生化实验考试知识点

生物化学实验复习资料（蓝林）

生物化学是研究生命的化学。是研究组成生物体物质的结构及其功能、代谢及其中的能量代谢、信号物质的信号传导、生命遗传物质的遗传及变异和表达调控、以及疾病发生和治疗相关的生物化学问题等的科学。

玻璃仪器的洗涤

一般玻璃仪器用肥皂或去污粉以毛刷洗涤即足以满足要求，洗后应将肥皂或去污粉仔细冲掉，将水倾去后，器壁不挂水珠，视为合格。铬酸洗液仅用于毛刷不能洗净的仪器，切勿滥用普通玻璃仪器之洗涤。使用铬酸洗液时，仪器应干燥；过多的水份将使洗液迅速失效。用过之铬酸洗液须加以保存以反复使用，直至变为绿色后方可舍弃；其舍弃法与浓硫酸液相同。用洗液浸洗过的玻璃仪器，应先用自来水冲洗，然后再用蒸馏水或去离子水清洗，清洗时，宜采用“少量多次”原则以节约蒸馏水，同时清洗的效率也高。

温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶的影响

实验原理大多数酶的化学本质是蛋白质、凡能引起蛋白质变质的因素，都可以使酶丧失活性、温度、pH、抑制剂、激活剂、对酶活性有显著的影响。

淀粉各种糊精麦芽糖葡萄糖

加加加

碘碘碘

变蓝蓝、紫、褐、红不变色

氨基酸、蛋白质的性质鉴定

实验原理氨基酸与蛋白质分子组成中的某些特殊结构与某些试剂作用可以表现出特殊的颜色反应，利用此性质，可检验出氨基酸及蛋白质。

肝糖原的提取与鉴定

实验原理糖原是一高分子化合物。微溶于水，无还原性。

肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一，是体内糖的重要来源之一，

原理2 肝糖原理的糖在体内的重要储存形式之一，是体内糖的重要来源之一，糖原是一高分子化合物。微溶于水，无还原性、与碘作用生成红色。

本实验通过对动物肝脏研磨，在三氯醋酸作用下一使其中的蛋白质被沉淀，二使糖原水解酶失活，从而过滤得到糖原。

实验步骤

称肝脏约1g+10%三氯醋酸1ml 研磨+5%三氯醋酸2ml 研磨至肉糜状过滤（滤液收集在带刻度的离心管中）加入等体积95%乙醇混匀、静置10min 离心弃去上清夜、留沉淀加蒸馏水1ml 搅拌溶解而得糖原溶液待用。

鉴定：加入肝糖原溶液10滴

1.取试管2支各加1滴I2液、混匀观察现象加蒸馏水10滴

2.剩余肝糖原液内+浓HCL3滴——沸水浴10min 冷却加入10%NaOH3-4滴至中

性偏碱性——斑氏试剂2ml ——沸水浴5min 冷却观察现象。

血清总脂的测定(香草醛法)

实验原理血清中脂类,尤其是不饱和脂类能与浓硫酸作用,并经水解后生成碳正离子.香草醛中被浓硫酸活化的羟基即与碳正离子起反应生成红色的醌化合物,其强度与碳正离子成正比.

C标×OD测

血清总脂浓度(mg/100mL) = C标×OD测

OD标

OD测

= -------------------×600

OD标

实验四：血液样品的处理及组织样品的制备

采血测定用的血液，多由静脉采集。一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定。采血时所用的针头、注射器、盛血容器要清洁干燥；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。

?血清：全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄色液体。

?血清的制备：由静脉采集的血液，注入清洁干燥的试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快的析出血清。为了缩短时间，也可用离心机分离(未凝或凝固后均可离心)，分离出的血清，用滴管移人另一试管中供测定用，如不及时使用，应贮于冰箱中。分离出的血清不应溶血。

