嗜酸乳杆菌的亚油酸异构酶基因克隆及其pMG36e表达载体的构建
LYM基因克隆构建PAbAi载体
1I 加样酶(HS) 0.5ul 前引物 1ul 后引物 1ul HS(25) dNTP (2.5mM) 1ul 30s/1Kb buffer 5 DNA 1ul 灭菌水 16.5 ul加完样后短暂离心后需将产物置于冰上数分钟后再放进PCR 仪；点样时加5ul 的marker ，根据marker 亮度来估算产物浓度。
II 目的片段回收，依据试剂盒说明书。
最后一步用加热过的ddH2O 溶解 III 回收的目的片段连接BD 载体1.1含pAbAi 载体的质粒提取：将-80℃保存的菌液划线（AD 、pAbAi 涂氨苄抗性的板，BD 涂卡那抗性的板），37℃培养14-16h,挑取单菌落摇菌，然后按照质粒提取试剂盒提取质粒即可，将提取的质粒置于-20℃保存。
（这里的质粒可以通俗的理解为载体）1.2对连接启动子的做单杂的载体pAbAi 进行双酶切，用的是SalI 和SacI, 37度酶切3个小时20ulSac I 1uL Sal I 1uL 10*T buffer BSA 3uL 2ul pAbAi 1ug H 2OUp to 20ul1.3将双酶切产物全部跑胶，检测是否双酶切成功并回收重点：将8管成功双酶切产物跑的胶收集到一个离心管里回收，目的是提高双酶切产物的浓度(大约30ng/ul即可用)，记得需要点未双酶切的质粒作为对照；回收后要跑胶检测浓度：1ul双酶切产物+1ulLoading Buffer跑胶，并且15000的Marker点5ul，根据条带亮度来判断双酶切产物浓度，条带大约7.3kp大小。
双酶切产物一般-20℃放置3个月以后连接效率就降低了，所以双酶切的量要酌情控制。
如果已经有双酶切好的PAbAi载体，则不需要再做1.1-1.3的内容，直接进行1.4的操1.4将PCR扩增成功的目的基因割胶回收后用试剂盒直接连到PAbAi载体上。
连接体系为：（37℃,30min, 也可以过夜）10ul体系双酶切的PAbAiExnase1ul1ul5×CE II Buffer2ul1图二、从左向右根据条带亮度插入片段扩增产物依次加4ul、6ul、2ul即可。
嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01 的构建、表达和鉴定
第1期2020年1月No.1January ，2020嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01的构建、表达和鉴定张莉，张小蒙（江苏医药职业学院药学院，江苏盐城224005）摘要：为构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体，试验根据质粒pBK760基因序列设计特异性引物，对质粒pBK760进行PCR 扩增，并将纯化后的PCR 产物连接到pMD20载体中，构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01，提取重组质粒载体进行鉴定，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入嗜水气单胞菌，获得具有标记抗性基因的嗜水气单胞菌。
结果显示，构建的嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPU01经PCR 和酶切鉴定正确，并且能在大肠杆菌中表达，表明质粒pBK760成功插入pMD20载体中，嗜水气单胞菌穿梭质粒pBKPU01构建成功。
关键词：嗜水气单胞菌；质粒pBK760；穿梭质粒载体；表达中图分类号：Q784文献标志码：A 江苏科技信息Jiangsu Science &Technology Information基金项目：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目；项目编号：201912682012Y 。
盐城市医学科技发展计划项目；项目编号：YK2016048。
作者简介：张莉（1996—），女，江苏盐城人，本科生；研究方向：微生物药学。
引言嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌［1］，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌［2］，嗜水气单胞菌的变异菌株较多，多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感，嗜水气单胞菌表现多种抗性［3］，其中一个主要原因是含有多种质粒［4］。
本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pBK760，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。
pMD20是一种高效克隆PCR 产物的专用载体［5］。
该载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I 和BamH I 位点之间增加了Spe I ，Nde I ，EcoR V3种酶切位点，经EcoR V 酶切后再在两侧的3’端添加“T ”制备而成［6］。
嗜酸乳杆菌对胃肠道酶的敏感性研究
嗜酸乳杆菌对胃肠道酶的敏感性研究
冯艳丽;张锐利
【期刊名称】《乳业科学与技术》
【年(卷),期】2005(027)001
【摘要】以MRS为培养基,模拟胃肠环境对嗜酸乳酸菌对pH、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆汁盐的敏感性进行了研究.结果表明:在pHl.60～5.00、温度37℃,胃蛋白酶0.592ug/mL～1.482μg/mL条件下,活菌数能达到108cfu/mL以上.在MRS培养基自然pH条件下,胰蛋白酶活力在14.24u/g～72.32u/g范围内,胆汁盐0.2%的情况下,活菌数能达到107cfu/mL以上.证明了嗜酸乳酸菌能顺利通过胃肠环境,促进人体健康.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】冯艳丽;张锐利
