显微镜的使用及细胞的革兰氏染色
革兰氏染色技术关键操作步骤
革兰氏染色技术关键操作步骤革兰氏染色技术（Gram staining）是微生物学中常用的染色方法，利用这种方法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
它是由丹麦细菌学家Christian Gram于1884年发明的，被广泛应用于细菌的鉴定和分类。
革兰氏染色技术的关键操作步骤包括以下几个方面：一、准备细菌培养物在进行革兰氏染色之前，首先需要准备细菌培养物。
通常使用处于对数生长期的细菌培养物，用无菌技术从培养物中取一小滴液体，均匀涂抹在玻璃片上，制备细菌涂片。
二、固定细菌涂片细菌涂片需要进行固定，以保持细菌的形态特征。
常用的固定剂是甲醇或乙醇，将涂片逐渐浸入固定剂中，浸泡数分钟至数十分钟，然后取出晾干。
三、染色1. 注碘液处理在固定的细菌涂片上滴加碘液，覆盖整个涂片。
碘液可以使细菌细胞内的格拉氏阳性菌染成紫色。
2. 酒精洗涤用酒精溶液冲洗细菌涂片，直至涂片上的紫色不再出现，一般持续几秒至十几秒钟。
这一步是关键的洗涤步骤，通过酒精的洗涤，可以去除革兰氏阴性菌的多余染色。
3. 闪碱洗涤用闪碱洗涤涂片，一般可以持续几秒至十几秒钟。
闪碱的作用是去除细菌涂片上的酒精和碘溶液，同时使革兰氏阳性菌继续保持紫色。
4. 洗涤与干燥最后用清水冲洗细菌涂片，使其干燥。
四、观察与解读完成染色步骤后，可以使用显微镜观察细菌涂片。
革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，革兰氏阴性菌在染色后呈红色。
观察细菌的形态、大小、排列方式等特征，进一步判断和鉴定细菌。
总结与回顾：革兰氏染色技术是微生物学中常用的染色方法，它可以通过染色结果将细菌分为两大类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色的关键操作步骤包括准备细菌培养物、固定细菌涂片、染色、观察与解读。
其中，注碘液处理、酒精洗涤和闪碱洗涤是整个染色过程中的核心步骤，通过这些步骤的操作，可以使革兰氏阳性菌保持紫色，革兰氏阴性菌去除多余染色。
对于细菌的鉴定和分类来说，革兰氏染色技术是一个简单、快速且有效的方法。
微生物的观察及革兰氏染色
实验日期：2017.10.25 实验班级：生物技术指导教师：张建丽姓名：高熹学号：1120152430环境中微生物的分离和纯化1 实验目的1）了解培养基的制备原则和制备程序，熟悉常用培养基的名称2）掌握微生物的分离、接种技术3）了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围，掌握高压蒸汽灭菌的操作方法2 实验原理2.1 显微镜及油镜2.1.1 显微镜普通光学显微镜是由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成。
机械系统包括镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒及调节器等。
镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上；镜台又称载物台，是放置标本的地方，镜台上有压片夹用以固定被检标本，标本移动器可使标本前后和左右移动，有的标本移动器带有游标尺，可指明标本所在位置；镜臂用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位；镜筒是连接目镜和物镜的金属筒，镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接；物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3~5个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器随意选用合适的物镜；调节器安装在镜臂基部，是调节物镜与被检标本距离的装置，通过调节粗、细螺旋便可清晰地观察到标本。
光学系统主要包括目镜、物镜、聚光镜和反光镜等，较好的显微镜有内光源。
目镜一般由两块透镜组成，不同的目镜上刻有5×、10×和15×等字符以表示该目镜的放大倍数；物镜是显微镜中很重要的光学部件，由多块透镜组成，根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜等。
被检物体经显微镜的目镜和物镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积。
2.1.2 油镜油镜是实验室常用的显微镜之一，清晰度略高于普通光学显微镜，用于观察衣原体，细菌，细胞器等较细微的结构。
使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。
这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。
革兰氏染色及镜检sop
革兰氏染色及镜检SOP1. 目的规范革兰氏染色及镜检的标准操作规程，确保试验的准确性。
2. 范围本标准适用于革兰氏染色及镜检的操作。
3. 定义3.1.革兰氏阳性菌（G+）：G+的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成。
在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
3.2.革兰氏阴性菌（G-）：G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高。
当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
4. 职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量总监负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准无6. 材料6.1.仪器、实验用具：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环。
6.2.试剂与配制革兰氏染色液、95%乙醇、香柏油、二甲苯和0.9%氯化钠溶液。
结晶紫溶液：称量2g结晶紫于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入100ml烧杯中，量取95%乙醇20ml 将其溶解；草酸铵溶液：称量0.8g草酸铵于200ml烧杯中，量取80ml纯化水将其溶解；结晶紫染色液：将配好的结晶紫溶液倒入草酸铵溶液中，混匀，静置24h后过滤即成结晶紫染色液；此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。
碘化钾溶液：称量2gKI粉末，转移至200ml烧杯中，量取100ml的纯化水将其充分溶解；碘溶液：称量1g碘颗粒于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入500ml烧杯中，量取200ml纯化水倒入并碘染液：将配好的碘化钾溶液倒入碘溶液中，混匀即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。
沙黄溶液：称量0.25g沙黄于200ml烧杯中，量取95%乙醇10ml将其溶解；沙皇（番红）复染液：待沙黄溶液完全溶解后加纯化水定容至100ml，混匀即成。
革兰氏染色的原理流程及颜色反应
