蛋白酶产生菌的分离汇总讲解

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津巴布韦烟叶中淀粉酶和蛋白酶产生菌的分离及鉴定

ｗｒｉｅｔｉｄｙｈｓｏｏｉａａｄｉｃｅｃｌｘｅｍｅｔａｄ６ｒＮＡｓｑｅｃｓｎｌｓｓｅｅｄｎｉｅｂｐｙｉｌｇｃｌｎｂｏｈｍｉａｅｐｒｎｎ１ＳＲｆｉｅｕｎｅａａｙｉ．Ｒｅｕｔ：ｓｌｓＴｅｈ
［键词］津巴布韦烟叶；白酶；粉酶；６ＲＡ；株；离鉴定关蛋淀１ＳｒＮ菌分
［中图分类号］Ｑ３３１９ — ３
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１０．ｏ２２ｌ）４０３－４０９ｏｏ（Ｏ１ — ５６－一００
ＩｏａｏｎｄｎｆｃｔｎｏｒｔａｅａｄＡｍｙａｅＰｒｄｃｎｃｓｌｔｎａｄＩｅｔａｏｆＰｏｅｓｎｉｉｉｉｌｓｏｕｉｇＢａ－ｔｒａＳｒｉｓｆｏｔｅＺｉａｗｅＴｏａｃａｅｅｉｔａｎｒｍｈｍｂｂｂｃｏＬｅｖｓ
５３６
生技术通ＴＥＲ０ＥＣＨＮＯＬＹ …ｏ．２Ｎ．ｕ． — １Ｌ００ＧＶ１ — ４Ｊ — ０ｌ２ … ｏ —１， —１，２Ｌ１ｒＩＢ１ＥＩＳＮＴ０Ｔ
ｄ：０９９．ｎ０９００．１．０２００ｓ
［ｂｔａｔＯｊｃｉｅＴｓｌｅｔｅｐｏｅｓｎｍｌｓｒｄｃｎａｔａｓａｎｒｍＺｍａｗｏａｃＡｓｃ］ｂｅｔ：ｏｉａｈｒｔａｅａｄａｙａｅｐｏｕｉｂｃｅｌｔｉｓｆｉｂｂｅｔｃｏｒｖｏｔｇｉｒｒｏｂ

一株碱性蛋白酶产生菌的分离与应用

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ｗｉｔｉｒｉｈｗｅｈｔｅｗａｆ１，ｗｈｃｓ２ｔｓｉｈｒａｈｅｄｔｒｅｔａｄｗｔｏｅｒｉｓｈｔｈｓｔｎｓｏｄｔａｔＲｉｓｏ８ｓａｈｉｈＷａｉｍｅｈｇｅｔｎｔｅｅｇｎｄｅｉｈｔｒｔｎ．ｈｓｄｈｓａＫｅｒｓｃｍｅｌｐｎｎａｋｌｅｐｏｅｓ；ａｉｕｙｗｏｄ：ａｌａｓｏｉ；ｌａｉｒｔａｅｂｃｌｓｉａｎｌ
ＡｂｔａｔＡＧ十ＵｉｏＢｃｌｓｎｍｅＪ一，ｓｓｌｔｄｆｏｔｅｓｉａｏｍｄａｌｉｍｉｉｈｑａｏ，ｅｙｎＨｕａｒｖｎｅｓｒｃ：Ｓａｆａｉｕ，ａｄＳＰ５ｗａｉｏａｅｒｍｈｏｌｒｔｎｌｌｏｌｌｎＺｅｉｏＴｗｎＬｉａｇ，ｎｎＰｏｉｃ．ｌ
１＿仪器与设备．２１
Ｂ－０Ｃ培养箱，Ｗ－Ｊ１Ｄ超净工作台，２ＭＪ４０ＳＣ．Ｆ７２型分光光度计，ＳＹ１０Ｃ摇床，ＷＳ — 白度仪，Ｋ－１２ＢＬＳ４０均质机，Ｘ —ＩＧ－０ＬＪＩＢ离心机。
１．主要试剂．３１
摘要：从湖南耒阳哲桥镇茶籽油榨油坊内采集土壤样品，分离筛选出能耐受茶皂素并产生碱性洗涤用蛋白酶的菌株。通过对筛选出的菌株进行初步形态鉴定、蛋白酶活力测定和污布去污效果比较，挑选出一株符合要求的菌株，命名为ＳＰ５Ｊ一。该菌株为革兰氏阳性产芽孢杆菌，无荚膜，能耐受茶皂素，产生碱性蛋白酶，其酶活力为１０ＵｍＬ５／，将其添加到清洗剂中并测定去污能力，试验表明：污布去污值Ｒ达到１，是平行菌株去污力的２倍。ｉ８关键词：油茶皂素；碱性蛋白酶；芽孢杆菌

