分子生物学实验常规技术操作
分子生物学实验常规技术操作
目录
1. 质粒提取
1.1 小提质粒
1.2 小量快提质粒鉴定：
1.3 大提质粒：
2. 酶切
2.1 制备型酶切
2.2 小量酶切鉴定
2.3 DNA片段5'突出端的补平
3. 琼脂糖凝胶电泳
4. 回收
4.1 从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段
4.2 小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册）
4.3 无水乙醇沉淀回收
5. 连接
5.1 一般连接
5.2 平端动态连接
6. 转化
6.1 质粒快速转化
6.2 连接物转化
7. 制普通固体培养板
8. 涂板
9. 挑菌
10. 血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)
哺乳动物细胞单克隆株分离
常用溶液、培养基配制
1. 质粒提取：
1.1 小提质粒：
本实验室在常规条件下采用碱裂解法小量提取质粒
(1)从平板上挑取单菌落或摇甘油菌(5～50uL)，接种于3mL LB液体培养基中（加有相
应的抗生素），37℃振荡培养至OD2.0以上，但也无需过浓。
*通常DH5а菌株摇12～14hr;JM101 7～8hr;ER2566 10～12hr *
(2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未灭菌的新管）中，12000rpm离心15～30sec，
弃上清。通常可取1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。
*不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理 *
(3)加入150uL溶液I，振荡使菌体沉淀充分
．．悬浮。
*务必悬浮完全 *
(4)加入150uL溶液II，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。
*可观察到原浑浊的菌悬液变清变粘 *
(5)加入180uL溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7～10次，不宜太剧烈。
*可观察到白色团片状沉淀出现。*
(6)置冰浴10分钟，也可置于-20℃中5min。
(7)12000rpm离心8～10分钟。
(8)在离心过程中可取未灭菌的新1.5mLEppendorf管，加入等体积(350～400uL即可)酚-
氯仿-异戊醇（25:24:1）备用；取灭菌过的新1.5mLEppendorf管，加入2倍体积(780uL
即可)的无水乙醇置于-20℃备用。
*加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层
的Tris-cl保护液 *
(9)离心完将上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-异戊醇中, 充分混匀。
*小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中 *
(10)12000rpm离心4～5分钟。
(11)吸水相，加入已加好的无水乙醇中,颠倒混匀几次。
*小心不要吸入酚相，没把握时宁愿放弃一些水相 *
(12)-20℃放置5～15分钟。
(13)12000rpm离心10分钟。
(14)迅速弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗一次，于纸上扣干。
*小心不要将沉淀洗掉 *
(15)置于恒温器上干燥(55℃)至无色透明或无乙醇气味，一般大约5～10min。
(16)加入30～40uL 1×TE缓冲液溶解沉淀，-20℃储存备用。
*做完实验请及时收拾实验台*
1.2 小量快提质粒鉴定：（目前较少采用）
(1)取培养的菌液1mL，12000rpm 离心30s，收集菌体，在纸上扣干残留培养液。
(2)用50uL 无菌水充分悬浮菌体。
(3)每管加入50uL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）并充分混匀。
(4)12000rpm 离心10分钟。
(5)小心吸取5uL上清上样电泳。(对于插入片段足够大的重组子，其迁移率应低于未插
入片段的对照质粒。)
* 做完实验请及时收拾实验台*
1.3 大提质粒：
(1)从－20℃保存的甘油菌吸取50uL菌液，接种到3～4mL的LB培养基中，37℃振荡培养
为1.6～1.8。
至OD
600
(2)取0.5mL菌液接种到200mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD
为2.0以上，再加入氯
600
霉素至170ug/mL，37℃继续振荡培养12～16hr。
(3)将摇好的菌液4000rpm离心15min。
(4)弃上清，敞开离心管口倒置，尽量让上清全部流尽。
(5)用预冷的40mL STE充分悬浮菌体沉淀。
(6)4℃，4000rpm离心10min。
(7)弃上清，敞开离心管口倒置，让上清全部流尽。
(8)用预冷的4mL溶液Ⅰ充分悬浮菌体沉淀。
(9)加入新鲜配制的溶液Ⅱ 8mL，上下颠倒几次，液体会变得澄清，置于4℃10min。
(10)加入预冷的溶液Ⅲ 6mL，上下颠倒混匀后，4℃中放置30min。
(11)4℃，12000rpm离心10min。
(12)收集上清，加等体积的异丙醇，4℃放置30min。
(13)4℃，10000rpm离心10min。
(14)弃上清，用70％的乙醇洗沉淀一次，室温吹干，溶于1mL 1×TE中。
(15)加50uL RNaseA，37℃作用2小时。
(16)加1mL新配制的13％的PEG8000溶液（13%PEG8000，1.6M NaCl），充分混匀，4℃放
置30min。
(17)4℃，12000rpm离心15min。
(18)吸去上清，用400uL 1×TE溶解沉淀。
(19)加1/4体积4M LiCl，室温放置5min，12000rpm离心5min。
(20)取上清，用酚、酚－氯仿-异戊醇各抽提一次。
(21)将水相转入一新的Eppendorf管中，加入1/10体积4M LiCl，2倍体积的无水乙醇，
－20℃放置30min。
(22)4℃，12000rpm离心10min，去上清，70％的乙醇洗沉淀一次，室温晾干。
(23)加200uL 1×TE溶解沉淀，测定质粒DNA的浓度后于－20℃保存备用。
*做完实验请及时收拾实验台*
2. 酶切：
2.1 制备型酶切：
(1)在灭菌过的新0.5mL Eppendorf 管中加入下列成分混合：
注意：酶切时酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅
速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用
手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原
处；要用新酶或有问题时请找管理员xxy 。