?全血：采血前加入抗凝剂，包括了血浆和血纤蛋白。

?血浆：全血离心后除去血纤蛋白的液体。

?抗凝剂：凡是能抑制血液凝固反应的化合称为抗凝剂。

?1、草酸钾(钠)。其优点是溶解度大，与血液混合后，迅速与血中钙离子结合，形成不溶的草酸钙，使血液不再凝固。

?配制方法：通常先配成10％草酸钾或草酸钠溶液，然后吸取此液0.1ml于试管中，转动试管，使其铺散在试管壁上，置80℃干燥箱内烘干，管壁呈白色粉末状，加塞备用。每管含草酸钾或草酸钠10mg，可抗凝血液5ml。

?应用范围：适用于非蛋白氮、血糖等多种测定项目，但不适用于钾、钠和钙的测定；另外草酸盐能抑制乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和淀粉酶，故使用时给予注意。

?血液内某些化学成分(如血糖)离开机体后仍易被酶作用而影响测定结果。如用混合剂可抑制酶的作用(氟化钠有抑制糖酵解作用)，因而能防止血糖等化学物质的分解。

?配制方法：称取草酸钾6g，氟化钠3g，加蒸馏水至lOOml，分装在试管内，每管0.25ml。80℃烘干后加塞备用。每管含混合剂22.5mg，可抗凝血液5ml。

?应用范围：最适用于血糖的测定，而不适用于脲酶法的尿素氮测定(因氟化钠能抑制脲酶活性)。

肝素是一种较好的抗凝剂，因它对血中有机成分和无机成分的测定均无影响，其主要作用是抑制凝血酶原转变为凝血酶，使纤维蛋白原不能转化为纤维蛋白而凝血。

?配制方法：常将肝素配成lmg／ml的水溶液，每管装0．1ml，再横放蒸干(不宜超过50℃)备用。每管可抗凝血液5～lOml。

?市售肝素大多数为钠盐，可按10mg／ml配制成水溶液。每管装0.1ml，按上法烘干，可使5～lOml血液不凝固。

?应用范围：适用于血液有机物的测定；不适用于凝血酶原的测定。

乙二胺四乙酸二钠盐(简称EDTANa2)

?EDTANa2对血液中钙离子有很大的亲和力，能使钙离子络合而使血液不凝固。

?配制方法：常配成40mg／mlEDTANa2水溶液，每管分装0.1ml，在80℃干燥箱内烘干备用。每管可抗凝血液5ml。

?应用范围：适用于多种生化分析，但不适用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。

?血浆的制备由静脉采集的血液，放人装有抗凝剂的试管或离心管中，轻轻摇动，使血液与抗凝剂充分混合，以防小血块的形成。抗凝血可静置或离心沉淀分离(2000r／min,10min)，以使血细胞下沉，上清液即为血浆。血浆与血清成分基本相似，只是血清不含纤维蛋白原。

无蛋白血滤液的制备

?多生化分析要避免蛋白质干扰，常常先将其中蛋白质除去；分析血液中许多成分时，也常常需要除去蛋白质，制成无蛋白质的血滤液。制备无蛋白血滤液的方法很多，可根据不同的需要加以选择。现将生化常用的无蛋白血滤液制备方法介绍如下：

钨酸法原理：血液中的蛋白质在pH小于其等电点时，可用钨酸来沉淀。钨酸钠与硫酸混合产生钨酸和硫酸钠，游离的钨酸被，蛋白质吸附，形成不溶性的钨酸蛋白而沉淀，经过滤或离心，除去沉淀即得无蛋白的血滤液。

?试剂：①10%钨酸钠溶液；②0.333mol／L硫酸溶液。

?仪器与器材：锥形瓶、吸管、奥氏吸管、滤纸、漏斗或离心管及离心机。

三氯醋酸法原理：三氯醋酸是一种有机强酸，可使血液中蛋白质变性而形成不溶的蛋白质盐沉淀。其上清液即为无蛋白血滤液。此液呈酸性，常用来测定无机磷等。

?试剂：10％三氯醋酸溶液。

?仪器与器材：锥形瓶、刻度吸管和奥氏吸管、滤纸、漏斗或离心管和离心机。

血液葡萄糖的测定（福林-吴宪氏法）

操作注意

1、等水沸腾后，才能放入血糖管。加热要准确8分钟。

2、冷却时切不可摇动血糖管，以免还原的氧化亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果。

3、加入磷钼酸后迅速比色。

4、分光光度计的使用。

1、接通电源，打开比色皿盖，预热20-30分钟后，调节波长至所需波长。

2、将盛有空白溶液的比色皿放在比色架的第一格，其余放测定溶液。将比色皿盖盖上，此时空白溶液在光路上。将光点

调到“T”，调节T为100%。

3、将光点调到“A”，轻轻拉动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，此时读数即为该溶液的吸收度。

