【学习课件】第六章(酶工程)酶、细胞、原生质体固定化
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第六章固定化酶
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
50
迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
51
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
第六章固定化酶?第一节概述?第二节固定化酶的制备?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第四节固定化细胞?第五节固定化辅酶和原生质体?第六节固定化酶细胞的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇间歇吸附包埋交联化学连续材料材料膜固定膜固定酶液固定化再循环系统再循环系统连续连续间歇间歇间歇间歇第一节概述固定化酶的发展史凝胶吸附化学连接物凝胶吸附半连续分批连续活塞模式搅拌连续反应器连续活塞模式搅拌连续反应器图61生物催化剂作用方式示意游离酶在使用过程中不足之处
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
50
迄今已有许多酶用离子结合法固定化， 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基 酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡 聚糖凝胶固定化的。
51
DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶： 将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用0.5mol/LNaOH 和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗酶液( 水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g 湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸 去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗 涤固定化酶，置4℃备用。
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
第六章固定化酶?第一节概述?第二节固定化酶的制备?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第三节固定化酶的性质及其影响因素?第四节固定化细胞?第五节固定化辅酶和原生质体?第六节固定化酶细胞的应用生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇间歇吸附包埋交联化学连续材料材料膜固定膜固定酶液固定化再循环系统再循环系统连续连续间歇间歇间歇间歇第一节概述固定化酶的发展史凝胶吸附化学连接物凝胶吸附半连续分批连续活塞模式搅拌连续反应器连续活塞模式搅拌连续反应器图61生物催化剂作用方式示意游离酶在使用过程中不足之处
郭勇酶工程(第三版)第六章固定化酶
Chapter 6
Immobilized Enzyme
第六章 固定化酶和固定化细 胞、原生质体
制作：郑穗平
酶催化的优点 ——作为一种生物催化剂，酶参与生物 体内的各种代谢反应，具有专一性强、 催化效率高及作用条件温和等优点。
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配臵一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 （N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰
胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温
与一定量的酶液等混合 均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二 胺，混合后让其静臵聚合即可获得。 优点：机械强度高，可调节凝胶孔径 缺点：丙烯酰胺单体有毒性
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水 中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C， 与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到 预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植 物油中，成型后再臵于氯化钾溶液中的到 球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中， 加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一 定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的 胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能 试剂交联。
Immobilized Enzyme
第六章 固定化酶和固定化细 胞、原生质体
制作：郑穗平
酶催化的优点 ——作为一种生物催化剂，酶参与生物 体内的各种代谢反应，具有专一性强、 催化效率高及作用条件温和等优点。
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 先配臵一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 （N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰
胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温
与一定量的酶液等混合 均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二 胺，混合后让其静臵聚合即可获得。 优点：机械强度高，可调节凝胶孔径 缺点：丙烯酰胺单体有毒性
将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水 中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C， 与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到 预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植 物油中，成型后再臵于氯化钾溶液中的到 球状固定化颗粒。 优点：通透性能好，对细胞无毒害。
（4）明胶包埋法 将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中， 加热溶解。灭菌后冷却到35°C以上，与一 定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的 胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能 试剂交联。
酶工程 第六章
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失较少。但 由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢 固，在pH值和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以 用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制 好pH值、离子强度和温度等操作条件。 (2)共价健结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化 方法称为共价键结合法。 共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖 凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇 共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、 巯基．羟基、酚基和咪唑基等。
第二节 酶和菌体固定化
此外迭氮基团还可以与酶分子中的羟基、巯基等反应， 而制成固定化酶
第二节 酶和菌体固定化
③溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝 胶、葡聚糖凝胶等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生 物：
活化载体上的亚氨碳酸基团在微碱性的条件下，可与 酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成
第二节 酶和菌体固定化
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或 咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
②迭氮法：含有酞肼基团的载体可用亚硝酸活化，生 成迭氮化合物。例如：羧甲基纤维素的酰肼衍生物可与亚 硝酸反应生成羧甲基纤维素的迭氮衍生物。其反应式如下：
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第一节 酶固定化
随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展，工业化生 产的酶越来越多，酶的应用越来越广泛。现在酶在食品、 轻工、医药、化工、分析检测、环境保护和科学研究等方 面的应用均已取得了显著的成效。然而在使用酶的过程中， 人们也注意到酶的一些不足之处。例如： (1) 酶的稳定性较差，在温度、pH值和无机离子等外 界因素的影响下，容易变性失活。 (2) 酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反 应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶 仍有较高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的 方式，不仅使成本较高，而且难于连续化胶、角叉菜胶、 明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成 凝胶。天然凝胶在包埋时条件温和，操作简便，对酶活性 影响甚少，但强度较差。而合成凝胶的强度高，对温度、 pH值变化的耐受性强，但需要在一定的条件下进行聚合反 应，才能把酶包埋起来。在聚合反应过程中往往会引起部 分酶的变性失活，应严格控制好包埋条件。 酶分子的直径一般只有几十埃，为防止包埋固定化后 酶从疑胶中泄漏出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直 径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物的 扩散出去都是不利的。所以凝胶包埋法不适用于那些底物 或产物分子很大的酶类的固定化。而在细胞固定化中，凝 胶包理法是应用最广的方法。各种凝胶由于特性不同，它 们的具体包理方法和包埋条件也不一样，有关内客将在本 章第二节中阐述。
酶工程第六章 固定化酶
酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物，再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme)， 是指在一定的空间范围内起催化作用，并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同 时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（1）物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。
如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。