注意：酶切时用酶量不能过大，过大会影响酶切并且可能会有星号效应。引起酶切效果不佳的原因一般多是质粒没有提
好。除个别特殊位点或内切酶外，酶切时间均不宜过长。
DNA 样品 30uL 10×反应缓冲液*
6uL Rnase A
3～4uL ddH 2O
适量 限制性内切酶A (限制性内切酶B 1uL
1uL)
反应总体积 50～70uL
* 为了保证酶切效率(至少在75%以上)，需选用合适的反应缓
冲液，不同公司的酶切反应缓冲液基本上可以通用。但需注
意有的要另外加BSA (10×和100×的都有)。
(2)37℃反应3～4小时(可依据所使用酶的需要，选用合适的酶切时间和温度)。
(3)取1～2uL 电泳鉴定。
* 做完实验请及时收拾实验台 *
2.2 小量酶切鉴定
(1)在灭菌过的新0.5mL Eppendorf 管中加入下列成分混合：
注意：酶切时酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅
速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用
手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原
处；要用新酶或有问题时请找管理员xxy 。
注意：酶切时用酶量不能过大，过大会影响酶切并且可能会有星号效应。引起酶切效果不佳的原因一般多是质粒没有提
好。除个别特殊位点或内切酶外，酶切时间均不宜过长。
注意：做小量酶切鉴定时要尽量选用较为廉价的酶
DNA 样品
5uL 10×反应缓冲液*
1.5uL
RNase A 0.5uL ddH
2
O 适量
限制性内切酶A (限制性内切酶B 0.1uL 0.1uL)
反应体积 15～20uL
*请根据保证酶切效率(至少在75%以上)的需要选用合适的反
应缓冲液，不同公司的酶切反应缓冲液基本上可以通用。但
需注意有的要另外加BSA(10×和100×的都有)。
(2)37℃反应2～3小时(可依据所使用酶的需要，选用合适的酶切时间和温度)。
(3)取1～2uL电泳鉴定。
*做完实验请及时收拾实验台*
2.3DNA片段5'突出端的补平:
(1)在灭菌过的新0.5mL Eppendorf管中加入下列成分混合：
注意：酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅速，酶
不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用手直接接
触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原处；要用新酶
或有问题时请找管理员xxy。
欲处理的DNA样品 2ug
10×Klenow buffer 3～4uL
10mMdNTP 2uL
ddH
2
O 适量
DNA聚合酶I(Klenow 大片段) 5～10U
反应体积 30～40uL
(2)37℃反应1小时后，低熔点琼脂糖凝胶回收。
*做完实验请及时收拾实验台*
3. 琼脂糖凝胶电泳：
(1)制备凝胶：根据需要，在指定的三角瓶中配制50/100mL特定浓度的琼脂糖凝胶。首
先在电子天平上称取一定量的琼脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，加入100mL1×TAE,
再加入3～4uL溴化乙锭(EB),混匀，在微波炉中煮化(大约4～5min)，混匀后倒入插
好样品梳的凝胶槽中,凝固后备用。
*溴化乙锭(EB)有潜在的致癌性，操作时要戴手套，并且注意不
要污染其它操作区 *
* 在微波炉中煮化时要小心不要让凝胶暴沸 *
* 倒胶时不要倒太厚，一般可插入梳子5mm左右即可 *
* 倒回收胶要使用专用的样品梳和凝胶槽 *
* 分离不同大小的DNA片段请选用合适浓度的琼脂糖凝胶 *
琼脂糖凝胶(%) 线性DNA的有效分离范围(kb)
0.5 2～30
0.8 1.5～10
1.0 1.0～7
1.2 0.7～6
1.5
2.0
2.5
3.0 0.5～3 0.2～2 0.1～1.5 0.07～1.0
(2)待胶凝固后，小心拔去梳子，拔出时注意不要破坏胶孔。
(3)用刀片切下所需的胶块，放入加有足够电泳缓冲液(1×TAE)的电泳槽中，缓冲液面
高于凝胶表面3～5mm即可。
*注意电泳时使用的是1×TAE缓冲液，而母液是50×的，配制时要留神 *
*在放入凝胶要上样前，最好检查一下样品孔是否有破损泄漏，尤其
是上回收样品之前 *
(4)可在一干净手套上点滴适量(1～3uL)的3×溴酚兰上样缓冲液(深绿色)，用枪移取适
量的样品(1～10uL)与滴加好的溴酚兰上样缓冲液混合(可观察到混合液变为蓝色)，再将混合液小心加入胶上的样品孔中。
*上样要迅速准确，上样量不要过大以致漫出样品孔 *
*若样品要求无污染，可使用新的灭菌枪头上样 *
*若样品无严格要求(如用来做小量酶切鉴定的样品)，可用一个枪头多次上
样，但每次上样前在电泳缓冲液中洗几下 *
(5)接通电极进行电泳，电压一般可在140V～200V。
*注意要接对正负极，核酸是由负极向正极方向跑的 *
*打开及关闭电泳仪时请特别注意，不要用沾染有EB的手套接触电泳仪 *
(6)当溴酚兰迁移至足够距离时(至少1cm),关闭电源，取出胶块放到紫外灯下观察。
* 在紫外灯下观察时要注意保护眼睛，不要用裸眼直接观察 * * 一般质粒样品电泳时，电泳迁移率从跨快倒慢依次是：
RNA、溴酚兰、cccDNA、LcDNA、OcDNA
那些始终跑不出孔的样品多是染色体
* 观察结束后，要及时处理凝胶及手套，严禁随处抛弃 *
*做完实验请及时收拾实验台*
4. 回收：
4.1 从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段
(1)将已经电泳确定的可回收的酶切产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶中进行电泳。
*最好换用新的电泳缓冲液，即1×TAE *
(2)当溴酚蓝跑到一定距离后(至少2cm以上)在长波紫外灯下观察，用清洗过的刀片在目
的片段前切下一与目的片段同长，宽度适当(一般1cm左右)的胶块。
*不要忘记在胶下垫一个新的塑料手套防止污染 *
*小心不要将回收胶切裂, 同时注意与目的带相邻的切面要尽量平整 *
(3)将切好的回收胶块放在原回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝
固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。
*小心低熔点琼脂糖凝胶块与原回收胶块的交界面易断裂 *
(4)待目的带完全进入低熔点琼脂糖凝胶后，在长波紫外灯下用清洗过的刀片切下含有
所需DNA带的凝胶条，置于新的灭菌过的1.5mLEppendorf管中,加300uL TE。
(5)65℃水浴10min或更长使胶块完全融化。
(6)立即加入等体积(300-350uL)Tris-Cl饱和酚（pH8.0）,摇晃混匀。
(7)12000rpm离心5min。
(8)小心将水相移置另一1.5mLEppendorf管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，摇晃混
匀。
