TMV、PVM和CMV干扰载体构建及对人参果的遗传转化
番茄SlWRKY40基因VIGS表达载体构建及其沉默效率检验
番茄SlWRKY40基因VIGS表达载体构建及其沉默效率检验刘波【摘要】WRKY蛋白伴随植物适应环境的过程进化而来,具有重要调节作用.番茄中存在大量WRKY基因,其功能研究却严重滞后.本实验体外扩增了番茄SlWRKY40基因,构建了pTRV-SlWRKY40病毒诱导的基因沉默表达栽体,实时定量PCR法检测了SlWRKY40在番茄中的沉默效率.结果表明该基因的沉默效率平均可以达到60％以上,单株最高可达80％左右.本实验中的工作为我们今后研究SlWRKY40的生物学功能做了必要的前期准备,同时为研究番茄WRKY家族其他成员的功能提供了技术支撑.【期刊名称】《陕西农业科学》【年(卷),期】2018(064)002【总页数】5页(P23-27)【关键词】番茄;SlWRKY40;转录因子;VIGS;沉默效率【作者】刘波【作者单位】渭南职业技术学院,陕西渭南714026【正文语种】中文病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术根据植物抵抗病毒的原理发展而来，因为具有短时间获得实验结果、不需要遗传转化、能够研究在转基因植株中致死的基因的功能等优点，已经被普遍应用于植物基因功能研究[1～3〗。
WRKY 蛋白由于独特的结构特征构成一个植物转录因子大家族[4～7]，并以特有的功能方式调控植物生理过程[4, 8～17]。
研究WRKY基因的功能对我们认识植物进而更好地改造和应用植物资源具有重要的现实意义。
番茄进化过程中形成了至少八十个WRKY基因[18]，急需对其功能展开研究。
由于其体系成熟和高效性，许多科研团队都采用由烟草脆裂病毒(TRV)改造而成的VIGS载体研究植物的基因功能。
我们从番茄中克隆了一个具有WRKY结构域的基因，将其命名为SlWRKY40。
为了后期探究其生物学功能，我们构建了SlWRKY40基于TRV的VIGS沉默表达载体——pTRV-SlWRKY40，同时检验了其沉默效率。
结果表明该基因的沉默效率平均可以达到60%以上，单株最高可达80%左右。
番茄转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将外源基因导入番茄植株，实现特定性状的表达，并研究转基因番茄的生长发育、生理特性和抗病性等方面的变化。
二、实验材料1. 番茄植株：品种为“中蔬5号”。
2. 外源基因：目的基因（如抗病基因、抗虫基因等）。
3. 载体：pGEM-T载体。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶等。
5. 试剂：植物细胞培养试剂、抗生素等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆（1）设计引物，针对目的基因进行PCR扩增。
（2）将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。
（3）挑选阳性克隆，进行测序鉴定。
2. 番茄植株的转化（1）将目的基因与载体构建成重组质粒。
（2）采用农杆菌介导法将重组质粒导入番茄植株。
（3）筛选阳性植株，进行PCR和Southern blot检测。
3. 转基因植株的筛选与鉴定（1）采用PCR和Southern blot方法检测转基因植株。
（2）对转基因植株进行抗性筛选，如抗病、抗虫等。
4. 转基因植株的表型分析（1）观察转基因植株的生长发育、生理特性和抗病性等方面的变化。
（2）对转基因植株进行产量、品质等指标测定。
四、实验结果1. 目的基因的克隆成功克隆了目的基因，并进行了测序鉴定。
2. 番茄植株的转化成功将重组质粒导入番茄植株，获得了转基因植株。
3. 转基因植株的筛选与鉴定通过PCR和Southern blot检测，证实了转基因植株的存在。
4. 转基因植株的表型分析（1）转基因植株的生长发育与对照植株无明显差异。
（2）转基因植株在抗病性、抗虫性等方面表现出显著的优势。
（3）转基因植株的产量和品质与对照植株相当。
五、讨论与分析1. 本实验成功将目的基因导入番茄植株，并获得了转基因植株，为研究转基因番茄的性状表达提供了基础。
2. 转基因植株在抗病性、抗虫性等方面表现出显著的优势，表明基因工程技术在农业生产中具有广泛的应用前景。
3. 实验结果表明，转基因番茄的生长发育、生理特性和抗病性等方面与对照植株相当，说明转基因技术对番茄的性状影响较小。
分子生物学各章节复习题