革兰氏染色的原理流程及颜色反应下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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实验二 细菌的革兰氏染色法
实验二细菌的革兰氏染色法一、目的要求1.掌握革兰氏染色的方法及原理。
2.进一步熟悉显微镜的使用二、基本原理1. 革兰氏染色的意义：革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医生Gram 创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。
2. 革兰氏染色的原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤1. 涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。
2. 干燥室温自然干燥。
3. 固定固定时通过火焰2～3次即可。
此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4. 初染加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。
5. 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
6. 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察目的要求
细菌三型、金黄色葡萄球菌、链球菌、变形 杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、破伤风梭菌、 炭疽杆菌、园褐固氮菌、霍乱弧菌等固定装 片
实验程序Ⅰ（显微镜的使用）
主要是油镜的使用
1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
2.调节光亮度
3.低倍镜观察：粗调、细调
4.
依次再进行中倍、高倍观察
5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光
镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏
油中，细调至看清物象为止。
6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。
7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去
镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残
留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体
二、基本原理
微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段， 个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作 为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或 细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、 平板计数法、光电比浊法等。
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种 特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接 计数的一种简便、快速、直观的方法。
实验六、七
培养基的制备和灭菌
一、目的要求
学习和掌握各种培养基的制备方法，其中包 括培养基的配制，包扎及灭菌技术。
熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及 操作方法。
二、基本原理
➢培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法 配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及 水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能 表现它们最大生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH 值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成 可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体 培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、 鉴别培养基。
革兰氏染色法步骤详解
革兰氏染色法步骤详解革兰氏染色法是微生物学中常用的染色方法之一，用于区分细菌的结构和特征。
本文将深入讨论革兰氏染色法的步骤，并提供对这个方法的观点和理解。
一、引言在微生物学中，革兰氏染色法是一种重要的技术手段，通过染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
这个方法的基本理念是利用染料与细菌细胞壁的化学成分相互作用，以实现细菌分类和分析的目的。
二、步骤详解1. 准备细菌标本在进行革兰氏染色前，需要准备细菌培养物或细菌纯培养物作为标本。
可以从实验室中的细菌培养物中选取一个单一的菌落，或者从培养基上划取一小段细菌生长物。
2. 固定细菌标本取一片清洁的玻璃载玻片，利用火焰将其杀菌。
将玻片放在洁净的培养皿中，并滴加一滴蒸馏水。
用平净的无菌棒或无菌铂丝取一小部分细菌标本，涂抹在玻片上。
用火焰消毒无菌棒或无菌铂丝，然后将其放回细菌培养物中。
3. 固定细菌标本将滴有细菌标本的玻片迅速通过火焰，使细菌固定在玻片上。
这一步骤中的火焰杀菌具有重要意义，可以避免后续步骤中的交叉污染问题。
4. 革兰氏染液的使用革兰氏染液通常由蓝色染料结晶紫（crystal violet）、碘化物、脱色剂和红色染料伊苏胺组成。
将预先制备好的革兰氏染液滴在固定的细菌标本上，让其覆盖整个玻片。
5. 染色时间控制整个样本与染色剂接触的时间是关键因素之一，通常控制在1分钟左右。
过长或过短的染色时间都会对结果产生影响，甚至会导致假阳性或假阴性。
6. 去色在染色后，用脱色剂洗去多余的染色剂。
一般来说，用酒精或乙醚轻轻洗涤玻片，直到洗涤剂下流出的颜色不再变深为止。
7. 洗净将玻片放在自来水龙头下冲洗，直到洗涤液中不再有染色剂冲走为止。
这个步骤至关重要，因为过多的染色剂残留可能影响结果的准确性。
8. 透明化将玻片轻轻摇干，然后在显微镜下观察。
可以用透明液（一般为苏木精或环己烷）再次冲洗玻片，使细菌更加透明。
9. 观察细菌将处理过的玻片放在显微镜下观察。
革兰氏染色实验报告
革兰氏染色实验报告革兰氏染色实验报告引言：革兰氏染色是微生物学中一项重要的实验技术，它能够将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类。
本次实验旨在通过革兰氏染色的方法，观察和区分不同类型的细菌。
实验材料与方法：本次实验所使用的材料包括：革兰染色试剂盒、革兰阳性细菌培养物、革兰阴性细菌培养物、无菌玻璃片、显微镜等。
1. 准备工作：首先，将革兰染色试剂盒取出并按照说明书中的步骤进行试剂的配制。