*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相 *
(9)12000rpm离心5min。
(10)小心将水相移置另一1.5mLEppendorf管中，加入2.5～3倍体积(780uL即可)预冷的
无水乙醇。
*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相 *
(11)置液氮3分钟，取出后可于-20℃放几分钟。小心防止管子爆裂。
(12)12000rpm离心10min。
(13)迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇后清洗后置于恒
O溶解。
温器上干燥(55℃)5～10min至无乙醇气味，再加入20uLddH
2
(14)取2uL电泳定量后－20℃储存备用。
*做完实验请及时收拾实验台*
4.2 小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册）
(1)将已电泳确定的可回收的酶切产物或其它产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶中进
行电泳。
*要换用新的电泳缓冲液，即1×TAE *
(2) 当溴酚蓝跑到一定距离后(至少2cm以上)在长波紫外灯下观察，用清洗过的刀片切
取含目的DNA的琼脂糖凝胶，尽可能小，置于一新的已灭菌过的1.5mlEppendorf管。
*回收胶下要垫一个新的塑料手套防止污染 *
(3)每100mg凝胶加入300uL/450uL S1液，55O C温育10min，每2min颠倒一次。
*务必完全溶解 *
(4)加入1/3 体积(100uL/150uL)异丙醇，混勻，55O C，温育1min。
(5)将混合液移入吸附柱，高速(10000rpm)离心1min，弃去收集管液。
(6)往吸附柱中加入450ul W1，静置1min，高速离心15sec，弃去收集管液。
(7)重复步骤（6）一次，但无需静置。
(8)弃去收集管液后再高速离心1min。
(9)将吸附柱放于一干净的已灭菌的1.5mlEppendorf管，在吸附膜中央滴入30～40ul T1
液或ddH
2O，室温静置1min，当用ddH
2
O溶解时可在37O C置5min。
(9)高速离心1min，弃去吸附柱。
(10)取2uL电泳定量后－20℃储存备用。
*做完实验请及时收拾实验台*
4.3 无水乙醇沉淀回收：
(1)将已确定的可回收产物溶于加有300uL 1×TE缓冲液的灭菌过的新1.5mLEppendorf
管。
(2)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，摇晃混匀。
(3)12000rpm离心5min。
(4)小心将水相移置另一灭菌过的新1.5mLEppendorf管中，加入2.5～3倍体积(780uL即
可)预冷的无水乙醇。
*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相 *
(5)置液氮3分钟，取出后可于-20℃放几分钟。小心防止管子爆裂。
(6)12000rpm离心10min。
(7)迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇后清洗后置于恒
温器上干燥(55℃)5～10min至无乙醇气味，再加入20uLddH2O溶解。
(8)取2uL电泳定量后－20℃储存备用。
*做完实验请及时收拾实验台*
5. 连接：
5.1 一般连接：
(1)在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：
载体 0.5～1.5uL
目的基因*适量
10×T4 Ligase Buffer 1～1.5uL
T4 DNA连接酶
ddH
2O
1uL
适量
反应总体积 10～15uL
*目的片段所需量(ng)=载体量(ng)×目的片段长度×3/载体长度
(2)14～16℃连接6～14小时。
*做完实验请及时收拾实验台*
5.2平端动态连接
(1)在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合:
线性化载体(平端酶SmaI/EcoRV/HincII处理）
目的片段
10×T4 Ligase Buffer
相应平端酶(SmaI/EcoRV/HincII)
T4 DNA连接酶
ddH
2O
200ng
适量*
2uL
5～8U
10U
适量
反应总体积20uL
* 目的片段所需量(ng)=载体量(ng)×目的片段长度×3/载体长度
(2)25℃(SmaI) 或37℃(EcoRV/HincII) 作用3～4小时，将内切酶及连接酶灭活后转化。
*做完实验请及时收拾实验台*
6. 转化
6.1 质粒快速转化：
(1)根据需要，从超低温冰箱中迅速取出一管感受态细胞，用手捂化后，置于冰浴中10min
以上，并请注明取出的日期时间。不要取出后立即使用或使用已放置 6hr以上的感
受态细胞。
(2)在超净工作台内取一转化用1.5mlEppendorf管，先吸取20uL感受态细胞，再加入质
粒(若质粒浓度大，只要枪头蘸一下即可，若低可取1～2uL用于转化)与之混合，混
匀后冰浴15min。
*小心不要污染*
(3)42℃热休克90～120sec，取出迅速置冰浴中2min。
(4)加入200uL LB培养基（无抗性）,37℃振荡培养15-30min。
(5)取相应抗性的平板置于37℃预热。
(6)振荡培养15～30min后取100uL菌液涂板。
(7)37℃培养适当时间(菌株不同，培养温度和时间均有不同)。
通常DH5а菌株培养12～14hr;JM101 7～8hr;ER2566 10～12hr；BL21 9-11hr GI724 30℃培养20～24hr(IMC平板)
*做完实验请及时收拾实验台*
6.2 连接物转化：
(1)根据需要，从超低温冰箱中迅速取出一管感受态细胞，用手捂化后，置于冰浴中15min
以上,并请注明取出的日期时间。不要立即使用或使用已放置 6hr以上的感受态细
胞。
(2)在超净工作台内取一转化用1.5ml Eppendorf管，吸取40uL感受态细胞和5uL连接物
混合，混匀后冰浴30min。
*小心不要污染 *
(3)42℃热休克90～120sec，取出迅速置冰浴中2min。
(4)加入360uL LB培养基（无抗性），37℃振荡培养40～60min。
*若连接物需用蓝白斑来鉴定，则在菌液涂板前30min，需预先在平板上均匀涂布上适当浓度的X-gal与IPTG，并在37℃中正放30min。*
(5)取相应抗性的平板置于37℃预热。
(6)振荡培养40～60min后涂布平板。
(7)37℃培养适当时间(菌株不同，培养温度和时间均有不同)。
通常DH5а菌株培养12～14hr;JM101 7～8hr;ER2566 10～12hr；BL21 9-11hr GI724 30℃培养20～24hr(IMC平板)
*做完实验请及时收拾实验台*
7. 制普通固体培养平板：
(1)固体琼脂培养基的配制：本实验室常用的是LB固体琼脂平板，浓度为1.5%，即在100mL
LB液体培养基中加入1.5g的琼脂，灭菌后可使用。