鲈鱼肠道内产蛋白酶菌的分离与筛选

[5] 和豆芽汁酵母培养基。各培养基均用 VNSS 液（九盐溶液）
体重 300 g 左右，试验前放置于水族箱内暂养 7 d，水温 15 益，
配制。
器将灭菌的九盐溶液注入并冲洗 3 次，分别放入玻璃匀浆器中，各加 1 ml 灭菌的九盐溶液后匀浆。依次稀释到 10-1 和
剂法测定其酶活力。先取 0.5 %酪蛋白溶液 1 ml，加不同梯度 pH 值的磷酸盐缓冲液 4 ml，然后加 30 益水浴 5耀10 min，入 1 ml 酶液，保温 15 min，加入 3 ml 10 % 三氯乙酸终止反
分别取 0.1 ml 原液、 10-2， 10-1 和 10-2 稀释液涂布海水琼脂平
++ +
++
黄色 Yellow 黄色 Yellow
土黄色 Khaki
SG21 SG22 对照 Control
小肠 Small intestine 芽孢 Spore
小肠 Small intestine 梭菌 Clostridium
+ ++
深黄色 Dark yellow 浅黄色 Light yellow
培养基生长 Culture Growth medium 小肠 Small intestine 海水琼脂 + Seawater agar 盲囊 Blind sac 海水琼脂 + Seawater agar 分离部分 Isolated part ++ +
凸起白色， White， processes 突起橙黄色， Orange yellow, processes 突起土黄色， Khaki, processes 土黄色 Khaki 黄色 Yellow 黄色 Yellow 黄色 Yellow 黄色 Yellow 黄色 Yellow 土黄色 Khaki 土黄色 Khaki 黄色 Yellow 黄色 Yellow

胃蛋白酶生产工艺

胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。

胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。

以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。

首先，选择合适的菌种进行培养。

常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。

菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。

然后，进行菌种的发酵过程。

将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。

发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。

接着，进行胃蛋白酶的提取。

发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。

胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。

最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。

采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。

纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。

在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。

2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。

3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。

4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。

综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。

通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。

米曲霉蛋白酶菌株分离[1]

酱油曲中米曲霉蛋白酶菌株的分离及初步鉴定实验原理米曲霉是一种好氧微生物，具有很强的蛋白质的能力，米曲霉系对原料成分分解的能力取决于这类酶的活性。

酱油酿造过程就是利用曲培养米曲霉，使其大量繁殖，分泌多种酶，其中最主要的是蛋白酶。

米曲霉具有酶系丰富,产蛋白酶的酶活高,生长快,适应能力强,不产毒素等特点,因而广泛用于酱油生产中以形成独特的色,香,味,体。

所以酱油曲中有大量米曲霉，可从酱油中筛选出目的米曲霉。

米曲霉菌落生长快，10d直径达5~6cm,质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。

背面无色。

分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。

分生孢子梗2mm左右。

近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。

顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50 μm。

小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。

分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，老后大多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。

米曲霉产生的蛋白酶会分解酪蛋白。

由于酪蛋白在培养基中呈浑浊状，在培养基中将会在形成一圈透明光圈，得到产蛋白酶的菌株。

测定透明圈及菌落直径大小，根据HC（HC=透明圈直径/菌落直径）大小，筛选出高产蛋白酶的菌株。

实验器材酱油曲曲药5g 无菌水、无菌培养皿、无菌移液管、无菌试管、三角瓶等乳酸石碳酸棉兰染色液接种针、涂布波棒、酒精灯、擦镜纸、载玻片、盖玻片、显微镜酪蛋白培养基:Na2HPO4·12H2O 1.07 g,干酪素4 g,KH2PO43 g,葡萄糖20g、琼脂20 g,自然PH，加热溶解再用蒸馏水定容到1000 mL, 121℃灭菌20 min。

实验步骤1.配制酪蛋白培养基，灭菌，倒平板备用（七个平板）：将50℃左右的灭菌酪蛋白培养基倒入无菌培养皿中（制备七只平板），平置，凝固后，分别编号为空白（一只），10（-7）10（-8）、10（-9）分别两皿。

2.稀释样品：将酱油曲曲药用无菌水45 ml制成均匀浊液，取9只加有无菌水的试管（每管9ml）, 依次编号10（-1）、10（-2）、…10（-8）、10（-9），用2ml无菌移液管取浑浊菌液1ml加进10(-1)的试管中混匀。