【作者单位】西南农业大学食品学院,重庆,400716;西南农业大学食品学院,重庆,400716
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.97
【相关文献】
1.猪胃肠道及土壤中分离和纯化产植酸酶、纤维素酶和淀粉酶微生物的研究 [J], 郭金玲;尹清强;郑秋红;董良奇;冯华;左瑞雨
2.产酶培养条件对一株嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶活力的影响 [J], 王月囡;曹健;张琳;
王红军;王育军;于海东
3.胃肠道恶性肿瘤中胸苷酸合成酶基因多态性与5-FU化疗敏感性的Meta分析[J], 唐健;庄燕妍;程文捷;黄凤婷;张世能
4.嗜酸乳杆菌表面疏水性对其亚油酸异构酶酶活的影响 [J], 丁锡龙;魏明;薛正莲;赵世光
5.嗜酸乳杆菌表面疏水性对其亚油酸异构酶酶活的影响 [J], 丁锡龙;魏明;薛正莲;赵世光;
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重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达
重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达王淼;周鹏;潘丽;张永光【摘要】[目的]构建FMDV乳酸杆菌穿梭表达载体.[方法]从A型FMDV中克隆出VP1基因后,根据乳酸杆菌密码子偏好性对VP1进行优化,与表达载体pSIP411进行连接,并将连接产物转化到DH5α中筛选出阳性克隆菌,重组质粒酶切和PCR鉴定成功后再转化到BL21中,采用杆菌肽进行诱导表达.[结果]表达产物经SDS-PAGE和Western blottmy检测在24 kD处有明显的条带,证明VPl-pSIP411重组表达载体构建成功并在BL21中成功表达.[结论]为后续乳酸杆菌表达VP1蛋白研究奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)021【总页数】4页(P25-27,70)【关键词】口蹄疫病毒;VP1;pSIP;乳酸菌;大肠杆菌【作者】王淼;周鹏;潘丽;张永光【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,甘肃兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,甘肃兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,甘肃兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,甘肃兰州730046【正文语种】中文【中图分类】S188ConstructionofRecombinantAFootandMouthDiseaseVirusVP1 LactobacillusShuttleExpressionVectorandExpressionin Escherichia coliBL21WANGMiao,ZHOU Peng,PANLi*, ZHANG Yong-guang * (StateKeyLaboratoryofVeterinary Etiological Biology,NationalFoot-and-Mouth DiseaseReference Laboratory,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou，Gansu 730046)KeywordsFMDV;VP1;pSIP; Lactobacillus plantarum; Escherichia coli口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，FMD)是一种高度传染性和经济破坏性的家畜疫病，能够引起家畜生产性能降低，患病仔畜高死亡率，对畜牧行业造成巨大损失。
人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和在乳酸乳球菌中的表达
人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和在乳酸乳球菌中的表达向华;卫文仲;谭华荣;郭顺星
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】2000(016)001
【摘要】采用RT-PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了0.45kb的人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/zn SOD)基因的cDNA序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,进行了序列测定和超高表达.将Cu/zn SOD cDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,用电穿孔法将重组质粒pMG36esod转化到乳酸乳球菌中,获得Cu/zn SOD的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的5%以上,活性染色表明该工程菌表达的Cu/zn SOD具有较好的酶活性.