(2)使用时取一瓶灭过菌的固体琼脂培养基，放在电炉上小心煮化。
*在电炉上煮化时一定要小心看守，防止其暴沸 *
*有时会有部分固体琼脂沉积在瓶底，在煮化时要小心不要煮焦 *
(3)将固培冷却至45～60℃，在超净工作台内按比例加入需要的抗生素，混匀。
*固培煮化后，可在流水下冷却，但须小心玻璃会卒冷爆裂 *
*当冷却至手摸不烫时即可，冷却过头易于凝固 *
(4)在超净工作台内按比例加入需要的抗生素，混匀后，将培养基倒入已灭菌过的平皿
内，厚度适当。
*培养基不要倒太厚，一般3～5mm即可，也不要过薄，涂板时易涂破 *
(5)平皿可正放在超净工作台内，待其冷却凝固后使用或放入冰箱4℃储存备用。
*在放入冰箱4℃前，要在平板上标记清楚所加的抗生素 * *做完实验请及时收拾实验台*
8. 涂板：
(1)若所要使用的平板储存于冰箱4℃，则使用前须预先取出放在室温或37℃中预热一段
时间。
*取用平板时一定要注意抗性 *
*平板预热时最好倒置 *
(2)在超净工作台内用枪将所要涂布的菌液移入平板。
*质粒转化一般只要涂100uL左右的菌液，连接物涂200～400uL *
(3)将涂布器先在酒精灯的外焰上灼烧，再浸入乙醇中，取出后再通过灯焰，燃尽其上
的乙醇，待其冷却后方可使用。
*如平板的盖子内面上覆有水珠，可用于冷却涂布器 *
*涂板时不要心急，一定要等涂布器充分冷却后方可使用 *
(4)用涂布器将平板上的菌液涂布均匀，平板倒置放在培养箱中培养，除GI724(30℃)
外，其它菌株均在37℃中培养。
* 做完实验请及时收拾实验台 *
9. 挑菌：
(1)待平板上的菌落长至足够大即达到可挑的水平。
(2)在超净工作台中，在灭菌过的试管内倒入3～4mL灭菌过的培养基，培养基根据需要
预先加入抗生素(由菌落所携带的质粒上的抗性基因决定)。
*抗生素要按比例加入培养基，并要加了抗生素的培养基上做清楚
标记，没有用完的培养基要封好放入冰箱4℃，不要放在外面*
*请尽量使用冰箱内已加好抗生素的培养基 *
(3)用镊子夹取灭菌过的牙签挑取平板上的单菌落，在试管内的培养基中蘸洗几下，旋
紧管盖后再将牙签丢弃于超净台外的收集桶内，并请您扔准。
*挑菌时不提倡将牙签直接投入培养基中 *
*挑菌时一定要挑清晰正常的单菌落 *
*挑过菌的牙签一定不能留在超净工作台中 *
(4)挑菌后请将装灭菌牙签的小烧杯封好，并及时将工作台清理干净。
(5)接种过菌落的试管放在摇床中在合适温度下摇动培养，摇速一般170～230r/min。
*试管要在摇床放好，有适当的倾斜角度(45。左右) *
*要注意不同的菌株和摇菌目的，可能需要不同的温度和摇速。* *做完实验请及时收拾实验台*
10. 血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)：
(1)将血清装入新的灭菌过的1.5mL Eppendorf管，每管200uL。
*使用血清，尤其是未灭活的血清时要注意安全，不要污染环境 *
*一旦发生血清污染环境，请立即用84消毒液处理 *
(2)在每管中加入STE 156uL
10% SDS 40uL
100×Pro-K 4uL
然后在56℃中水浴2-3小时，每几分钟(一般5～10min)轻轻摇晃混匀一次。
*管子一定要仔细盖严，防止泄漏及外面的水进入 *
(3)加入400uL的酚-氯仿-异戊醇，摇匀后静置几分钟(5～10min)，不宜剧烈。
(4)12000rpm离心10min。
(5)小心将上清取出，加入两倍体积以上(780uL即可)的无水乙醇和终浓度为0.2M的
NaAc(40uL)，置于液氮中3min。
*小心不要吸入中间的蛋白和下层的酚相 *
(6)取出后可先置于-20℃中放2分钟以防止管子爆裂。
(7)12000rpm离心10min。
(8)迅速弃去无水乙醇，再用无水乙醇洗一下(也可不洗)，
*最好用灭菌枪头吸干管内液体 *
(9)在恒温器(55℃)干燥5min左右至无乙醇气味，再加入20uLddH2O溶解。-20℃储存
备用。（使用时不要频繁的反复冻融）
*操作过程中要严防污染 *
*做完实验请及时收拾实验台*
哺乳动物细胞单克隆株分离：
(1)把转染72hr后的细胞从六孔板中的用Verson液消化洗下，经稀释后转入50mL螺口
玻璃培养瓶中培养，待细胞生长至基本贴壁时再加入含作用浓度为 400ug/mL G418
的完全培养基继续培养。以2～3天为间隔换液，如此培养一星期后可观察到有大量
细胞死亡，相应降低G418压力继续培养2～3星期后，可观察到有细胞克隆形成。
(2)将已形成细胞克隆的培养瓶置于显微镜下，观察克隆的位置，并用记号笔将其标出。
(3)用镊子夹取灭菌过的小滤纸片，在Verson中蘸湿后将其覆盖在细胞克隆上，5～20s
后取出在加有完全培养基(600uL/孔)的24孔板中刷洗数次，将附着上的细胞洗下。
培养箱中37℃进行培养。
(4)将转移有细胞克隆的24孔板置于5%CO
2
(5)待24孔板中的细胞生长并达到80%以上满底后，分别取细胞培养上清进行ELISA检
测。
(6)将经检测可表达目的基因的细胞克隆转入50mL螺口培养瓶中继续培养，并在适当的
时候进行传代换液，扩增细胞，进行进一步的鉴定。
常用溶液、培养基配制
LB培养基:
每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH
O配制，再用10M
2
NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
固体培养基:
LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压灭菌后使用。
溶液I:
葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH8.0。
溶液II:
NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，用ddH2O现配现用。
溶液Ⅲ:
取5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。
0.1mol/L CaCl2 :
在适量纯水中溶解54gCaCl2.6H2O，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。
Tris－饱和酚:
因为在
酸性条件下DNA分配于有机相，因此使用前必须对重蒸酚进行平衡，使其pH 值在7.8以上。将保存于-20℃的重蒸酚取出置室温，68℃水浴使其溶解，加
0.1%8-羟基喹啉，再加入等体积1.0mol/l（pH8.0）的Tris-Cl。
《分子克隆》推荐磁力搅拌60min，静置15min分层后测pH值，若距pH7.8偏差太大，再更换加入等体积的1.0mol/l Tris-Cl，继续搅拌后检测酚液的pH 变化，若仍达不到7.8，则再更换加入等体积1.0mol/l Tris-Cl（pH8.0），重复上述操作，直到pH接近或大于7.8。再更换加入等体积0.1mol/l Tris-Cl（pH8.0），重复上述操作后静置将酚液分装入棕色玻璃瓶，表面覆一层Tris-Cl水相，以防止酚的氧化，并维持酚液pH值，4℃储存备用。