第一章1、概念：分子生物学DNA重组技术结构分子生物学“基因”的分子生物学定义：产生一条功能多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。
2、用你现有的知识解释DNA为什么是遗传信息的载体。
3、关注了解近几年诺贝尔奖获得者及其科学发现。
第二章名词解释:DNA的C值：C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。
C值矛盾（C Value paradox）：C值一般随生物进化而增加，研究发现某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，而在两栖类中C值变化也很大，这种C值与生物进化（结构和组织的复杂性）矛盾的现象称为C值矛盾。
冈崎片段DNA的半保留复制（semi-conservative replication）：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。
半不连续复制（semi-conservative replication）：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。
复制子(Replicon)：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子。
转座子（transposon）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。
反转录转座子（retrotransposon）：指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。
单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：在DNA复制过程中，稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
DNA连接酶: 双链DNA中一条链有切口，一端是3ˊ-OH，另一端是5ˊ-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接，不能将两条游离的DNA单链连接起来。
在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。
拓扑异构酶(DNA Topisomerase):拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解（消除）负超螺旋。
沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草
沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草芮鹏环;宋培培;蒋磊;江彤【摘要】[目的]本研究利用dsRNA技术沉默26基因,获得烟草品种云烟85的T1代转基因抗CMV株系.[方法]构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i),以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85.[结果]抗性筛选获得112株T0代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T0代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病.Tas-ELISA检测表明,T0代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株.选取10个T0代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T1代抗病性,发现部分T1代烟株发生一定比例的抗感分离,T1代抗性株率为46.7％～100％.Real-time PCR检测T1代烟株,发现T1代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株.[结论]基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系.【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2019(025)001【总页数】5页(P111-115)【关键词】黄瓜花叶病毒;2b基因;沉默;转基因抗病烟草【作者】芮鹏环;宋培培;蒋磊;江彤【作者单位】安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;山东省平度市农业局,山东平度266700;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036【正文语种】中文黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员[1]，其基因组含3个RNA组分，分别为RNA1、RNA2和RNA3， RNA2 3'端ORF编码2b蛋白，已证明是病毒基因沉默的抑制子[2]。
