小麦转基因技术的研究现状
探析转基因技术在应用中优势与不足
探析转基因技术在应用中优势与不足作者：谢晟堃来源：《食品界》2017年第10期转基因技术的优势就农业而言，植物性转基因食品很多。
例如.小麦品种一般蛋白质含量较低，而生产面包需要高蛋白质含量的小麦；如果将小麦中转入高效表达的蛋白基因，这种小麦生产面包具有更好的焙烤性能。
又如：番茄在果蔬中营养丰富、经济价值很高，但它不耐储藏。
研究发现，导致植物衰老的重要基因，是控制植物衰老激素乙烯合成的酶基因，抑制这个基因的表达，使一种蛋白质变为容易为另一物质所抑制就能控制衰老激素乙烯的生物合成.番茄就不容易变软并且易于保存。
目前美国、中同等国已培育出了这样的番茄新品种。
这种番茄新品种抗软化，抗衰老，耐储藏，可减少番茄在加工生产及运输中的巨大浪费。
就医疗而言，在医学中的应用，它具有专业术语——基因治疗，是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。
也包括转基因等方面的技术应用。
也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。
从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。
人类所患疾病中，有许多是由基因控制的遗传病，在基因治疗中，可以利用基因沉默技术，通过各种不同的方法使致病基因发生沉默，从而达到治疗疾病的目的。
癌症是由于基因变而引起的，基因沉默可能是治疗癌症的一种有效方案。
例如在抗肿瘤治疗中，基因沉默可用于抑制癌基因的表达、敲除点突变激活的癌基因；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达、抑制其他与肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子基因VE、GF或多药耐药基因MDR）的表达。
另外，由许多病毒引起的疾病，如各种类型的肝炎、艾滋病等都严重威胁着人类的生命和健康，可以设计针对病毒基因组RNA的小干扰RNA或针对宿主细胞病毒受体的小干扰RNA来抗病毒.抑制这些病毒基因的表达，使病毒基因的复制、转录、病毒粒子的包装等环节被打断，以达到基因沉默的目的。
小麦转录因子基因TaNAC67参与调控穗长和每穗小穗数
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2019, 45(11): 1615 1627/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.91009小麦转录因子基因TaNAC67参与调控穗长和每穗小穗数张宏娟1,2李玉莹2,3苗丽丽2王景一2李超男2杨德龙1,*毛新国1,2,*景蕊莲21甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃兰州 730070; 2中国农业科学院作物科学研究所/ 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/ 农业部农作物种质资源创新与利用重点开放实验室, 北京 100081; 3河南农业大学农学院, 河南郑州 450002摘要: NAC转录因子是植物特有的一类转录因子, 在植物生长发育和逆境胁迫应答反应中发挥着重要作用。
前期研究表明, TaNAC67参与对多种逆境胁迫的应答, 过量表达能增强拟南芥的抗逆性。
为进一步揭示其在调控小麦主要农艺性状发育方面的作用, 本研究以36份普通小麦组成的高多态性群体为材料, 测序分析了TaNAC67-6A、TaNAC67-6B、TaNAC67-6D序列多态性, 发现TaNAC67-6A启动子区–1516 nt有1个A/G转换SNP, 在–873~ –748 nt处有1个126 bp的InDel; TaNAC67-6B启动子区–2014和–1916 nt处各有1个C/T转换SNP; TaNAC67-6D启动子区–1795 nt有1个T/G颠换SNP, 编码区357 nt处有1个C/T转换SNP。
