DNA测序测序方法双脱氧链终止法自动化DNA测序焦磷酸测序1

DNA 测序

测序方法：

双脱氧链终止法

自动化DNA测序

焦磷酸测序

1、双脱氧链终止法

原理：

ddNTP由于缺乏3’-OH ，可以终止DNA链的延长

利用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将不同长度的核苷酸链分离步骤：

（1）双链DNA-------加热----------单链DNA

（2）加引物--------退火

（3）取四支试管A、B、C、D加入dNTP、耐热的DNA聚合酶（4）将ddNTP标记，A加入ddATP、B加入ddTTP、C加入ddCTP、D加入ddGTP

（5）得到结构如下

5’—X—A*

5’—X—AG*

5’—X—AGG*

5’—X—AGGC*

5’—X—AGGCT*

5’—X—AGGCTA*

5’—X—AGGCTAG*

5’—X—AGGCTAGC*

5’—X—AGGCTAGCA*

5’—X—AGGCTAGCAG*

5’—X—AGGCTAGCAGC*

5’—X—AGGCTAGCAGCA*

5’—X—AGGCTAGCAGCAT*

5’—X—AGGCTAGCAGCATG*

5’—X—AGGCTAGCAGCATGA*

（6）用尿素处理变性的聚丙烯凝胶电泳，依次读出核苷酸序列

2、自动化DNA测序

原理：

(1)用四种不同的荧光染料分别标记不同的ddNTP

(2)在同一试管中加入ddNTP、NTP、DNA单链-引物、DNA聚合

酶

(3)生成的系列单链DNA片段在琼脂糖凝胶进行电泳

(4)用光子检测器接受被激光激发的DNA上的标记荧光素发出的

光子，因生成的DNA依据片段由短到长依次经过，便可得到待测DNA的核苷酸序列

3、焦磷酸测序

原理：

（1）将单一链DNA-引物、DNA聚合酶、ATP硫酶化酶、荧光素酶、荧光素、APS加入试管

（2）加入一种dNTP，如果其为合成下游核苷酸所需要的核苷酸种类，则发生反应生成PPi

（3）P pi在ATP硫酶化酶作用下生成ATP

（4）A TP在荧光素氧化酶的作用下将荧光素氧化生成氧化荧光素

（5）氧化荧光素释放光子恢复形成荧光素，

（6）剩余的dNTP在APS作用下继续分解

（7）加入另一轮dNTP，进行新一轮反映