人民医院基因扩增实验室淋球菌核酸定量检测标准操作程序
临床基因扩增检验实验室室间质评标准操作程序
临床基因扩增检验实验室室间质评标准操
作程序
临床基因扩增检验实验室室间质评标准操作程序
一、目的：
本程序的目的是确保实验室实验检测结果的准确性，以保证临床实验检测的质量。
二、适用范围：
本程序适用于卫生部或省临检中心下发的室间质控物。
三、职责：
本程序由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：
1、质控标本的接收和验收：
收到质控标本后，相关人员应登记、签字，并根据质控标本的有关说明对标本的数量、批号、包装进行验收。
质控标本应按要求置于标本制备区内并保存于-20℃。
2、质控标本的检测：
质控标本的检测应按常规临床标本对待。
如有需要，检测前应先根据说明对质控物进行复溶。
3、室间质评样本的检测：
室间质评样本的检测必须按实验室常规工作进行。
进行常规工作的人员应使用实验室的常规检测方法和试剂，不得特殊对待。
检测结果应在截止日期前上报。
4、实验室检测EQA样本的次数：
实验室检测EQA样本的次数必须与常规检测病人样本的次数一样，即1次。
5、样本的检测时间和结果上报：
样本的检测应在部或省临检中心规定的时间内进行，检测结果的上报也必须在截止日期前通过E-mail或挂号信寄出。
6、室间质评记录：
室间质评的检测结果和反馈结果应记录于室间质评记录表内。
根据反馈结果分析室间质评的状态，如有出控应查找原因，并采取相应的措施。
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则一、实验室安全1.实验室必须符合相关的安全规范和操作规程，例如防火、防爆、防尘和环境污染控制。
2.所有实验室人员必须进行安全培训，并熟悉实验室的安全操作规程。
3.实验室设备和试剂必须定期检查和维护，确保其正常运行且不存在安全隐患。
二、样本接收与标本处理1.所有样本必须按照相关规定的方法和时间接收，并尽快进行处理。
2.接收样本时必须进行必要的标识和记录，并确保样本的完整性和唯一性。
3.样本处理必须按照相关的规范进行，包括离心、分装、保存和运输。
三、实验室质量控制1.实验室必须建立质量控制体系，确保实验的准确性和可靠性。
2.每次实验必须进行内部质控和外部质控样品的检测，并记录结果。
3.实验室必须参加相关质控活动，比如参加外部质量评估和互认活动。
4.实验室必须建立相关的质控指标和标准，确保实验的准确性和可靠性。
5.实验室必须建立完整的质量文件和记录，方便质量评审和内外审计。
四、实验操作规范1.实验室必须建立标准的实验操作规范，确保实验的准确性和可重复性。
2.每个实验人员必须按照规定的实验操作流程进行实验，并记录实验结果。
3.实验室必须建立实验数据的记录和存档机制，确保数据的完整性和可追溯性。
4.实验室必须定期对实验操作进行评估和培训，提高实验人员的技术水平和操作规程的遵守性。
五、实验室设备和试剂管理1.实验室设备必须定期检查和维护，确保其正常运行且符合质量要求。
2.实验室试剂必须按照相关规范和标准进行采购和存储。
3.实验室必须定期对试剂进行检查和过期处理，确保试剂的有效性和安全性。
4.实验室必须定期对试剂进行库存管理，确保试剂的供应和使用的连续性。
六、实验室环境和废物处理1.实验室必须保持干净、整洁和无杂乱物品的工作环境。
2.实验室必须建立废物处理制度，确保废物的分类、储存和处理符合相关规范和要求。
3.实验室必须建立应急预案，以应对可能发生的突发事件和意外事故。
七、数据管理和隐私保护1.实验室必须建立完善的数据管理系统，确保实验数据的安全和可靠性。
临床基因扩增实验室标准操作程序
**医院检验科程序文件临床基因扩增检验实验室标准操作程序文件编号：版本：第*版依据ISO15189:2003《医学实验室—质量和能力的专用要求》编制编制：审核：批准：生效日期：年月日**医院检验科程序文件版序控制**医院检验科程序文件临床PCR实验室程序文件编号：版本：第* 版生效日期：目录冰箱使用、维护保养标准操作程序1．目的：确保冰箱内温度恒定（冷藏室：4ºC，冷冻室：-20 ºC）。
2．适用范围：PCR实验室所有冰箱。
3．操作人：PCR实验室工作人员。
4．操作步骤：4.1冰箱应放置于水平地面并留有一定的散热空间。
4.2外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。
4.3冰箱内禁止存放与本实验室无关的物品。
4.4放入冰箱内的所有试剂、样品、质控品等必须密封保存。
4.5保持冰箱出水口通畅；非自动除霜冰箱应定期除霜；定期清洁冰箱，清洁时切断电源，用软布蘸水擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂。
4.6 每天由PCR实验室人员负责观察冰箱内温度并记录于表中（要求冷藏2-8°C，冷冻室-20°C），每月一张，一年装订成册存档。
冰箱内温度计必须经过计量校准。
4.7若温度超出规定范围，调节温控使其回到正常范围，并进行记录。
4.8若温控调节无效，报请科主任，由设备科维修，修理后须验收合格并签字后方能正常使用。
5．本制度的变动程序本制度的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报上级负责人决定。
如通过则公布实行。
6．引用文件和表格6.1 冰箱温度记录表可移动紫外消毒车使用、维护保养标准操作程序1．目的：确保可移动紫外消毒车正确使用，保障实验室紫外消毒的有效性。
2．适用范围：PCR实验室所有可移动紫外消毒车。
3．操作人：PCR实验室工作人员。
4．操作步骤：4.1打开移动紫外消毒车上的防尘罩卡门，打开防尘罩。
4.2打开移动紫外消毒车头上的卡门栓，将紫外灯架展开到一定高度（90-160度角）。
临床基因扩增检验操作规范-文档资料
1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记，如加样器或试剂等。 3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、 标本 Evaluation only. 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简 eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 称扩增区）至产物分析区。 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd. 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。