根据多态性分别开发了功能分子标记, 扫描由282份普通小麦构成的自然群体, 并将基因型和表型性状检测结果进行关联分析, TaNAC67-6A、TaNAC67-6B的标记与表型性状无显著关联, 而TaNAC67-6D的2个标记SNP-D-1和SNP-D-2分别与小麦穗长和每穗小穗数显著相关。
84K杨UPB1-Like基因的克隆及遗传转化开题报告
84K杨UPB1-Like基因的克隆及遗传转化开题报告一、选题背景90年代中期，随着生物技术的快速发展，“转基因”技术在农业领域开始得到广泛应用。
定向基因转化技术是一种针对性转化基因，使植物具有特定的改良性状的方法。
由此，科学家们开始着手研究及利用转基因技术来研发新型农作物品种。
与传统育种方法相比，转化技术可在较短时间内获得目标基因，并且其选择性强、效率高，从而在获得重大突破方面具有显著优势。
在小麦生产中，劣质品质是影响小麦增产、提质、保质的主要因素之一。
因此，基础研究与可行技术的开发对于解决小麦品质问题具有十分重要的意义。
近年来，杨氏 UPB1-Like基因在小麦品质研究中受到广泛关注，该基因与小麦品质的相关性很高。
因此，将其克隆及遗传转化研究将为小麦关键性状调控及小麦特异改进育种提供科学依据和技术路径。
二、研究的目的及意义该研究旨在将杨氏 UPB1-Like基因进行克隆，并利用遗传转化技术将其导入到小麦中，通过对转化后小麦的品质特性的分析，探讨杨氏UPB1-Like基因在小麦中的功能和转化后小麦的品质表现。
研究结果将为小麦优化育种方案及提高小麦品质和产量提供科学参考。
三、研究内容1、杨氏UPB1-Like基因的克隆和序列分析选用已得到的杨UPB基因序列，使用PCR技术扩增出完整的杨UPB 基因，并进行测序和分析。
通过生物信息学手段，对克隆出的基因序列进行分析和比对，确定序列准确性和开放阅读框情况。
2、构建杨氏UPB1-Like基因转化载体利用PCR和限制性内切酶切割技术构建杨UPB基因表达载体。
将完整的杨UPB基因与植物表达载体结合，并使用限制性内切酶处理过的目的pBI121载体进行连接，然后转化大肠杆菌进行扩增纯化。
3、大肠杆菌和农杆菌介导下将杨UPB基因导入小麦采用大肠杆菌和农杆菌介导的方法将杨UPB基因导入小麦。
筛选杨UPB基因阳性转化的小麦植株，经过PCR检测验证。
4、小麦相关性状测定对转化后获得的小麦突变体进行品质测定，包括小麦品质形态性状、理化性质、营养特性等方面进行全面的分析和测定，比较分析转化后的小麦与正常小麦的品质特异性。
转基因技术的应用
转基因技术的应用转基因技术是一项重要的科技成果，其应用领域广泛，不仅能够提高粮食产量，也可以开发出具有降低疾病的潜力的新药，还可以改善农作物、家畜和鱼类的品质等。
在现代生物学和农业科学领域，应用转基因技术已成为不可忽视的发展趋势。
一、转基因技术的原理转基因技术是指将一些具有特殊功能的基因转移到另外一些有用的生物体内，从而产生新的物质或改造原有的生物体。
转基因技术的原理就是利用基因重组技术，将生物体内的基因进行剪切和重组，将外源基因有针对性地插入到目标生物体细胞的基因组中，从而改变生物体的基因型和表型。
此后，目标生物体就能够获得新的、通常为人类有用的性状，比如更高的产量、抗病性、品质改良、产生新药品等。
二、转基因技术在农业领域的应用（一）转基因作物在农业领域，转基因技术可以开发出更加耐旱、耐寒、抗病虫害、提高营养价值、改善口感、增加产量等方面具有优异性的转基因作物。
例如，通过转基因技术使水稻获得了抗病性、抗旱性、耐盐性、抗虫性等优良性状，可以提高水稻的品质、减少污染，因此被应用于水稻等主要农作物的研究中。