本实验室做法是：先用等体积的1.0mol/l Tris-Cl磁力搅拌2 hr，静置分层后测酚相pH值，若达不到7.8，则加入30g Tris干粉，继续搅拌1hr后测pH 值，若仍未靠近7.8，再加入10-15g30g Tris干粉继续搅拌，可搅拌过夜，一般平衡1000mL酚液需加入40-45g Tris干粉，搅拌至pH接近或大于7.8。再更换加入等体积0.1mol/l Tris-Cl（pH8.0），继续搅拌1-2hr后静置分层，将酚液分装入棕色玻璃瓶，表面覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。
酚-氯仿-异戊醇(25:24:1) :
以25：24：1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。
琼脂糖凝胶加样缓冲液:
0.25%溴酚蓝，0.25%二甲本青FF，40%(w/v)蔗糖水溶液
TE缓冲液:
10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，灭菌后使用。实验室中配有100×的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×使用液，灭菌后使用。
无DNA酶的RNA酶:
将市售RNaseA粉末溶于10mmol/L Tris-Cl（pH7.5）和15mmol/L NaCl溶液中，成100mg/mL，100℃水浴加热15min，缓慢冷却至室温，分装存于-20℃。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
实验室安全操作规程
实验室安全操作规程 一、实验室安全守则 (一)分析人员必须认真学习分析规程和有关的安全技术规程，了解设备性能及操作中可能发生事故原因，掌握预防和处理事故的方法。 (二)玻璃管与胶管、胶塞等拆装时，应先用水润湿，手上垫棉布，以免玻璃管折断扎伤。 (三)稀释浓硫酸的容器要放在塑料盆中，只能将浓硫酸慢慢到入水中，不能相反!必要时用水冷却。 (四)蒸馏和提纯时不能离人，以防温度过高或冷却水突然中断。 (五)化验室每瓶试剂必须贴有明显的与内容物相符的标签。严禁将用完的原装试剂空瓶不更换标签而装入别种试剂。发现试剂瓶上标签掉落或将要模糊时应立即贴好标签。 (六)不准使用绝缘损坏或老化的线路及电器设备。保持电器及电线的干燥。 (七)正确操作闸刀开关，应使闸刀处于安全合上或完全拉断的位置，不能若即若离，以防接触不良打火花。 (八)使用酒精灯时，注意酒精切勿装满，应不超过容量的2/3，灯内酒精不足1/4容量时，应灭火后添加酒精。燃着的灯焰应用灯冒盖灭，不可用嘴吹灭，以防引起灯内酒精起燃。酒精灯应用火柴点燃，不应用另一正燃的酒精灯来点，以防失火。 (九)若局部起火，应立即切断电源，用湿抹布或石棉布覆盖熄灭。若火势较猛，应立即与有关部门联系，请求救援。 (十)打开浓盐酸、浓硝酸、浓氨水试剂瓶塞时应戴防护用具。 (十一)打开高温烘箱前，须确认箱内温度小于100℃后方可打开。 (十二)若遇酸碱液灼烧时，速用大量自来水冲洗患处。属酸液烧伤，用2%碳酸氢钠冲洗；属碱液烧伤，用2%硼酸冲洗，再用清水冲洗。 二、化学试剂的分类和规格 (一)化学试剂按其用途分为一般试剂、基准试剂、无机离子分析用有机试剂、色谱试剂与制剂、指示剂与试纸等。 (二)实验室最常见试剂的规格 1.基准试剂是一类用于标定滴定分析标准溶液的标准参考物质，可作为滴定分析中的基准物用，也可精确称量后直接配制标准溶液。主成分含量一般在99.95％—100.05％，杂质含量略低于优级纯或与优级纯相当。标签颜色为浅蓝色。 2.优级纯试剂，也称为保证试剂，其成分高，杂质含量低，主要用于精密的科学研究和测定工作，简称GR级。 3.分析纯试剂，简称AR级，质量略低于优级纯，用于一般的科学研究和重要的测定。 4.化学纯试剂，简称CP级，质量较分析纯差，用于工厂、教学实验的一般分析工作。 5.实验试剂，简称IR级，杂质含量多，主要用于普通的实验或研究。 三、化学试剂的使用方法和存放 (一)使用方法 化验人员要熟知最常用试剂的性质，如市售酸碱的浓度，试剂在水中的溶解性，有机溶剂的沸点，试剂的毒性、危险性及其化学性质等，要注意保护试剂瓶的标签，它表明试剂的名称、规格、质量，万一掉失应照原样贴牢。分装或配置试剂后应立即贴上标签。决不可在瓶中装上不是标签指明的物质。无标签的试剂可取小样检定，不能用的要慎重处理，不应乱倒。 为保证试剂不受沾污，应当用清洁的牛角勺从试剂瓶中取出试剂，决不可用手抓取。
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
实验室技术规范和操作规程总
一、生物安全实验室操作规程 实验室生物安全管理程序 1.目的，有效地针对科室进行全面的生物安全管理，确保工作人员的安全。 2. 适用范围：适用于科室各专业实验室。 3、职责 3.1、科主任负责任命生物安全小组，指导，规范其工作。 3.2、生物安全小组组长负责安全小组日常工作的安排。 3.3、生物安全小组负责科室安全的具体工作。 4、工作程序 4.1、生物安全小组组成 4.1.1、科主任指定安全小组组长 4.1.2、经年度考核，从科室成员中选拨具有高度责任心和实验室知识的技术骨干， 由科主任命为生物安全小组安全成员。由3人组成。安全小组成员任期一年，任期中出现特殊情况科主任可对之罢免。 4.2、实验室生物安全的维护和检查 4.2.1、生物安全小组指定针对安全操作和安全装备的检查方案，至少每年检查一次。 4.2.2、生物安全小组建立安全清单，为回顾性检查提供资料并进行记录，形成《安 全记录》。 4.2.3、对危险品、危险区进行鉴定并加以标志。 4.2.4、实验室应按规定及时报告所有的事件和潜在的危险因素。 4.2.5、安全小组应定期对工作人员进行安全培训教育，并对各种紧急情况下应急措
施进行培训。 4.2.6、若发生职业暴露应及时报告科主任和生物安全小组人员。 4.3、警告标记和标签的建立。 4.3.1、对不因危险程度的实验工作区进行标志。 4.3.2、对高度危险性区域要张贴危险公告。 4.3.3、装存危险物质的容器必须贴上标签，其内容应详细。 5、安全操作规程 5.1、临检、生化、免疫、血库等实验室生物安全防护 5.1.1、在实验室工作区禁止吸烟 5.1.2、禁止在实验室放置食物、饮料及类似的存在有潜在的从手 到口的接触途径的其他物质。禁止用实验室的冰箱（柜）储存食物。 5.1.3、处理腐蚀性或毒性物质时必须做好防护工作。应使用安全镜、面罩或其他的眼睛和面部防护用品。 5.1.4、在实验室工作区，病区应穿白大衣或隔离衣，服装应符合实验室设备的要求。 5.1.5、应穿着舒适，防滑并能保护整个脚面的鞋子。 5.1.6、在实验工作区头发不可下垂，避免与污染物质接触或影响实验操作，有此类危险的饰物应避免带入工作区。不可留长胡须。 5.1.7、由实验工作区进入非污染区要洗手，接触污染物后要立即洗手。 5.1.8、实验室禁止堆积过多的垃圾，至少应每日清理一次。 5.1.9、禁止在实验工作区存放个人物品。 5.1.10、在实验室指定清洁区和非清洁区，非本室工作人员禁止进入工作区。
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
生物安全操作规程和技术规范
生物安全操作规程和技术规范会昌县妇幼保健院检验科