Evaluation only. eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd.
各室功能：
（一）试剂贮存和准备区
Evaluation only. 功能： eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd. 贮存试剂的制备、试剂的分装和主
尚世强
一、临床基因扩增检验实验室的
Evaluation only. eated with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0 二、各阶段操作要求 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd.
规范化设置及其各室的功能
反应混合液的制备。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都 应快速离心数秒。
戴手套。
淋球菌SOP
淋球菌抗菌检测(乳胶法)操作规程检测原理：淋球菌抗原检测试剂盒(乳胶法)采用高度特异性的抗原抗体反应原理及免疫层析技术，试剂含有被预先固定于膜上检测区的淋球菌抗体。
检测时，将裂解过的样本滴入试剂加样孔内，样本与预包被的乳胶颗粒结合的淋球菌特异性的抗体产生特异性反应。
然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。
如是阳性，乳胶-抗体复合物在层析过程中先与样本中的淋球菌抗原结合，随后结合物会被固定在膜上淋球菌特异性抗体结合，在检测区（T）内会出现一条红色条带。
如是阴性，则检测区（T）内将没有红色条带。
无论淋球菌抗原是否存在于临床样本中，一条红色条带都会出现在质控区（C）内。
质控区（C）内所显现的红色条带是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
操作步骤：1.裂解管中滴入A 6滴。
2.放入棉签，挤压棉签头，转动棉签15次，静置2分钟。
3.滴入B 4滴，挤压棉签头，转动棉签15次，静置1分钟，挤干棉签头后取出棉签，盖上旋紧。
4.在试剂的加样孔中滴入 3 滴，10-20min判读结果，20min后判读无效。
检验结果解释：阳性（+）：两条红色条带出现。
阴性（-）：仅质控区（C）出现一条红色条带。
无效：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏。
注意事项：1.仅适用于女性宫颈拭子和男性尿道拭子样本的检测，使用其他样本检测结果可能有误。
2.仅用于定性检测，如需确诊，需结合临床症状并进行进一步实验室检查。
3.只能使用包装内提供的配套裂解液，且不同批号裂解液不能混用。
4.本试剂为目视检测，未避免误判，请勿在光线昏暗判读结果。
临床基因扩增检验实验室室内质控标准操作程序
临床基因扩增检验实验室室内质控标准操作程序一、目的：随时了解并控制实验室检测的精密度变化，以保实验的质量。
二、适用范围：临床基因扩增检验实验室所检测的实验项目。
三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：1、血清质量控制品1）质控品的来源：卫生部、省临检中心或自备2）质控品制备：收集本室检测的临床样本，HBV-DNA定量为107copies/ml的样本混匀，并分装于0.5ml的离心管中，每支60µl，-20℃保存。
每次检测过程中将此分装的室内质控品与样本同时检测，记录此标本的检测结果，计算20次检测结果的平均值作为本批质控品的靶值，并计算标准差进行室内质控图的制作。
3）质控品与样本同时处理，排列顺序为：标准品或校准品，阴性质控品，阳性质控品，临床样本。
4）质控品实验结果合格，即发报告；实验结果不合格，报告室主任，会同有关人员，查找原因，妥善解决。
5）每次检测质控结果须有记录，若失控也须记录失控原因及纠正措施。
2、室内质控图的使用1）图中X线为靶线，X±2s为警告线，X±3s为失控线。
对于同一批号的质控血清不论使用几个月，其质控图均不变化。
只要将图纸上方“起止日期”项填入每个月的实际起止日期即可。
2）每天将该批号质控血清按有关规定程序复融随同病人的标本同时检测。
将日期、检测结果和操作者如实记录在图下方的相应位置，并按前面的方法画出图上的对应点，用直线将该点与前一天的点连接。
3）若如果在X±3s线以外，则为失控，应立即报告有关负责人，迅速查找原因。
必要时复测标本，然后方可发出报告，并将失控情况、查找过程及处理结果等详细记录。
4）如果在X±3s线以内、X±2s线以外，或出现连续6点以上在一侧等规律变化，均应即刻向有关负责人反映，并积极查找原因。
但当天的检验结果一般可以发出。
5）月底计算当月全部质控血清检测结果的 X、s和CV，并进行图形分析和小结，将质量控制图存入质控资料档案。
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则一，临床基因扩增检验实验室的设计（一）临床基因扩增检验实验室区域设计规划。
原则上临床基因扩增实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区，标本制备区，扩增区，扩增产物分析区。
这四个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分割状态，不能有空气的直接相通。
根据使用仪器的功能，区域可适当合并。
例如使用实时荧光PCR仪，扩增区，扩增产物分析区可合并；采用标本处理，核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区，扩增区，扩增产物分析区可合并。
各区的功能是：1，试剂储存和准备区：贮存试剂的制备，试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管，吸头等消耗品的贮存和准备。