同样的，转基因技术还广泛应用于小麦、玉米等农作物的培育和改良中，从而提高作物的产量和品质。
（二）转基因家畜转基因技术还可以应用于家畜的养殖。
例如，通过将分泌生长激素的基因插入到猪的染色体中，可以促进猪的生长和肉品产量。
另外，还可以利用转基因技术来防治猪葡萄球菌、母性疫等重要家畜疾病。
因此，通过利用转基因技术，家畜养殖业也可以获得高产、高效、高质、低成本等诸多优点。
（三）转基因鱼类转基因技术还可以利用水产资源的优势，研发出增长快、抵抗力强、经济价值高的新品种。
例如，采用转基因技术培育的金鳟鱼，在水族馆中备受欢迎，由于其可以耐受不同的环境条件和对药物的敏感性较低，业已成为生物技术应用于各类水生动物的重要突破。
三、转基因技术带来的争议虽然转基因技术具有许多优异性的应用，但是它也为人们带来了一定的争议。
首先，由于转基因作物的新型性状可能会将传统的作物基因资源有所丢失，因此，一些人士担心这可能会导致农作物的基因多样性减少，失去抗病能力，威胁食品安全。
转基因技术的应用
转基因技术的应用(共8页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--转基因技术的应用摘要：转基因技术作为一门强有力的研究手段，在农业、医学、动植物优良种类的培养、生命科学研究等方面都具有广泛应用。
在医学方面，可以用来为治疗遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病等提供出路；在植物培育方面，可以用来改良植物的遗传性质，使具有以前所不具有的优良特性，如高产量、抗虫害、抗逆性等方面；转基因动物的出现可以使人类获得性状更好的动物，并且可以通过转基因动物生产出目的产物，如血红蛋白、乳铁蛋白等；在工业上，转基因技术也能为能源问题出谋献策。
在最后，介绍转基因作物及食品在备受争议的现今，其发展状况如何。
关键词：转基因技术，遗传改良，基因治疗转基因简介转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。
1 转基因技术在医学上的应用转基因技术在开发新药物、开发新原料和为研究疾病提供新手段等方面具有重要的意义，为防治危害人类的各种疾病如传染病、内分泌疾病、恶性肿瘤和心血管疾病等开辟了新的天地。
人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）于1990 年正式启动，其目的是阐明人类基因组DNA 长达3 X109 碱基对的序列，发现所有的人类基因并阐明它们在染色体上的位置，从而揭示出人类遗传信息。
人类基因组计划提出的原因一部分就是为了解决包括肿瘤在内的人类疾病的分子遗传学问题，因为人类基因组测序的完成将有利于这些疾病的定位、克隆和鉴定，从而为这些疾病的基因诊断和未来的基因治疗奠定了基础。
1 .1 基因治疗的原理基因治疗是指将正常的外源基因导入生物体内以弥补所缺失的基因、关闭或降低异常表达的基因，以达到治疗遗传性疾病的目的。
目前基因治疗的方法在治疗恶性肿瘤、心血管疾病及传染病有重要应用。
转基因农产品检测前沿技术解析及运用
知区域 。本检测方法根据 旁侧 序列设计定量 引物并使用 Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ 技术水平低 ，达不到需求水平 的情况 。 Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ 定量 Ｐ Ｃ Ｒ技术进行定性检测和转基 因小麦 ｐ Ａ ＨＣ ２ ５载体 ３转基因农产 品检测 的技术和运用 ｂ ｒ 基 因 的拷 贝数检测 ； ａ 对作 为 内参 照基 因的小麦蜡质 基 因和 ３ ． １利用 电化学免 疫生物传 感器技 术实现对 Ｃ ｒ ｙ ｌ Ａｂ蛋 白的定 作为 内参 照基 因标 准的非转基 因小麦基 因组 Ｄ Ｎ Ａ进行梯度 稀
