℃ , 36℃士1℃。
4.3均质器。
4.4显微镜:lOX一100X。
4.5电了天平:感量0.1 g。
4.6锥形瓶:100mL、500mL。
4.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
4.8无菌平皿:直径90mm。
4.9无菌试管:16mm×160mm。
4.10离心管:30mm×100mm。
4.11无菌注射器:1mL。
4.12金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。
4.13马红球菌(Rhodococcus equi)。
4.14小白鼠:16g-18g。
4.15全自动微生物生化鉴定系统。
五、培养基和试剂5.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)。
5.2含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂(TSA-YE)。
5.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2)。
5.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl)溶液。
5.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid)溶液。
5.6 PALCAM琼脂。
5.7革兰氏染液。
5.8 SIM动力培养基。
5.9缓冲葡萄糖蛋白陈水（甲基红(MR)和V-P试验用）。
5.10 5%-8%羊血琼脂。
5.11糖发酵管。
5.12过氧化氢试剂。
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单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则
1、目的
根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。
2、适用范围
适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
3、职责
检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。
4、试剂及器材
4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株
4.2 马红球菌
4.3 小白鼠：16-18g
4.4 TSB-YE
4.5 TSA-YE
4.6 EB增菌液
4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）
4.8 三糖铁琼脂
4.9SIM动力培养基
4.10 琼脂
4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）
4.12 硝酸盐培养基
4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水
4.14 糖发酵培养基
4.15 过氧化氢
4.16 1%盐酸丫啶黄溶液
4.17 1%萘啶酮酸盐溶液
5、仪器设备
5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃
5.2 恒温水浴锅：46±1℃
5.3 离心机：4000r/min
5.4 显微镜
5.5 均质器
6、检测步骤
6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1
增菌液中，充分搅拌成均质。
如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24
小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。
6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板
上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。
角斜光照射平板。
6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于
25℃。
一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。
6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产
酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。
6.6染色镜检：将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查。
用生理盐水制
成菌悬液，在油镜下观察。
6.7生化特性：溶血反应阳性、硝酸盐还原阴性、尿素酶阴性、MR-VP阳性、甘
露醇阴性、鼠李糖阳性、木糖阴性、七叶苷阳性。
6.8对小鼠的毒力试验：将符合上述特性的纯培养物借重于TSB-YE中，30℃培
养24小时，离心，弃上清夜，用0.85%灭菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/ml 的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只-5只，每只0.5ml，观查小鼠死亡情况。
致病株于2天-5天内死亡。
试验时可用已知菌作对照。
单核细胞增生李斯特氏菌有致病性。
6.9协同溶血试验：在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，在它们中
两者之间垂直接种可疑单核细胞增生李斯特氏菌，但不要触及它们，30℃培养24小时-48小时，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。
7、结果判定：
7.1单核细胞增生李斯特氏菌的菌落在MMA琼脂平板上为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。
7.2 三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢。
7.3 SIM上有动力，且成伞状或月芽状生长。
7.4 单核细胞增生李斯特氏菌革兰氏阳性小杆菌
7.5 湿片检查，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
7.6溶血反应阳性、硝酸盐还原阴性、尿素酶阴性、MR-VP阳性、甘露醇阴性、鼠李糖阳性、木糖阴性、七叶苷阳性。
7.7 小鼠的毒力试验单核细胞增生李斯特氏菌有致病性。
7.8协同溶血试验，靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特氏菌的溶血增强。
8、支持性文件
《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验。
9、质量记录
9.1 检测原始记录
9.2 检测报告。