目录 1、生物安全实验室操作规程 2、感染性材料的实验操作规程 3、仪器设备的使用规程 4、个人防护用品的使用规范 5、实验室消毒规程 6、废弃物的生物安全处理规程 7、尖锐器具的安全操作规程 8、紧急情况处理规程及应急预案 9、生物安全柜操作规程 10、样本分离操作规程
生物安全实验室操作规程 1、目的 有效地针对科室进行全面的生物安全管理，确保工作人员的安全。 2、范围 适用于生物安全专业实验室。 注（1）、本实验室除HIV初筛实验室为二级生物实验室外，其他实验室均为一级生物实验室。 （2）、本实验室成立了生物安全管理委员会，由7人组成。 3、职责 、中心主任为实验室生物安全第一责任人，负责实验室生物安全管理委员会的运行。 、技术负责人负责生物安全管理委员会的日常工作的安排。 、质管科、检验科负责实验室生物安全的具体工作。 4、工作程序 、生物安全管理委员会组成 4.1.1、中心主任任指定管理委员会主任。 4.1.2、经年度考核，从科室成员中选拨具有高度责任心和实验室知识的技术骨干，由中心主任命为生物安全管理委员会安全成员。由7人组成。管理委员会成员任期一年，任期中出现特殊情况中心主任可对之罢免。 、实验室生物安全的维护和检查 4.2.1、生物安全管理委员会指定针对安全操作和安全装备的检查方案，至少每年检查一次。 4.2.2、生物安全管理委员会建立安全清单，为回顾性检查提供资料并进行记录，形成《安全记录》。 4.2.3、对危险品、危险区进行鉴定并加以标志。
4.2.4、实验室应按规定及时报告所有的事件和潜在的危险因素。 4.2.5、管理委员会应定期对工作人员进行安全培训教育，并对各种紧急情况下应急措施进行培训。 4.2.6、若发生职业暴露应及时报告科主任和生物安全管理委员会人员。 、警告标记和标签的建立。 4.3.1、对不同危险程度的实验工作区进行标志。 4.3.2、对高度危险性区域要张贴危险公告。 4.3.3、装存危险物质的容器必须贴上标签，其内容应详细。 5、安全操作规程 、生物安全实验室个人防护规程 5.1.1、生物安全实验室个人防护物品使用 在生物安全实验室工作时必须使用合适的个人防护装备，在离开实验室前必须脱掉并洗手。更换下来的防护服、手套、口罩和鞋套要先经高压灭菌后再行清洗或废弃，眼镜和面罩用适当的消毒剂浸泡后清洗。 1、实验防护服 应选用长袖、后开口、在袖子和前襟部位衬有塑料防渗透材料的防护服，并定期更换以保持清洁。当防护服被危险材料污染时应立即将防护服内面向外反卷脱下，把污染处包在里面放入高压消毒锅。 2、手套 应选用乳胶或乙烯基手套，保证所戴手套无漏损，大小合适，可完全遮住手及腕部，如必要可覆盖实验防护服的袖子。每次操作完成或中间离开实验室时都要换掉手套，在手套破裂或怀疑内部受污染时要及时更换，用过的手套和污染物放在一起处理。在生物安全柜中操作时手套若被严重污染应在安全柜内摘掉手套放入污染物收集袋中。摘手套时应内面向外反卷脱下。本文来自检验地带网 3、鞋 最好选用防渗透的鞋套，用后高压灭菌废弃。或选用可消毒的包住脚面的鞋，用后消毒清洗。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
PCR实验室标准操作规程SOP
目录 申报文件 一、临床基因扩增检验实验室技术验收申请表 二、《医疗机构执业许可证复印件》 三、拟设置基因扩增检验实验室医院的医疗卫生资源状况对临床基因扩增检验的需求情况以及实验室 运行的预测分析 四、拟设基因扩增检验实验室的设置平面图 五、实验室主要负责人简历表 六、实验室工作人员一览表 七、主要仪器设备表 八、拟开展的临床基因诊断项目 九、几点说明 质量手册 一、管理性程序： 程序文件的管理和维护 (1) PCR实验室管理制度 (2) 生物安全准则 (4) 实验室生物防护措施 (7) 实验室传染性废弃物管理制度 (9) PCR实验室的人员配置及管理制度 (12) PCR实验室的人员培训计划及措施 (14) PCR实验记录管理制度 (15) 惠安县医院PCR检验报告单保密制度 (17) 检验结果的传送管理制度 (19) 实验室的清洁制度 (20) 化学试剂的管理程序 (22) 实验室消耗品购买、验收和贮存程序 (23) 新项目审批程序 (25) 仪器设备的管理制度 (26) 仪器设备的使用制度 (28) 仪器设备的标准操作制度 (29) 仪器设备的维护保养程序和制度 (31) 仪器设备的校准制度 (34) 仪器设备发生故障的应急处理制度 (35) PCR检测的标本管理制度 (36) 二、检测项目操作程序： 标本、样本编号唯一性程序 (38) 临床标本的采集、运送和接收程序 (39) 临床标本的保存程序 (41) 临床标本的处理（核酸纯化）程序 (42) 核酸扩增及产物分析检测的标准操作程序 (43) I
消毒液的配制程序 (45) 室内质量控制操作程序 (46) 实验室室间质量评价的操作程序 (49) 试剂的质检操作程序 (50) 带滤塞吸头的质检操作程序 (52) 人员流动程序 (53) 抱怨处理程序 (54) 应急处理程序 (55) 生物污染废弃物处理标准操作程序 (57) 乙型肝炎病毒DNA-荧光定量PCR测定 (59) 沙眼衣原体DNA-荧光PCR测定 (61) 结核菌DNA-荧光定量PCR测定 (63) 三、仪器设备标准操作程序： GeneLight 9800实时跟踪荧光PCR仪操作程序 (66) Reactor4800加热仪标准操作程序 (67) FX 1200-Ⅱ- B2型生物安全柜操作程序 (68) SpanStar2418台式高速离心机标准操作程序 (70) 加样器的操作程序 (71) 医用低温冷冻冰箱标准操作程序 (73) 移动紫外灯操作程序 (74) 四、仪器设备维护保养程序 GeneLight 9800实时跟踪荧光PCR仪维护保养程序 (75) Reactor4800器加热仪维护保养程序 (76) FX 1200-Ⅱ- B2型生物安全柜维护保养程序 (77) SpanStar2418台式高速离心机的维护保养程序 (78) 医用低温冷冻冰箱保养程序 (79) XW-80A型旋涡混合器的保养程序 (80) 移动紫外灯维护保养程序 (81) 五、仪器设备校准程序： GeneLight 9800实时跟踪荧光PCR仪校准程序 (82) Reactor4800器加热仪校准程序 (83) FX 1200-Ⅱ- B2型生物安全柜校准操作程序 (84) 加样器的校准程序 (85) SpanStar2418台式高速离心机的校准程序 (87) 温湿度表的校准程序 (88) 六、附相关图表 附表001 送检标本接收记录表 附表002 送检标本拒收记录表 附表003 标本超低温保存及处置记录表 附表004 室内质量控制登记表 附表005 试剂验收记录表 附表006 试剂质检记录表 附表007 紫外灯强度监测表 附表008 消耗品验收记录表 附表009 消耗品质检记录表 II
生物实验室操作规范安全手册(20201101121416)