农 业 与技 术
第３ ３卷
第１ ０期
２ ０ １ ３年 １ ０月
转基 因农产 品检测前沿技术解 析及运 用
赵 海 涛
（ 唐 山市农业环境保护站 ，河北 唐 山 ０ ６ ３ ０ ０ ０ ）
摘 要 ：２ ｏ １ ３ 年 ６月，欧盟根据 Ｂ Ｔ ６ ３ 的பைடு நூலகம்图谱比对 ，确定 中国输欧米制品 中 含 有非法转基因成分。２ ０ ０ ６ 年 以来 ，欧盟预警 系统总计通 报 了中国输 欧食 品含 非法转基 因成分近 ２ ０ ０次。转基 因食 品的严 格控制 以及转基 因技 术的提速发展 ，使得 转基 因农产品的检 测技 术
量 检 测
释 ，来得 到 内参 照基 因 Ｃ ｔ 值 与拷贝数对 数值 的相关 性标准 曲 Ｃ ｒ ｙ ｌ Ａ ｂ蛋 白是转基 因作物 的常见 蛋 白。电化学法是 使用 线方程 。在转基 因小麦 Ｂ ７ ３ — ６ — １中，ｂ ｒ 基 因拷 贝数是 １ ａ １ 。在
碳纳米管 电极 、采用安培法持续 、动态检测免疫传感器 中标记 此项检测方法 的运用方面 ，它的优势是 以典型的转基因作物证 抗 体 的碱 性磷酸 酶 （ Ａ Ｐ）的方法 。新型 的离子液 体做粘 合剂 明该 方法 检测 Ｂ ７ ３ — ６ — １ 具有 高特异 性 ，检测 灵敏 度高 、准确 的碳 纳米管电极 不但 成本 低 、制备 易 ，更重要 的是抗钝化性 能 有效 。 好 、电极表 面易更新 。总之 ，电化 学法 比较光学法 的优势是 电 化学方法更加灵敏 ，表现在电化学法检测最终产物时 ，峰电流 参考文献
科学家用转基因技术育出一种小麦和大麦
亿到 ３ ０亿 人 受 到膳食 矿 物 质缺 乏 的影 响 ． 受影 响 人群 主 要分 布在 发
展 中 困 家 、 在 小 麦 巾 ． 醇 六 磷 酸 酶 在 ６ 肌 ３
菜 含 油量 的最 高 纪 录 高 近 ２个
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香 港 浸 会 大 学 环 境 科 学 研 究 摄 氏 度 的 时 候 失 去 活 性 由 丹 麦 农
所 的 ＿ 名 研 究 人 员 成 功 研 制 ｍ 业 科 学 研 究 所 的 Ｈ ｎｉＢ ｉｃ 二 ｅ ｒ ｒ ｈ— ｋ ｎ
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据 ｒ解 ． 『 油一 ３ １ “ｌ １ ０ ６ ”油 菜 新 组 根 据 可 再 生 能 源 市场 需 求 ． 以 “ 蓄能值 ” 高 为Βιβλιοθήκη 种 日标 ． ｆ 合 利Ｊ 聚 Ｊ
ｅ ｅｓｎ的研究组 还证 明 了 ．即便 推广 的普 通 油 菜 品种 提 高 了 ２ ％ 延 长有益 菌群 土 壤 巾 的存 活 时 Ｐ ｄｒｅ ５
同时 又有 助 于加 强 农作 物 的光 烹 煮 转 基 因小 麦 种 子 ２ ０分 钟 ． 它 以 上 ． 油 量 可 达 ９ ｋ／ ．该 品 系 问 ： 产 ８ ｇ亩 ．
且 还有 ３亿 亩 冬 闲 ｍ可 利用 ． 若全
部开 发 Ｉ来 ． 叶 ５ 可年 产 ４ ０ ０ ０万 ｔ 物 牛 柴 油 ．棚 当于建 造 １ ． 永 枯竭 ５个
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科学家用转基 因技术 育 出 一 种 小 麦和 大 麦
科 学 家 用 转 基 因技 术 培 育 出
１ 提高 抗逆 力 产 品不 仅 有 们 仍 然 含有 足 够 的肌醇 六磷 酸 酶 ． ｛ 若 拿 到青海 等 高海拔 地 区种植 ． 含 合 作 ｆ ． 油量 至少还 可 提高 ２ ３个 百分 点 ． 效 减 轻 ｒ传统 化 肥 对土 壤 的 破坏 ． 可 以让 食 用 这 种 小 麦 的人 们 吸收 ～
转基因育种技术发展研究综述
作者简介 ： 章（９５ ， ， 士， 杜世 １６ 一）男 博 副教授 ， 主要研究方 向： 分子生物学。