实验报告二产酶微生物的分离、纯化与选育

产酶微生物的分离、纯化与选育实验目的1、学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化；2、通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法；实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。

也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

基因突变可分为自发突变和诱发突变。

许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。

紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。

它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。

紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。

因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。

试剂距离地面十公分的土壤、酪素培养基实验器材恒温培养箱、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿×8、试管×11、玻璃棒、移液管、量筒、三角瓶、烧杯、滴管、涂布器、血细胞计数板、移液枪、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等实验方法与步骤1、酪素培养基的配置：牛肉膏3g、NaCl 5g，酪素 10g，琼脂 20g，水1000mL， pH 7.6-8.0。

配制方法：称取酪素4g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至1000mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。

2、菌悬液的制备取土壤20g，加水200ml，即梯度为10ˉ1的菌悬液，取1ml10ˉ1的菌悬液，加9ml的蒸馏水，即梯度为10ˉ2的菌悬液，按上述的方法步骤制作梯度为10ˉ3、10ˉ4、10ˉ5的菌悬液。

蛋白酶提取、活力测定实验总结

发酵实验总结生物技术1002 1610100311 刘小波摘要：1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。

2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。

3、实验结果：实验原理：1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。

2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。

在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。

实验材料：玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。

实验方法：蛋白酶的筛选：1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。

碱性蛋白酶菌株的分离鉴定

碱性蛋白酶菌株的分离鉴定产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。

本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。

关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing StrainsWensi Hou(Yanshan university , Liren college , Hebei 066004)Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect.Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification 1．碱性蛋白酶1.1简介碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。

微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选

微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。

由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。

尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。

因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。

材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。

采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。

取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。

后选取筛选菌落接种于琼脂板上。

菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。

然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。

菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。

在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。

选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。

菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。

结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。

本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

ＳｃｕｎｉｈａＡｇｉｕｔｒｌｒｃｌａＵｎｖｒｉ．Ｒｅａｉｅｘｅｉｎｓｂｕｉｍｏｐｏｏｉａ，ｐｙｉｌｇｃｌａｄｉｃｅｃｌｕｉｅｓｔｙｌｔｅｐｒｍｅｔａｏｔｔｖｓｒｈｌｇｃｌｈｓｏｏｉａｎｂｏｈｍｉａ
ｃａａｔｒｔｓａｄ１ＳＤＮＡｒｏｄｃｅ．ｓｌｈｗｅｔｐｓｅｓｄｔｐｃｌｃａａｔｒａｉｎｆＢａｉｕｕｔｉ．ｈｃｅｉｉｒｒｓｃｎ６ｗｅｅｃｎｕｔｄＲｅｕｔｓｏｄｉｏｓｓｅｉａｈｃｅｉｔｓｏｃｌｓｓｂｉｓｓｙｒｚｏｌｌＴｈｒｆｒ．ｉｗａｄｎｉｅｃｌｓｓｂｉｓａｄｎｍｅｃｆｓｂｉｓＢ一．ｔｒｒｄ，ｈｕｌｏｉｅｓｑｅｃｆｅｅｏｅｔｓｉｅｔｄａＢａｉｕｕｔｉｎａｄＢａｉｕｔｉｉｆｓｌｌ？ｌ３Ａｆｗａｓｔｅｎｃｅｔｅｕｎｅｏｅｄ
ａｉｎｅｔｆｅＣｈｗｅｈｅＯ％ｓｍｉｒｔｅｋｒｇｎｏＢｃｌｓｓｂｉｓｓａｎＹＹＷ－ｕｍｉｅｌｍｎｋｒｓｏｄｉｓａｄａ１０ｇｏｔｒｉｌｉｗｉｔｅＣｅｅｆｍａｉｕｕｔｉｔｉａｔｙｈｈｒｌｌｒ１ｓｂｔｄｔ
ＡｂｔａｔＡｅｔｅ－ｅｒｄｎａｔｒｕｗａｓｌｔｄｆｏａｓｍｐｅｏｉｃｄｄｆａｈｒｉｈｈｃｅａｍｌｄｏｓｒｃ：ｆａｈｒｄｇａｉｇｂｃｅｉｍｓｉｏａｅｒｍａｌｆｄｓａｅｅｔｅｎｔｅｃｉｋｎｆｒａｆｒｎ

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蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。

本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。

也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。

本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。

通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。

1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。

2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。

2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

7．制作平板将灭菌后的培养基冷凝至55~60℃,放在超净台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，以铺满皿底为度。