4、依次拉出第三、第四个比色皿，分别读取吸收度。

5、测定完毕，先打开比色皿盖，再断电源。

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

电泳：带电粒子在电场中向其与自身电荷相反的电极移动的现象。

不同分子所带电荷种类及数量不同，在相同电场强度及溶液（η）中经过一定时间必然会泳动到不同的位置。因此，含有多种成分的混合物若进行电泳，则各成分在电场中将被逐一分开，并集中到特有的位置上面形成紧密的区带，使混合物成分达到分离的目的。

影响电泳的因素

1、电场强度：越高，电泳速度越快。应选用最适电场强度。

2、溶液的pH值：缓冲溶液的pH值决定了所带电荷的种类和数量。

3、溶液的离子强度：离子强度增加，带电颗粒的泳动速度慢。

4、电渗现象

醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物的电泳。

醋酸纤维薄膜具有均一的泡末状结构，渗透性强，用它作为支持物进行电泳具有简单、快速、定量容易、样品量少、对样品无吸附和拖尾现象、电泳区带清晰等优点。

由于血清中蛋白质所具有的可解离基团不同，在同一pH值的缓冲溶液中所带电荷量不同，因此它们在电场中的移动速度不同。它们在电场中移动速度从快到慢依次为: 清蛋白、α1–球蛋白、α2–球蛋白、β–球蛋白、γ–球蛋白。

电泳

将点好样的薄膜点样面朝下置于电泳槽上, 使点样端置于负极,而另一端置于正极。平衡10分钟，打开电泳仪开关，调节电流为4-6mA，电压为100-120V,电泳40-60分钟。

牛乳蛋白质的提取与鉴定

酪蛋白提取的原理

?蛋白质是含羧基和氨基的两性电解质，在某一pH值溶液中，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，蛋白质以两性离子状态存在，这时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（PI）。

?在等电点时，蛋白质所带净电荷为零，溶解度最小，蛋白质沉淀析出，利用蛋白质的这个特点可将蛋白质提取出来。

?由于粗提出的酪蛋白中还含有脂肪，可用乙醇和乙醚洗涤除去。

?酪蛋白的制备

新鲜牛奶、醋酸纳缓冲液各5ml 40℃分别加热至同样温度保留做鉴定（三）边加边摇混匀5min 沉淀加4ml95%的乙醇离心5分钟上清液：弃去沉淀：做鉴定

琼脂糖凝胶电泳

实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的大小。

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

●琼脂糖凝胶电泳分离DNA，主要是分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。

●溴化乙锭EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。(本实验由毒性小的核酸染料

代替）

操作步骤

●配胶：封闭胶槽，煮琼脂糖0.4 g 琼脂糖加入40 ml 1×TAE中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却

到60℃，加入3 μl的核酸染料，并摇匀（不能有气泡）；

●倒胶制胶：把梳子插入胶板小槽，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固（约30min）；

●充分凝固后，仔细垂直向上拔出梳子，小心取出凝胶，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝

胶1-2mm。

●点样：用移液枪吸取DNA样品5μl于混样板上，再加入1 μl 的6X加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。Marker

由老师点样，DNA样品由每个同学点。

●电泳：调整电压

●观察：紫外灯下进行，看看Marker有没有6条带，总DNA应该有条片段很大的带。

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，

1.生化实验室应注意事项？

实验者应注意：

①一切步骤都按操作进行；

②样品与试剂勿过量取用；

③宜粗者勿细（例如粗天平移物即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；

④试剂、仪器及实验环境的整洁，防止污染及破损；

⑤注意力集中，避免差错。

2.电泳原理？影响电泳因素有哪此？

3.离心机使用操作程序。