确保试剂的浓度和比例正确。
2. 样本制备：将革兰阳性细菌培养物和革兰阴性细菌培养物分别取出一小部分，用无菌棉签将其均匀涂抹在两块无菌玻璃片上。
3. 革兰染色操作：将涂有细菌的玻璃片依次经过以下步骤进行染色：a. 将玻璃片在火焰中迅速燃烧一下，以杀灭细菌。
b. 将玻璃片放入革兰碘液中浸泡1分钟，使细菌固定。
c. 用蒸馏水冲洗玻璃片，去除多余的碘液。
d. 将玻璃片放入革兰洗涤液中浸泡30秒，去除细菌外层的染色剂。
e. 用蒸馏水冲洗玻璃片，去除多余的洗涤液。
f. 将玻璃片放入革兰颜色素中浸泡1分钟，使细菌染色。
g. 用蒸馏水冲洗玻璃片，去除多余的颜色素。
h. 将玻璃片放入革兰酒精溶液中浸泡30秒，使细菌脱色。
i. 用蒸馏水冲洗玻璃片，去除多余的酒精溶液。
j. 将玻璃片放入革兰颜色素中浸泡1分钟，使细菌重新染色。
k. 用蒸馏水冲洗玻璃片，去除多余的颜色素。
l. 将玻璃片晾干。
4. 显微镜观察：将染好色的玻璃片放置在显微镜上，调节倍率和焦距，观察细菌的形态和染色情况。
结果与讨论：通过显微镜观察，我们可以清晰地看到革兰阳性细菌和革兰阴性细菌在染色后的差异。
革兰阳性细菌：在显微镜下观察，革兰阳性细菌呈现出紫色或蓝色，形态较为饱满，细胞壁厚而坚固。
典型的革兰阳性细菌有葡萄球菌和链球菌等。
革兰阴性细菌：在显微镜下观察，革兰阴性细菌呈现出红色或粉红色，形态相对较小且较细长，细胞壁较薄。
典型的革兰阴性细菌有大肠杆菌和沙门氏菌等。
革兰氏染色的原理是基于细菌细胞壁的差异。
革兰氏染色及镜检操作规范培训
1．李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成
为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立
之势”。这说明该企业的创办
()
A．打破了外商对中国航运业的垄断
B．阻止了外国对中国的经济侵略
C．标志着中国近代化的起步
D．使李鸿章转变为民族资本家
解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家； 洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业 的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵 制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D 三项表述都有错误。 答案：A
1、制片 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载
玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。
为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态， 可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液 中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。
若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的 菌液，则直接涂布于载玻片上即可
解析：从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状， 20世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中国铁路 权益。B项说法错误，C项不能反映漫画的主题，D项时 间上不一致。 答案：A
[典题例析] [例2] (2010·福建高考)上海是近代中国茶叶的一个外销
中心。1884年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海
调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。 观察菌落形态及菌体的颜色。 革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈
红色。
六、革兰氏染色图片
革兰氏染色的大肠杆菌
革兰氏染色的金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌
革兰染色的伤寒沙门菌
革兰染色的福氏志贺菌
革兰氏染色法实验报告
革兰氏染色法实验报告革兰氏染色法实验报告引言：革兰氏染色法是微生物学中常用的染色方法之一，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
本实验旨在通过革兰氏染色法的应用，观察不同菌落的染色效果，进一步了解细菌的结构和分类。
实验材料与方法：1. 实验菌株：选择了两种细菌，分别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
2. 培养基：使用了含有足够营养物质的琼脂培养基。
3. 革兰氏染色试剂：包括结晶紫、碘酒和乙醇。
4. 实验器材：无菌培养皿、移液管、显微镜等。
实验步骤：1. 在无菌培养皿上分别接种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并在恰当的温度下培养。
2. 将培养皿中的菌落取出，用无菌移液管加入适量的生理盐水，悬浮菌落。
3. 取一滴悬浮的菌液，滴于载玻片上，用火焰消毒玻片。
4. 将滴有菌液的玻片放在炉子中，用火焰烘烤至完全干燥。
5. 滴加结晶紫染色液，静置片面染色1分钟。
6. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。
7. 滴加碘酒，静置片面染色1分钟。
8. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。
9. 滴加乙醇，静置片面脱色30秒。
10. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。
11. 用吸水纸轻轻吸干玻片上的水分。
12. 将玻片放在显微镜下，观察菌落的染色效果。
实验结果与讨论：在显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
这是因为在革兰氏染色法中，结晶紫染色液可以渗透进细菌细胞的胞质，使细菌呈紫色。
而碘酒可以形成结晶紫-碘复合物，使细菌细胞内的染色物质更稳定，不易被乙醇脱色。
乙醇的作用是脱去细菌细胞外的结晶紫，但革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚，结晶紫不易脱色，因此呈紫色；而革兰氏阴性菌由于细胞壁较薄，结晶紫易被脱色，因此呈红色。
通过实验可以发现，革兰氏染色法是一种简单而有效的方法，可以快速区分细菌的类型。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞结构上有所不同，革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，含有较多的胞质，而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，胞质较少。
这种区别导致了革兰氏染色法的染色效果不同。