【总页数】4页(P6-9)
【作者】向华;卫文仲;谭华荣;郭顺星
【作者单位】中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国医学科学院药用植物研究所,北京,100094
【正文语种】中文
【中图分类】Q933
【相关文献】
1.丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析 [J], 朱海生;刘建汀;陈敏氡;李永平;王彬;张前荣;叶新如;林珲;温庆放
2.突变的人铜,锌超氧化物歧化酶基因的克隆,测序及表达 [J], 施惠娟;孙建新
3.翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶基因的分子克隆与原核表达 [J], 程周玉;许亮清;胡向萍;胡宝庆;简少卿;阳刚;张明;文春根;宁瑞红
4.人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达 [J], 卫文仲;向华;谭华荣
5.人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆表达及活性鉴定 [J], 李雪莲;武峰;史兆兴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达刘明杰;陈建平;廖涛;芦殿香;陈宪【期刊名称】《生物医学工程学杂志》【年(卷),期】2006(23)3【摘要】本实验采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增得到军团菌毒力基因(L eg ionellav iru lence gene,lvg A gene),并将其定向连接入克隆载体pUC 18,构建重组质粒pU lvgA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,再将lvgA基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pG lvgA,转化宿主菌JM 109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印记分析鉴定。
实验结果表明,成功扩增出627 bp的lvgA基因,构建了重组质粒pU lvgA及原核表达重组质粒pG lvgA,并使53.7 KD a的G ST-lvgA融合蛋白质在原核系统中得到了有效的表达。
【总页数】4页(P605-608)【关键词】军团菌;lvgA基因;聚合酶链式反应;基因表达【作者】刘明杰;陈建平;廖涛;芦殿香;陈宪【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室形态学实验室【正文语种】中文【中图分类】R517.9;R394【相关文献】1.O139霍乱弧菌LPS基因和O抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达及O抗原基因结构的初步研究 [J], 曲殿波;刘传暄;马清钧2.PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究 [J], 刘明杰;陈建平;王涛;廖涛;陈宪;芦殿香;田玉3.