抗病毒转基因植物
抗病毒转基因植物。
植物病毒病害已成为植物病害的最大类群之一，随着基因工程技术的发展，为培育抗病毒的植物品种开辟了新的途径。
目前已有多种方法获得抗病毒转基因植物。
利用植物自身编码的抗病毒基因培育抗病毒植物。
许多植物对病毒具有天然的抗性，将这些基因克隆并转化到其他植物中，可使转化的植物获得抗病毒的能力。
已报道在植物中有几种基因，其编码的蛋白具有抗病毒的功能。
商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein，PAP)是存在于商陆叶片细胞中的一种小分子糖蛋白，它可以抑制病毒蛋白的活性，具有广谱抗病毒能力。
Lodge等将编码PAP蛋白的基因转移到烟草中，获得的转化株能抵抗多种病毒的侵染。
病毒侵染植物时，植物会产生过敏性坏死斑，而过敏性坏死斑的形成是由植物内一种称为N基因表达的结果。
多数过敏性坏死斑反应是由单个基因控制，将N基因转移到番茄中，获得的转基因番茄对烟草花叶病毒（TMV）表现了强烈的过敏反应。
此外，植物病程相关蛋白pathogenesis-related protein，PR蛋白)对病毒也表现了一定的抗性，它是植物受到病毒袭击或其他因子影响后产生的一种蛋白，它可能参与植物细胞壁的抗侵染作用。
病毒外壳蛋白转基因植物。
病毒外壳蛋白(coat protein，CP)转基因植株抗病毒的机制有两种观点：其一是认为将病毒外壳蛋白基因转移到植物细胞后，转化株内CP基因表达的蛋白能将入侵病毒裸露的核酸包裹，从而阻止入侵病毒核酸的翻译和复制；其二是认为CP基因的表达可抑制入侵病毒的脱壳，从而抑制病毒的繁殖。
自1986年Beachy等将TMV外壳蛋白基因转移到烟草后，至今已有30多种植物病毒的CP基因转移到烟草等十多种双子叶植物中，并获得了抗性强弱不等的转基因植株，某些转基因植物已释放到大田中，取得了明显的经济效益。
如Monsanto公司将TMV的CP基因转移到番茄中，转基因植株的接种后发病率小于5％，产量几乎不受影响；而对照株发病率为100％，果实减产26％—35％。
抗番茄花叶病毒RNAi载体的构建及烟草遗传转化
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文 章 编 号 ：０ ７ ７ ８ ２ ） ２０１ ３０ １ ０ — ３ ３（０１ ０ ６ １ ６
抗 番 茄 花 叶 病 毒 Ｒ Ａ 载 体 的 构 建 及 烟 草 遗 传 转 化 Ｎ ｉ
赵峰玉 ， 银英 ， 瑜 ， 亚红 ， 百明 ， 郑 张 乔 崔 向本 春
（ 河子大学农 业 物技术匝点实验窀 ／ 河子大学生命科学 院 。 河予 ８２０） 石 石 ３ ０ ３ 摘 要 ： 了获 得 抗 番茄 花 叶病 毒 的 转 基 因 烟 草 。 验 采 用 Ｒ Ｉ Ｐ Ｒ技 术 扩 增 新 疆 加工 番 茄 花 Ｉ 毒 ＿ 细 ， 后 与 为 试 ＇－ Ｃ 、 叶痫 墓 然 已 知 株 系 序 列 比 对 获 得 相 应 的 保 守 列 ， 根 据 保 守 区 选 择 干 扰 序 列 并 设 计 引 物 进 行 Ｐ Ｒ Ｃ 增 ， 建 了 构 ｐ ｉ５ ｏ ． Ｉ３ Ｓ ｏ Ｋ． Ｂ ３ Ｔ ＭＶ３３个 ＲＮ 表 达 载 体 ： Ｂ３ Ｓ】 ５ ｐ￣ ５ Ｔ Ｂ ｐ ｉ ｏ 、 ｉ ５ Ａｉ 利Ⅲ 农 杆 菌介 导 法 分 别 将 表 达 载 体 促 普 通 烟 ． 化 转
ｔｖ ｌ ｎ ｇｅ ｉ ａ ｓｗ ｅ ｅ ｏｂ ａ ｎ ｄ ｓ ｃ ｓ ｆ ｌ ｝ ｏｌｃ ａｒｉｅｎ ｉｉａ ｉｎ， ｉｅ ｔ。 ｓ ｎｃ ｐｌｎｔ ｒ ｔ ｉ ｅ ｕｃ ｅ ｓ ｕｌｙ ｌ ｍ ｅ ｕｌ ｄ ｔｆｃ ｔｏ ｗｈｉｈ ａｓ ｏ ｄｅ ｏｕｎ ｌｏｎ ｆ ｕ ｔ ｅ ｘｐｅ ｉ ａ ｙ ｃ ｌｏ ｐｒ ｖｉ ｓａ ｆ ｄａ ｉ ｏｒｆ ｒ ｈ ｒｅ ｒ—
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
植物表达载体构建
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