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1 微生物实验报告 ——显微镜的使用及细胞的革兰氏染色 摘要 关键词 实验目的 A. 普通显微镜的基本原理 B. 简单染色的原理 C. 革兰氏染色的基本原理 实验原理
实验器材 实验内容 A. 显微镜的构造及其使用 B. 简单染色 C. 革兰氏染色 D. 平板划线法 2
实验结果 参考文献 报告编写人：张行润 显微镜的使用及细胞的革兰氏染色 山东大学生命科学学院09级四班 张行润 200900140177
摘要 显微镜的使用在我们学习微生物等课程中非常重要，历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展；给人类的生活带来了空前的拓展。在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为我们的一项基本技能。 为了研究细菌的形态，微生物学家发明了对细菌的染色，用两种以上的称复染，革兰氏发明了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰氏染色。革兰氏染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。由于细菌的结构上的差异，形成了不同的染色效果。了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定。
关键词
显微镜的使用（Use of Microscope）革兰氏染色（Gram stain）复染（counterstain） 媒染（mordant
dyeing） 脱色（discoloration）
一、实验目的 1、显微镜的构造及使用 2、学习涂片、染色等基本技术 3、初步认识细菌形态 4、掌握革兰氏染色法
二、实验原理
A、普通显微镜的基本原理 1、基本原理 显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波 3
长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
2、油镜 微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系）， 而是一层油脂，称为“油浸系”。利用油镜的目的是增加显微镜的分辨力。
B、简单染色的原理 利用单一染料对菌体进行染色的方法叫做简单染色。常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上； 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
C、革兰氏染色的基本原理 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。
G+ G- 1）G＋菌： 4
细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 2）Gˉ菌： 肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
三、实验器材 1、菌种： 金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G-）、枯草芽孢杆菌以及自选菌种 2、溶液和试剂： a) 结晶紫、番红等各种染料以及碘液、酒精等 b) 香柏油、二甲苯等 3、仪器及其它用品： 普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等
四、实验内容
1、 显微镜的构造及其使用 a） 显微镜的基本结构
实物图 结构图 现代普通光学显微镜由机械系统和光学系统两大部分组成。 机械系统主要包括：镜座、镜臂、载物台、转换器、调节装置等组成。 光学系统主要包括：物镜、目镜、聚光器、光源等组成。
b） 显微镜的使用方法 5
1、安放 右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。桌面要清洁、平稳，要选择临窗或光线充足的地方。单筒的一般放在左侧，距离桌边3～4厘米处。 2、低倍镜观察 先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。 3、高倍镜观察 显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。有些简易的显微镜不是共焦点，或者是由于物镜的更换而达不到共焦点，就要采取将高倍物镜下移，再向上调准焦点的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足够的光锥角度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。
4、油浸镜观察 油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。 使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。
注：使用显微镜进行观察时应用双眼 2、 简单染色
详细步骤： 涂片
干燥固定染色水洗干燥镜检 6
1) 涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴生理盐水，用接种环无菌操作将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；
2) 干燥 自然干燥或用电吹风吹干； 3) 固定 涂菌面朝上，通过火焰以固定菌物，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；
4) 染色 将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1·5min 5) 水洗 倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；
6) 干燥 用吸水纸吸去多余水分后自然干燥； 7) 镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录； 3、 革兰氏染色
洗片干燥涂片加热使其干燥结晶紫染色水洗碘液冲洗
水洗乙醇脱色 7
重要步骤 1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用记号笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、 涂片： 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、 染色：在固定过的涂片滴加草酸铵结晶紫液，染1.5min。 6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。 7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、 复染：滴加蕃红复染1.5min，水洗。
4、平板划线法
1. 倒平板： 待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒十个平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 2. 划线： 将挑有样品的接种环在平板上培养基上作连续划线（如下图所示），划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于恒温箱种培养。
水洗番红复染水洗干燥镜检