第 ８期
杜世 章 ： 转基 因育种技 术 发展研 究综 述
・ ９・ ５
延熟保鲜转基 因番茄“ ｌ ｒ ａｒ在美国获准进入市场ｌ 。１９ 年 ， Ｆ ｖ ｓｖ” ａ ２ ９６ 转基因作物进入 了商品化生产阶段 。 ］ ］ 美国最早开始商业化生产和销售转基 因作物 （ 包括大豆 、 玉米、 油菜、 土豆和西红柿 ） 之后 ， 。 许多国家也 都开始对转基因作物展开研究 ， 并进行商业化种植 。目前 ， 转基因技术在农业领域取得 了一系列突破性进 展， 世界各 国已相继发布了百余项利用转基因技术改造农产 品的研究成果 ， 成功研制出转基因植株 的植物 超过 了 ３ 个科的 １０ ５ ２ 多个种 ， 主要集 中在七大类农作物上 ， 大豆 、 即： 玉米 、 棉花 、 油菜、 马铃薯、 南瓜、 西葫 芦和木瓜 。其 中， 涌现出大量具有实际使用价值 的转基 因植株 ， 如抗除草剂 、 抗虫 、 抗病、 抗病毒 、 改善 品 质、 改变蛋 白质组分 、 雄性不育、 改变花形花色 、 延长保鲜期等基因的转移 Ｊ 。
２ 转基 因育种的 当前发展趋 势
转基 因作物的研究最早始于 ２ ０世纪 ８ ０年代初期。１８ ９３年 ， 全球第一例转基 因烟草在美 国问世 。 １８ 年在全世界范围内共有 ５ ９６ 例转基因植物首次获准进入田间试验 １９ 年 ， ９４ 第一个转基因植物产品——
收稿 日期 ：０ １ ・ ２ １ ５１ ６
的作用 ， 并仍然在广泛使用。但是 ， 传统育种方法 和手段也面临着一些 问题 ： １ 不 同的生物种 、 之间存 （） 属 在着的生殖 隔离 ， 育种家很难甚至不可能将人类所需 的优 良基因从远缘物种 中通过常规的方式转移到栽
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1.小麦转基因技术的发展方向答：利用现代基因工程技术进行小麦的品种改良是当前小麦育种的一个新方向。
其主要手段是利用生物及物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基因植物的植物转基因技术.对于小麦的遗传转化已发展的方法主要有PEG 法、电激法、离子束介导法、花粉管通道法、基因枪法及农杆菌介导法等，转化的基因也从最初的报告基因扩展到抗病虫害基因、抗逆基因、抗除草剂基因和品质相关基因等。
作物转基因育种和常规育种相比具有明显的发展优势，因为它不仅极大地拓宽了育种的基因来源（如动物、植物、微生物和人工合成），而且可以实现高效精确的遗传改良，更为重要的是抗病虫等转基因育种的发展将有效减轻农田的环境污染。
未来几年，小麦转基因技术的发展方向可归纳为以下四点：(1)小麦转基因技术的发展还不够成熟。
目前，国内仍以花粉通道法为主进行小麦转基因研究，但是由于花粉管通道法的遗传转化的效率还较低，而且外源基因整合的随机性很强等明显的缺点还是限制了其发展速度。
基因枪法的不足是成本昂贵、转化率因受体材料基因型不同变化较大、外源基因拷贝数高，而且转基因时插入片段的确定性较差。
农杆菌介导法也因为受基因型的影响很大，所以在小麦转化中效率较低，转基因的方法还不够成熟。
在组织培养方面，小麦胚性愈伤组织的获得还比较困难，实验的成功与否在很大程度上依赖于研究者的经验这也是限制小麦转基因发展的重要因素。
总的来看，农杆菌介导法小麦转基因研究已经取得一些初步进展，而且其发展速度很快，未来几年内关于农杆菌介导法小麦转基因的研究将会迅速增加。
不过，以花粉管通道法和粒子束介导法为主的DNA直接转化技术在近几年内将仍占主导地位。
(2)小麦转基因育种的功能基因还非常有限，可用于小麦转基因育种的功能基因，特别是控制小麦重要性状的功能基因还非常有限，这是限制小麦转基因育种发展的主要因素。