番茄的遗传转化
番茄的遗传转化班级姓名学号摘要：本研究以小型番茄为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定再生体系及遗传转化体系。
子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生，初步建立了农杆菌介导的遗传转化体系。
是目前最有效的途径之一。
农杆菌对植物释放的化学物产生趋化反应，向植物受伤组织集中。
经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。
Vir基因产物使Ti 质粒上的T—DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。
插入在T—DNA 左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物中也得到了广泛应用。
关键字：番茄下胚轴子叶转化一、实验材料、试剂和仪器设备1.实验材料：番茄种子2.试剂：大量元素、氯化钙、微量元素、铁盐、有机成分、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1mol∕LNaOH、6BA、NAA、升汞、蛋白胨、酵母粉、卡那霉素、75％乙醇3.仪器设备：天平、烧杯、量筒、移液管、药勺、称量纸、玻璃棒、吸耳球、PH 试纸、培养瓶、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅、电炉、标签纸、记号笔、滤纸、镊子、剪子、移液枪、枪头、酒精灯、培养皿二、实验步骤1.外植体的制备(1) MS培养基母液的配制按以下的成分与浓缩比例配制母液大量元素50mg∕L氯化钙50mg∕L微量元素1 mg∕L有机成分1 mg∕L蔗糖30 g∕L琼脂 6 g∕L(2)MS培养基的配置配制200ml的MS培养基，将所需要的试剂混合后加热溶解，用1mol∕LNaOH 调节PH至5.8，宁大勿小偏酸不凝固，然后分装到灭好菌的培养瓶中。
(3)高压灭菌将配制好的培养基、培养瓶、无菌水、有滤纸的培养皿灭菌(4)铺种子打开超净工作台紫外灯照射约30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台的风机。
先数好所需要的种子，放在一个小烧杯中，到入升汞，没过种子，五到六分钟。
然后回收升汞，把无菌水倒入摇晃，用灭菌好的无菌水洗3—4次，拿镊子灭菌，要灭透。
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TMV、PVM和CMV干扰载体构建及对人参果的遗传转化
人参果是以营养器官繁殖为主的多年生草本植物，连年种植容易造成多种病
毒病积累。为了培育同时抵御多种病毒病的人参果转基因植株，本试验以危害人
参果的主要病毒烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯M病毒和黄瓜花叶病毒（CMV）为
对象，筛选靶标序列，用重叠延伸PCR方法将三个靶标片段融合在一起，构建了
3种病毒基因靶标片段融合基因的植物ihpRNAi载体。
1. TMV、PVM和CMV靶标片段的选择与克隆。根据GenBank中烟草花叶病毒
（TMV）P126基因[GI:371786069]、马铃薯M病毒（PVM）CP基因[GI:361071296]
和黄瓜花叶病毒（CMV）2b蛋白基因[GI:83282715]序列，通过E-RNAi网站在线
分析，筛选出TMV P126基因片段、PVM CP基因片段和CMV2b蛋白基因片段，这
些片段含有较多有效小干扰RNA[siRNA，19nt]的长dsRNA片段，可作为构建干
扰载体的目的片段。
2.靶标片段的融合及反向重复表达载体的构建。采用重叠延伸PCR技术
（splicing-by-overlap extension PCR，SOE-PCR），首先构建融合基因PC和
TPC（正向插入片段F），再扩增反向插入片段R。
然后将正向片段TPC（F）和反向片段分别插入载体pHANNIBAL所含内含子
（intron）两侧，获得重组质粒pHAIFR，再将含intron的正反向片段整体酶切
后插入载体pCEPSPS，最终得到含融合基因TPC反向重复的植物表达载体pCEIHFR。
3.人参果的遗传转化。
将pCEIHFR通过冻融法导入农杆菌LBA4404，采用叶盘法转化人参果，获得
了人参果再生植株，为后续实验奠定了基础。并验证了人参果叶盘法遗传转化体
系中最佳的激素组合为ZT和IAA。