实验室操作规范 本规程中列出了最基本的实验室操作和程序，他们是微生物学操作技术规范的基础。在规划实验室和国家级实验室项目时，可以根据这些规程来制订实验室安全操作的书面程序。每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全 的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。下面列出了一些 最重要的概念。 进入规定 1在处理危险度2级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志（图1）。 2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。 3、实验室的门应保持关闭。 4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。 5、进入动物房应当经过特别批准。 6、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。 人员防护 1在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。 2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物 的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。 3、在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。 4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。 5、严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息室和卫生间）。 6、不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。 7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。 8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。 9、在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。 操作规范 1严禁用口吸移液管。 2、严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。 3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。 4、应限制使用皮下注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液，皮下注射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。 5、出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告。 6、必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。 7、污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。 8、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。 实验室中标本的安全操作 实验室标本的收集、运输和处理不当，会带来使相关人员感染的危险。
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
检验实验室操作的基本知识
检验实验室操作的基本知识 （一）实验室的基本任务和工作准则 1、实验室的基本任务 实验室是组织中负责质量检验工作的专门技术机构，承担着各种检验测试任务。它是组织质量工作、质量控制、质量改进的重要技术手段，是重要的质量信息源。其基本任务是： （1）快速、准确的完成各项质量检验测试工作；出具检测数据（报告）。 （2）负责对购入的原材料、元器件、协作件、配套产品等物品，依据技术标准、合同和技术文件的有关规定，进行进货验收检验。 （3）负责对产品形成过程中，需在实验室进行检验测试的半成品、零部件的质量控制和产成品交付前的质量把关检验。 （4）负责产品的型式试验（例行试验）、可靠性试验和耐久试验。 （5）承担或参与产品质量问题的原因分析和技术验证工作。 （6）承担产品质量改进和新产品研制开发工作中的检验测试工作。 （7）及时反馈和报告产品质量信息，为纠正和预防质量问题，提出意见。 2、实验室的基本工作准则 由于实验室是生产组织进行质量把关的主要技术手段，是为质量控制、质量评价、改进和提高产品质量，开发新产品等项工作提供技术依据的重要的技术机构，其工作质量如何直接关系到产品信誉和组织自身的发展。只有为各项检验任务提供正确的、可靠的检测结果，才可能对质量作出正确的判断和结论，反之亦然。因此，实验室最基本的工作准则，应该是坚持公正性、科学性、及时性，做好检验测试工作。
（1）公正性。就是实验室的全体人员都能严格履行自己的职责，遵守工作纪律，坚持原则，认真按照检验工作程序和有关规定行事。在检测工作中，不受来自各个方面的干扰和影响，能独立的公正的做出判断，始终以客观的科学的检测数据说话。 （2）科学性。就是实验室应具有同检测任务相适应的技术能力和质量保证能力。人员的素质和数量的配备能满足检测工作任务的需要。检测仪器设备和试验环境条件符合检测的技术要求。对检测全过程可能影响检测工作质量的各个要素，都实行有效的控制和管理，能够持续稳定地提供准确可靠的检测结果。 （3）及时性。就是实验室的检测服务要快速及时。为了做到及时性，就要精心安排，严格执行检测计划，做好检测过程各项准备工作，使检测工作能高效有序地进行。试样的制备，仪器设备的校准，环境技术条件的监控，人员的培训以及规范操作等都应按照技术规范的要求正常地进行。检测过程不出和少出现差错、误时、仪器设备故障等影响检测顺利进行的现象，以保证检测工作的及时性。 （二）实验室质量管理体系 建立质量管理体系的基本要求包括： 1、明确质量形成过程 实验室是专门从事检验测试工作的实体。实验室工作的最终成果是检测报告。检测报告就是实验室的产品，同样有一个质量形成过程。为了确保检测数据的准确可靠，以确保检测报告的质量，就必须明确它的质量形成过程和过程的各个阶段可能影响检测报告质量的各项因素。从而对这些因素采取相应的措施，加以管理和控制，使其过程处于受控状态，以保证最终产品--检测报告的质量。由于生产组织的性质不同，产品特性不同，实验室的工作任务不同，因而，其质量形成过程也不尽相同。在建立质量管理体系时，应根据本实验室的工作特点，进行分析研究，以明确其质量形成过程及涉及的要素。比较典型的质量形成过程，大体上包括以下各阶段。
分子生物学试验设计
分子生物学