大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化 [J], 李永海;徐燕;席慧;刘凤华;周霞;高音4.嗜肺军团菌热休克蛋白60基因在大肠杆菌中的表达 [J], 廖涛;陈建平;王涛;刘明杰;张建国5.从中国病人克隆丙型肝炎病毒基因组C区基因及其在大肠杆菌中的表达 [J], 杨永平;刘崇柏;夏宁邵;丛勉尔;汤权;曹经缓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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抗 动脉 粥样硬化 、 降低 胆 固醇 、 氧化 、 肥 、 进生 亚油 酸异构酶 。 目前 ， 抗 减 促 有些菌 种的亚油 酸异构酶 已被 长 、 和免疫 反应副作用等优点 。 缓
分 离纯化 。然而 ， 这些 菌种 有些 是厌 氧 的 ， 利于进 不
质粒 中， 经茵 落 Ｐ Ｒ、 Ｃ 酶切 分析 和 Ｄ Ａ测序 鉴定 克隆成功后 ， Ｎ 亚克隆入乳 酸菌表达质粒 ｐ ３ｅ 构 建 ＭＧ ６ ，
乳酸 菌表 达栽 体 ｐ ３ ｅ Ｌ Ｉ ＭＧ ６ — Ａ 并转化 到大肠杆 菌 Ｄ ５ Ｈｃ ￣中，经 菌落 Ｐ Ｒ和酶切 分析初 步证 明表达载 Ｃ
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｅｍｐ ｏ ｉ ｈ ｅ ｏｎ ｃ ＤＮＡ ｆＬ ｃｏ ａ ｉｌ ｓ ａ ｉ ｏ ｈ ｌ ｓ ｓｒ ｉ ｓｔ ｅ ｌ ｔ ｆ Ｐ ｓｒ ｃ ： ｌ ｙｎｇ ｔ ｅ ｇ ｎ ｒｉ ｏ ａ ｔｂ ｃｌｕ ｃ ｄ ｐ ｉｕ ｔａｎ ａ ｈｅ ｔｍｐ ａｅ ｏ ＣＲ， ｅ ｔ ｎ ｈ ｓ ｂ ｌ ｎ ｎ ｈ ｕ ｃ ｏ ｉ ｇ ｔ ｅ ＰＣＲ ｒ ｄ ｃ ｎ ｏ ｔ ｅ ｐ ｐ ｏ ｕ ｔｉ ｔ ｈ ＭＤ一１ Ｔ ｖ ｃｏ ．ｗｅ ｓ ｃ ｓ ｆ ｌｙ ｆｎ ｓ ｅ ｈ ｎ ｏ ｕ ｌ ａ ｅ ａ ａｙ ｉ ９ ｅ ｔｒ ｕ ｅ ｓｕ ｌ ｉｈ ｄ ｔ ｅ ｅ ｄ ｎ ｃ ｅ ｓ ｎ ｌｓｓ ｉ ａ ｄ ｔ ｅ ｃｏ ｉ ｇ ｐｒ ｃ ｄ ｒ ｆｅ ｅ ｕｅ ｃ ｎ ｈ ｏ ｉ ｇ ｒ ｇｏ ｎ ｈ ｌ ｎ ｎ ｏ ｅ ｕ ｅ ａ ｒ ｓ ｑ ｎ ｉ ｇ ｔ ｅ ｃ ｄ ｎ ｅ ｉｎ．Ｆ ｒｈ ｒ ｒ ， ｕ ｈ ｂ ｖ ｔ ｕ ｔ ｅ ｍｏ ｅ ｗｅ ｃ ｔｔ ｅ ａ ｏ ｅ ＰＣＲ ｒ ｄ ｐｏ— ｕｃ ｎ ｔａ ｄ ｐＭＧ３ ｅ ｗｉ ｈｅ ｓ ｍｅ ｒ ｓｒｃｉ ｎ ｅ ｚ ｍｅ ６ ｔ ｔ ａ ｅ ｔｉ ｔ ｎ ｙ ，ｗｉｈ ｔｅ ｐ ｐ ｓ ｆｇ ｔｉ ｇ ｔ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｔａｎ ｏ ｈ ｏ ｔ ｈ ｕｒ ｏ ｅ ｏ ｅｔｎ ｈｅ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ ｓｒ ｉ ｆ Ｌａ ｔｂａ ｉｌ ｃｏ ｃ ｌ ＭＧ ３ ｕｓ １ ６３ ｐＭＧ３ —Ｌ ．