比如抗虫转基因育种中，目前可以利用的主要是Bt 基因、蛋白酶抑制剂基因和外源凝集素基因等非常有限的几种；改善品质的基因目前仍主要局限于高分子量谷蛋白亚基基因等有限的范围内等。
所以，未来关于小麦功能基因的深入研究和开发将仍是研究的重点，特别是那些与高产、优质、抗逆性、株型、高光效密切相关的基因将是研究的热点。
(3)转基因小麦的生物安全性仍是研究重点。
转基因小麦的生物安全性可分为生态安全性和食品安全性两类：生态安全性主要表现在转基因的飘移方面，食品安全性主要集中在标记基因的水平转移和表达产物是否会对食用这产生副作用方面。
所以，关于如何最大限度地消除转基因小麦可能带来的生物安全性风险将是很长一段时间转基因小麦研究的重要方向。
目前，国内外已经开展了一系列的相关研究，已设计了一系列安全性转基因育种的分子策略。
需要特别指出的是，转基因小麦和其它转基因作物一道必将得到快速的发展，而且会向着精确性、高效性和多样性的方向转变，小麦转基因育种将和常规育种有效结合，为人类提供更加安全优质的小麦产品。
(4)转基因育种是分子育种的主要途径之一。
我国“十一五”科技规划把分子育种作为重点领域，确定为育种理论与育种技术创新发展的方向。
因此，加强主要农作物重要性状功能基因研究，获得具有知识产权的功能基因是实现分子育种自主创新的关键，也是转基因育种的重要基础。
小麦作物我国第二大作物，在国家粮食安全中占据举足轻重的地位，也是遗传背景比较复杂的多倍体作物，外源基因功能表达难度更大，分子育种的技术要求更高，应从理论与技术方面进一步加强研究，才能实现理论与技术的突破。
2.如何突破小麦转基因技术的瓶颈？答：目前小麦转基因技术遇到了瓶颈，因此，小麦新品种的培育依然主要靠常规育种。
由于常规杂交育种周期长、手段单一、种间杂交困难，而且效率较低、预见性差，致使杂交后代遗传背景狭窄、选育难度增大，使小麦育种水平难有突破性提高，育种进展缓慢，但近几年也逐步取得了一些可喜进展。
引起小麦转基因技术研究滞后的因素很多,其中,小麦的组织培养技术不过关可能是其难以取得突破性进展的核心和关键所在。
(1)除花粉管通道法以外,小麦上应用的其它转化方法都需要经过组织培养过程。
而小麦愈伤组织的分化能力在很大程度上是受基因型影响的,这使小麦转化材料的选用受到了很大限制,造成目前转基因材料都集中在少数几个基因型,而这些基因型在生产上已被淘汰或应用很有限。
育种上要利用这些外源目的基因,目前还只能采用传统的常规育种方法如回交、杂交等方法将其转育到生产上推广的优良品种中,造成了人力、物力的浪费。
(2)农杆菌转化法相对于其它转化方法来说具有转化频率和再生植株的可育率高、可转移较大片段的外源DNA及导入的外源基因拷贝数较低等优点,已成为目前大多数植物基因转化的首选方法。
正是由于农杆菌转化方法的出现,植物基因转化的研究才得到了迅速地发展。
在小麦上,虽也有成功的报道,但因农杆菌转化对组织培养技术依赖性强,目前获得的小麦转基因植株多是利用对组织培养技术要求不严的基因枪法,而基因枪法转化植物又有如前所述的诸多缺点。
(3)现今小麦转化基本上以幼胚、幼穗及其愈伤组织作为转化受体,取材受生长周期限制很大。
成熟胚容易大量获得,但因其诱导的愈伤组织质量差、再生率低,在目前的小麦组织培养技术条件下还无法普遍用作转基因的受体,这可能也是造成小麦转基因技术滞后的一个因素。
除组织培养技术不过关这个主要限制性因素外,其它如对基因枪法、花粉管通道法等转化条件缺乏系统研究,以致转化效率低,在过小的转化群体中难以选择到性状优良的目标植株;小麦为六倍体,基因组较大,容易引起外源基因的丢失和沉默;缺乏理想的表达载体和筛选标记基因以及小麦生长周期较长等也是导致小麦转基因技术研究落后的因素所在。
3.请你思考日本烟草公司发明的pure wheat转基因技术，其核心技术可能是什么？答：我认为日本烟草公司发明的pure wheat转基因核心技术和花粉管通道法介导基因转化应该差不多。