2，标本制备区：核酸（RNA ,DNA）提取，贮存及其加入至扩增反应管。
对于涉及临床标本操作，应符合生物安全二级实验室防护设备，个人防护和操作规范的要求。
2，标本制备区。
（1）2~8冰箱，-20℃或-80℃冰箱。
（2）高速离心机。
（3）混匀器。
（4）水浴箱或加热模块。
（5）微量加样器（覆盖0.2~1000ul）。
（6）可移动紫外灯（近工作台面）。
（7）生物安全柜。
（8）消耗品：一次性手套，耐高温处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。
（9）专用工作服和工作鞋（套）。
（10）专用办公用品。
（11）如需处理大分子DNA，应当具有超声波水浴仪。
3，扩增区。
（1）核酸扩增仪。
（2）微量加样器（覆盖0.2~1000ul），（视情况定）。
（3）可移动紫外灯（近工作台面）。
（4）消耗品：一次性手套，耐高温处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。
（5）专用工作服和工作鞋（套）。
（6）专用办公用品。
4，扩增产物分析区。
（1）微量加样器（覆盖0.2~1000ul）。
（2）可移动紫外灯（近工作台面）。
（3）消耗品：一次性手套，耐高温处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则
医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则附件医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则一、临床基因扩增检验实验室的设计（一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则。
原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。
这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。
根据使用仪器的功能，区域可适当合并。
例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。
各区的功能是：1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
2.标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。
对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
3.扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。
4.扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。
（二）临床基因扩增检验实验室的空气流向。
临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。
可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。
（三）工作地区仪器设备配置标准。
1.试剂储存和准备区あ（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。
（2）混匀器。
（3）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。
（4）可移动紫外灯（近工伜台面）。
（5）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。
（6）专用工作服和工作鞋(套)。
（7）专用办公用品。
2.标本制备区。
（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。
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人民医院基因扩增实验室淋球菌核酸定量检测标准操作程序
1 项目名称
淋球菌核酸定量检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定量检测
3 方法学原理
用一对淋球菌特异性引物和一条淋球菌特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。
探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。
被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求
4.1 适用标本类型：生殖泌尿道分泌物棉拭子。
4.2 标本采集（生殖泌尿道分泌物棉拭子）
a ) 男性—用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采
集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检(采集分泌
物前2小时禁小便)。
a ) 女性生殖道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再
用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采集宫
颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。
b ) 女性尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉
拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子
置入无菌玻璃管，密闭送检。
4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5 试剂
5.1 试剂名称：淋球菌核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
5.2 生产厂家：XXXXXXXX；
5.3 试剂货号：#DA-B053；
5.4 包装规格：20人份/盒；
5.5 试剂成份：
