高效液相色谱法中流速与分离度的优化方法
高效液相色谱法习题
高效液相色谱法习题第12章高效液相色谱法习题（一）选择题单选题1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( )A 涡流扩散B 分子扩散C 传质阻力D 输液压力2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( )A 提高流动相流速B 采用小颗粒固定相C 提高柱温D 采用更灵敏的检测器3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( )A 流动相种类多B 操作仪器化C 采用高效固定相D 采用高灵敏检测器4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( )A 紫外检测器B 荧光检测器C 示差折光检测器D 电导检测器5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( )A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相黏度较小D 柱温低6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( )A 外标标准曲线法B 内标法C 面积归一化法D 外标法7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( )A 吸附色谱B 反离子对色谱C 亲和色谱D 空间排阻色谱8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( )A 异构体B 沸点相近，官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( )A 涡流扩散B 纵向扩散C 固定相传质阻力D 流动相传质阻力10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( )A 在中性区域B 5一8C 1一14D 2一811．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( )A 乙腈>水>甲醇>正己烷B 乙腈>甲醇 >水>正己烷C 水> 乙腈>甲醇>正己烷D 水>甲醇> 乙腈>正己烷12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( )A 可加快流速，缩短分析时间B 高压可使分离效率显著提高C 采用了细粒度固定相所致D 采用了填充毛细管柱13．液相色谱的H-u曲线（）。
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
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选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
高效液相色谱的基本参数讲义
降低检测器噪声
通过优化检测器条件，如调整光 源强度、选择合适的滤光片等， 可以降低检测器噪声，从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下， 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异，如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度，而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高，分子运动加快，保留时间缩短 ；柱温降低，保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度，以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系，通过实验数据拟合得到线性方程，可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等；进样系统包括进样器 、定量环等；色谱柱是实现分离的核心部件；检测器用于 对分离后的组分进行检测；数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后，应及时清洗色谱 柱，避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前，应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化，以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存，并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法，并按照规范进行操作。
高效液相色谱法
第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。
由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。
至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱法习题
第12章高效液相色谱法习题（一）选择题单选题1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是()A 涡流扩散B 分子扩散C 传质阻力D 输液压力2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是()A 提高流动相流速B 采用小颗粒固定相C 提高柱温D 采用更灵敏的检测器3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是()A 流动相种类多B 操作仪器化C 采用高效固定相D 采用高灵敏检测器4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是()A 紫外检测器B 荧光检测器C 示差折光检测器D 电导检测器5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为()A柱前压力高B流速比GC的快C流动相黏度较小D柱温低6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是()A外标标准曲线法B内标法C面积归一化法D外标法7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是()A吸附色谱B反离子对色谱C亲和色谱D空间排阻色谱8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离()A 异构体B 沸点相近，官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是() A涡流扩散B纵向扩散C固定相传质阻力D流动相传质阻力10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为()A 在中性区域B 5一8C 1一14D 2一8 11．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为()A 乙腈>水>甲醇>正己烷B 乙腈>甲醇>水>正己烷C 水> 乙腈>甲醇>正己烷D 水>甲醇> 乙腈>正己烷12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于()A 可加快流速，缩短分析时间B 高压可使分离效率显著提高C 采用了细粒度固定相所致D 采用了填充毛细管柱13．液相色谱的H-u曲线（）。
A 与气相色谱的一样，存在着H minB H随流动相的流速增加而下降C H随流动相的流速增加而上升D H受u影响很小14. 与气相色谱相比，在液相色谱中（）。
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
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高效液相色谱法中流速与分离度的优化方法
高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种广泛应用于化学、生物化学、药物分析等领域的分析技术。
在进行高效液相色谱分离时，流速与分离度是两个重要的参数。
本文将探讨流速与分离度的优化方法，并介绍如何在实验中进行参数调整以获得最佳结果。
一、流速对分离度的影响
高效液相色谱法是通过液相在固定相上的分配作用实现分离的。
当样品通过色谱柱时，流速的快慢会直接影响分离效果。
一般来说，流速较快时，分离度较低，而流速较慢时，分离度较高。
这是因为当流速较快时，样品分子在固定相上停留的时间短，无法充分与固定相发生作用，导致分离度降低。
二、流速与分离度的优化方法
1. 初始流速的选择
在进行高效液相色谱分析时，我们可以先选择一个适中的初始流速进行实验。
一般来说，初始流速可以选择为色谱柱说明书中推荐的流速范围的中间值。
通过在初始流速下进行实验，观察分离效果后再进行调整。
2. 流速逐渐减小
一种常用的方法是通过逐渐减小流速来提高分离度。
首先，在初始流速下进行实验，观察分离效果。
如果分离度不理想，可以逐渐减小流速。
每次减小一定的流速后，观察分离效果，直至达到最佳分离度。
3. 流速梯度调整
在一些复杂的样品分离中，单一的流速可能无法达到最佳的分离效果。
此时，可以考虑使用流速梯度的方法。
流速梯度是指在实验过程中逐渐增加或减小流速，
从而达到分离的目的。
通过增加或减小流速，可以充分利用不同流速下的分离度，提高样品分离的效果。
4. 流速与其他参数的综合调整
流速与其他参数如温度、柱子类型等有密切的关系。
在实验中，我们不仅要关注流速对分离度的影响，还需考虑其他参数的调整。
比如，在一些情况下，提高温度可以加快分析速度，但也可能影响分离度。
因此，在实验中需要综合考虑流速与其他参数的综合调整，找到最佳的分离条件。
三、实验操作与结果分析
在实验操作中，我们可以采取如下步骤来进行流速与分离度的优化方法：
1. 预先准备好所需的色谱柱和检测设备。
2. 根据样品特性与实验目的，选择初始流速进行实验。
3. 进行分析，记录实验数据，比较不同流速下的分离效果与峰形。
4. 如果分离度不理想，逐渐减小流速，并重复步骤3，直至获得最佳的分离结果。
5. 在最佳流速下，进一步观察其他参数如温度对分离度的影响，并进行相应的调整。
6. 对实验结果进行分析，总结流速与分离度的优化方法，并根据实验需求进行相应的调整。
总结：
流速与分离度在高效液相色谱法中起着重要作用。
通过选择适当的初始流速、逐渐减小流速、流速梯度调整等方法，可以优化分离效果。
同时，要综合考虑其他
参数与流速的关系，找到最佳的实验条件。
通过实验操作与结果分析，可以得出流速与分离度的优化方法，并为实验结果提供科学依据。