利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法 1 研究背景 烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。 2 材料与方法 2.1 试验材料 试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。 2.2 测定烟碱含量 烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。 2.3 RNA提取 提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。 2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化 取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。 3 预计结果 3.1 烟碱含量的测定 与对照相比打顶后烟碱含量显著上升 3.2 RNA电泳检测 总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。 3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR
医学分子生物学实验技术
1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。 2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA 或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。 3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。 4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。 5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3’末端为游离的-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。 7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。 8、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。 9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。 10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。
1、RT-PCR的基本原理 将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类 基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。 分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳 3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度 （1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。 (2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。
实验室技术规范和操作规程总
实验室技术规范和操作规程总
一、生物安全实验室操作规程 实验室生物安全管理程序 1.目的，有效地针对科室进行全面的生物安全管理，确保工作人员的 安全。 2. 适用范围：适用于科室各专业实验室。 3、职责 3.1、科主任负责任命生物安全小组，指导，规范其工作。 3.2、生物安全小组组长负责安全小组日常工作的安排。 3.3、生物安全小组负责科室安全的具体工作。 4、工作程序 4.1、生物安全小组组成 4.1.1、科主任指定安全小组组长 4.1.2、经年度考核，从科室成员中选拨具有高度责任心和实验室知 识的技术骨干，由科主任命为生物安全小组安全成员。由3人组成。 安全小组成员任期一年，任期中出现特殊情况科主任可对之罢免。 4.2、实验室生物安全的维护和检查 4.2.1、生物安全小组指定针对安全操作和安全装备的检查方案，至
少每年检查一次。 4.2.2、生物安全小组建立安全清单，为回顾性检查提供资料并进行记录，形成《安全记录》。 4.2.3、对危险品、危险区进行鉴定并加以标志。 4.2.4、实验室应按规定及时报告所有的事件和潜在的危险因素。4.2.5、安全小组应定期对工作人员进行安全培训教育，并对各种紧急情况下应急措施进行培训。 4.2.6、若发生职业暴露应及时报告科主任和生物安全小组人员。4.3、警告标记和标签的建立。 4.3.1、对不因危险程度的实验工作区进行标志。 4.3.2、对高度危险性区域要张贴危险公告。 4.3.3、装存危险物质的容器必须贴上标签，其内容应详细。 5、安全操作规程 5.1、临检、生化、免疫、血库等实验室生物安全防护 5.1.1、在实验室工作区禁止吸烟 5.1.2、禁止在实验室放置食物、饮料及类似的存在有潜在的从手
分子生物学 习题6
思考和练习 一、绪论—分子生物学实验的诞生和发展 1.简要概括分子生物学的发展历程。 2.分子生物学实验技术的发展给生命科学带来的影响如何？ 二、分子生物学实验基本知识简介 1.分子生物学实验常用的工具酶有哪些？它们的结构特点、功能及用途是什么？ 2.分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？每种载体在分子生物实验中的功能是什么？ 3.克隆载体和表达载体有何不同点？ 4.如何保证克隆基因的保真性？ 5.如何选择合适的载体？ 6.都有哪些受体细胞？受体细胞的特点什么？ 7.载体和受体（宿主）细胞之间的关系是什么？ 8.如何选择合适的受体细胞？ 9.如何获得和鉴定目的基因？ 10.外源基因导入受体细胞的方法有哪些？各有什么优缺点？ 11.如何筛选重组子？ 三、分子生物学实验室常用仪器设备及其使用 1.分子生物学实验常规仪器都有哪些？它们的适用范围是什么？ 2.离心机在使用时应该注意什么？ 3.除了常规仪器设备外，还有那些仪器设备可用于分子生物学实验？ 四、大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ 2.为什么要设置阴性对照？ 3.如阴性对照中长出菌，原因？ 4.在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是Amps的，原因？ 5.影响转化效率的因素有哪些？ 6.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？ 五、质粒DNA的提取及其定性定量分析 1.如何去除下列物质（蛋白、基因组DNA、RNA、糖类、脂类、小分子物质）？ 2.用什么方法能够定量核酸？ 3.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 4.如何提高核酸电泳的分辨率？ 5.EB染色的特点和注意事项是什么？ 6.核酸分离过程中酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？ 7.在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？ 8.纯化的核酸时如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？ 9.有哪些因素影响核酸的沉淀？