其原理是：植物在双受精完成后,受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。
此时期的细胞尚不具备完整的细胞壁和核膜系统,细胞内外的物质交流频繁。
通过花粉管通道渗透进入胚囊的外源DNA片段有可能进入受精卵细胞,并进一步通过尚不明确的机制被整合进受体植物基因组中。
其操作程序大致如下：基本程序包括:①外源DNA(基因)的制备;②根据受体植物受精过程及时间,确定导入外源DNA的时间及方法;③将外源DNA导入受体植物;④转基因植株目标性状的鉴定及分子检测。
利用花粉管通道法导入外源基因通常有以下几种方法。
(一)花粉粒与外源DNA混合授粉法(1)将制备好的目的DNA溶于0.3mol/L蔗糖,20mmol/L硼酸钠溶液中,终浓度为40μg/mL。
(2)选择发育正常的花,预先去雄套袋隔离。
(3)采集发育正常的花粉(防止干燥失水)。
(4)打开隔离袋,将DNA溶液滴(涂)在柱头上,然后立即将采集到的花粉撒落在该柱头上(不要涂抹以免擦掉DNA溶液)。
或者取200μLDNA溶液与适量新鲜花粉迅速混合成糊状,立即涂于柱头上。
(5)迅速套袋隔离至种子成熟。
(二)花粉粒培养法(1)将目的DNA溶于1×SSC溶液中,DNA浓度约为40～50μg/mL。
(2)选择发育正常的花去雄,套袋隔离。
(3)在无菌培养皿中加入一薄层花粉萌发培养基,将采集到的新鲜花粉放入其中,30℃下培养3min左右。
每10mL培养基中加入30mm3花粉粒。
(4)在显微镜下观察,当约1/10花粉已萌发时,加入1/10体积的外源DNA溶液,小心混匀。
与花粉混合后DNA的终浓度为5μg/mL。
(5)将DNA与花粉的混合液涂于柱头上。
(6)授粉后重新套袋隔离至种子成熟。
注:此法是在花粉管开始萌发时加入供体DNA,混合后进行授粉,通过萌发的花粉管将外源DNA导入卵细胞。
另一种方法是将花粉粒接种在含DNA的培养基中培养,开始萌发时取出授粉。
(三)柱头滴注法此法将供体DNA溶液直接滴于授粉后0.5～2h的花柱上或先将授粉后柱头切除,在切除处花粉管孔上滴加供体DNA溶液。
其他操作同上。
(四)花粉粒转化法花粉粒转化法又称花粉携带法,即采集未萌发的新鲜花粉与农杆菌共培养或用DNA直接导入法(基因枪法、电激法、超声波法等)操作,使外源DNA导入花粉粒细胞内,然后授粉。
其他操作同上。
(五)微注射法就以棉花为例介绍操作步骤。
(1)选择次日将开放的花蕾进行自交。
在开花前一天,可见花冠快速伸长,淡黄色或乳白色的花冠呈指状突出于花萼,次日即开放成花朵。
选择这样的花蕾,在指状花冠的前端用细线扎紧,并将细线的另一端系于铃柄,作为收获时的标记。
(2)在开花后20～24h左右,即开花次日,选择果枝和花位较好的幼子房作为转化对象。
一般选择每个果枝的第一和第二果节位的花朵作为转基因操作的对象,这些果节上的棉铃一般成铃率较高,有利于收获较多的种子。
(3)用50μL微量进样器作为注射的工具。
每次使用前后,都用无菌水冲洗干净。
(4)注射时,摘除或剥去花瓣,抹平花柱。
在剥除花瓣时,不应损伤幼嫩子房的表皮层,以防止花铃脱落。
(5)右手持微量注射器,左手轻扶摘除花瓣后的幼子房,从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长度约2/3处,并后退至约1/3处。
(6)轻缓操作注射器,将DNA溶液推入受精子房中。
使用供体总DNA时,供体DNA浓度为0.1～0.2μg/μL,每朵花注入1～2μg/μL左右;使用质粒DNA时,浓度为0.01～0.02μg/μL,每朵花注入0.1～0.2μg左右(10μL)。
(7)在铃柄基部涂抹40ppm的赤霉素溶液,以减少幼铃脱落。
(8)挂牌标记已转基因的棉花幼铃,并在牌上注明编号、基因供体和时间。
(9)摘除该花在果枝的顶心,促使营养集中到幼铃中,增加成铃率。
(10)收获时,将转基因的棉铃单独采收、轧花,种子单独存放,以利进一步鉴定。