5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 阴性质控品处理
a ) 取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml
灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒
温处理10±1分钟；
b ) 12000r/min离心5min，备用。
7.1.2 标本处理
7.1.2.1 生殖泌尿道分泌物棉拭子
a ) 向玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤
干棉拭子；
b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分
钟；
c ) 去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心
5分钟
d ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃
恒温处理10±1分钟；
e ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。
7.1.3 NGH临界阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.4 NGH强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 NGH阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用；
7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（NGH PCR 反应液40µl/人份+ Taq酶3µl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq 酶，充分混匀后按43µl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质
控品）上清液2µl，或直接加入阳性定量参考品2µl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃2分钟预变性；
93℃45秒→55℃60秒10个循环
93℃30秒→55℃45秒30个循环
8 结果判断：
8.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则实验结果判为样品的NGH DNA总含量小于检测极限。
8.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则：
a ) 若样品的C<5.00E+003，则该样品的NGH DNA总含量
<5.0×103基因拷贝/ml；
b ) 若样品的5.00E+003≤C≤5.00E+007，则该样品的NGH
DNA总含量=C基因拷贝/ml；
c ) 若样品的C>5.00E+007，则该样品的NGH DNA总含
量>5.0×107因拷贝/ml。
如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释100倍再检测。
9 质控
a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30；
b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量
参考值在6.310×106因拷贝/ml~1.×108因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在6.310×103基因拷贝/ml~1.0×105基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）；
c ) 阳性定量参考品：增长曲线不呈S型曲线，Ct值<27，且
线性相关系数0.97≤|r|≤1；
d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无
效，需重新进行。
10 参考范围
低于检测下限
11 性能指标
灵敏度：5.0×102基因拷贝/ml
线性范围：5.0×103基因拷贝/ml~5.0×107基因拷贝/ml
12 临床意义
在淋病奈瑟菌感染的实验室诊断中，尽管分泌物的分离培养是确诊淋球菌感染的可靠方法，但其操作费时繁琐，不适于大批量标本的检测，且特异性和敏感性受标本取材等因素的影响，直接涂片检测法虽快速简便，但敏感性和特异性较低，且难于与其他双球菌相区别而造成误诊。
使用PCR方法进行检测，不但敏感性和特异性大大提高，而且操作简便快速，尤其适于泌尿生殖道感染的早期诊断及无症状的携带者的检测，为临床提供及时的诊断依据。
13 注意事项
13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
13.3 对每次实验进行质量控制；
13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；
13.5 自备灭菌生理盐水；
13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；
13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。
如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样
后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；
13.8 为保证病原体颗粒充分裂解可转至4℃静置6~8小时；
13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
14 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006
中山大学达安基因股份有限公司. 淋球菌核酸定量检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2007年12月，第一版/0。