Ｔ ｏ ｓｒ ｃ ｉｎ ｏ ｈ ｓｎ ｗ ｅ ｏ ６ｅ ＡＩ ｈｅ ｃ ｎ ｔｕ ｔｏ ｆｔ ｉ ｅ ｒ ｃ ｍｂｉ ｎ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃ ｏ ｌ ａ ｎａ ｔｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔｒｗｉ ｌｙ ｌ ｔ ｅ ｂ ｓ ｆｔ ｅ ｓｕｄ ｎ ｏ ｔ ｉｉ ａ ｇ ｎ ｉ ｈ ａ ｔｖ ｉ ｏ ｅ ｃ ａ ｉ ｓ ｍｅ ａ ｅ ａ ｄ ｄ ｖ ｌｐ ｎ ｈｅ ｎ ｗ ｈ ａ ｅ ｏ ｈ ｔ ｙ ｏ ｂ ａｎ ｎｇ ｌｒ ｅ ａ ｄ ｈ ｇ ｃ ｉｅ ｌｎ ｌｎｉ ｃ ｄ ｉｏ ｒ ｓ ｎ ｅ ｅｏ ｉ ｇ ｔ ｅ ｍｉｒ ｂ ａ ｃ ｌｇ ｃ ｌａ ｅ ｔ ｃ ｏ ｉ ｌｅ ｏ ｏ ｉａ ｇ ｎ ． Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ：ｉｏ ｅ ｉ ｃ ｄ ｉｏ ｒ ｓ ｇ ｎ ｌ ｎｎ Ｌ ｃｏ ａ ｉ ｕ ｅｄ ｐ ｉｕ ｌｎ ｌｎ ｅ ａ ｉ ｓ ｍｅ ａ ｅ；ｅ ｅ ｃｏ ｉｇ； ａ ｔ ｈ ｃｌ ｓａ ｉ ｏ ｈ ｌ ｓ ｌ
共 轭亚 油酸（ｏｊｇｔ ｎｌ ｃａｉ， Ｌ ） 亚油 并 且反应 产物 均为 活性共 轭亚 油酸 异构 体 。亚油 酸 ｃｎｕａｅ ｌ ｏｅ ｃ Ｃ Ａ 是 ｄｉ ｉ ｄ
酸（ｎｌｉ ａ ｉ，Ａ衍 生 的共轭 双烯 酸 的多 种位 置 与 异 构酶 最早 发现 于溶 纤维 丁酸弧 菌 （ ｕｙｉ ｂｉ ｆ — １ｏ ｃ ｃ Ｌ ） ｉ ｅ ｄ Ｂ ｔ ｖ ｒ ｂ ｒｉ ｏｉ 几何异 构体的总称 。其中 ｃｓ９ ｔ ｎ一 和 ｔ ｎ一 ０ ｒ ｏ ｅ ｓ中 ， ｉ 、 ａｓ １ 一 ｒ ｔ ｒ ｓ １、 ａ ｉ ｌ ｎ ） 之后 ， ｓｖ 又发现痤 疮丙酸杆 菌 （ｒｐｏｉａ— Ｐｏｉ ｂ ｃ ｎ ｃｓ１ 两种异构体被证实具有很强 的生理活性 ，具有 ｔ ｉｍ ａｎｓ 、 杆 菌 （ ｏｎｂ ｃ ｒ ｍ ｓｐ 等 能产 生 ｉ 一１ ｅ ｕ ｃ ｅ） 棒 ｒ Ｃ ｒｅａｔ ｉ ｓ ） ｅｕ
Ｔｈｅ ｃｏｎ ｎｇ ｏ ｌ ｉ ｆＬＡＩｇ ｎ ｎ ｈ ｏ ｔ ｕｃｉ ｎ ｆｐ Ｇ３ ｅ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｖ ｃ ｏ ｅ ｅ ａ ｄ ｔ ｅ ｃ ｎｓｒ ｔｏ ｏ Ｍ ６ ｘ ｅ ｓｏ ｅ ｔ ｒ
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体 ｐ Ｇ ６ — Ａ 构建成功 。该研 究为利 用工程 菌工业化生产 高产量 、 Ｍ ３ｅＬ Ｉ 高活性亚油酸异构 酶制剂来 生产 Ｃ Ａ奠定基础。 Ｌ
关键词 ： 油酸异 构酶 ； 因克隆 ； 亚 基 嗜酸 乳杆 菌
中 图分 类 号 ：８ ６３ ￥ １＿ 文献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ １ ９ １ （ ００ ２ — ０ ８ ０ １０ — ９ Ｘ ２ １ ）０ ０ ５ — ４
工 程
《 饲料工业》 ２ １ ・０ ０芷第 ３ １眷第 ２ Ｏ期
嗜 酸乳 杆 菌 的 亚 油 酸 异 构酶基 因 克 隆 及 其 ｐ ３ｅ 达载 体 的构 建 ＭＧ ６ 表
郎建华 摘 赵 国芬 李 志刚 郑 婷 包秋 华
要： 以嗜酸乳杆 菌基 因组为模板 ， 对亚 油酸异构 酶基 因进 行 Ｐ Ｒ，Ｃ Ｃ Ｐ Ｒ产物 克隆到 ｐ Ｄ １Ｔ Ｍ 一 ９