8．无菌检查待培养基凝固后，5个培养皿一叠，倒置平放在恒温培养箱中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

2.2蛋白酶产生菌的分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

2.3 蛋白酶产生菌的筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。

2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。

2.4蛋白酶产生菌的选育2.4.1 紫外线对出发菌株的诱变效应1）菌悬液的制备：①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

②将上述菌液离心（3000 r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。

③用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。

3）紫外线处理：①将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。

②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。

③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。

盖上皿盖，关闭紫外灯。

4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

8）观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。

与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。

并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。

此斜面可作复筛用。

2.5蛋白酶产生菌的发酵与酶活力测定 2.5.1蛋白酶产生菌的发酵（1）将保藏培养基中的产蛋白酶芽孢杆菌接种两环到种子培养液中，30-32 ℃摇床发酵培养16h,4℃冰箱保存。

（2）取10ml含产蛋白酶芽孢杆菌的种子培养液接入含100ml酪素液体发酵培养基的250ml 三角瓶中，30-32 ℃摇床发酵培养，作为样一。

（3）样一培养12h后，再取10ml含产蛋白酶芽孢杆菌的种子培养液接入含100ml酪素液体发酵培养基的250ml三角瓶中，30-32 ℃摇床发酵培养，作为样二。

（4）在发酵培养的48h内，每3h取一次样，每次取5ml,放入10ml的离心管中，于4℃冰箱冷藏。

（5）48h后将所有取样3000rpm离心10min，离心所得上清液680nm进行酶活力测定，每管沉淀加5ml蒸馏水600nm测生长曲线。

2.5.2试剂和溶液 2.5.2.1 福林试剂2.5.2.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g ，用水溶解并定容至1000mL.2.5.2.3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g ,用水溶解并定容至1000mL。

2.5.2.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按 GB601配制。

2.5.2.5 盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0.lmol/L 按 GB601配制。

2.5.2.6 缓冲溶液a 磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5g ，加水溶解并定容至I000mL2.5.2.7 10g/L酪素溶液称取酪素 1.000g，精确至0.00lg，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

2.5.2.8 l00µg/mL L-酪氨酸标准溶液a. 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.10 00g，精确至0.0002g，用lmol/L盐酸60mL 溶解后定容至l00mL，即为lmg/mL酪氨酸标准溶液。

b. 吸取lmg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到l00µg/mLL 一酩氨酸标准溶液。

2.5.3分析步骤2.5.3.1 L-酪氨酸标准曲线的绘制 a. L-酪氨酸标准溶液的配制：管号酪氨酸标准溶液的浓度µg/ml取100µg/mlL-酪氨酸标准溶液的体积取水的体积ml0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5b. 分别取上述落液各1.00mL(做平行试验)，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00mL,福林试剂使用溶液 1.00mL，置于40℃士0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。

以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。

根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(µg)，即为吸光常数K值。

2.5.4酶活力的测定a. 先将酪素溶液放人40'C士2'C恒温水浴中，预热5minb. 按下列程序操作:步骤试管A(空白) 试管B(酶试样，做3个平行试样)1 加酶液1.00ml（离心上清液）加酶液1.00ml（离心上清液）2 40℃±0.2℃,水浴2min 40℃±0.2℃,水浴2min3 加三氯乙酸2.00ml(摇匀) 加酪素1.00ml(摇匀)4 40℃±0.2℃,10min 40℃±0.2℃,10min5 加酪素1.00ml(摇匀) 加三氯乙酸2.00ml(摇匀)6 取出静止10min,过滤取出静止10min,过滤7 取1.00ml滤液取1.00ml滤液8 加碳酸钠溶液5.0ml 加碳酸钠溶液5.0ml9 加福林试剂使用液1.00ml 加福林试剂使用液1.00ml10 40℃±0.2℃,显色20min 40℃±0.2℃,显色20min11 于680nm波长测其吸光度于680nm波长测其吸光度2.5.4.2计算X=A*K*4/10*n=2/5*A*K*n 式中:X一一样品的醉活力，u/g(u/mL)tA一一样品平行试验的平均吸光度;K—一吸光常数;4—一反应试剂的总体积,mL10一一反应时间10min，以lmin计;n一一稀释倍数。

所得结果表示至整数。

2.6 培养基优化（正交实验）正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。

它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。

正交试验设计的基本特点是：用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。

正因为正交试验是用部分试验来代替全面试验的，它不可能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析；当交互作用存在时，有可能出现交互作用的混杂。

虽然正交试验设计有上述不足，但它能通过部分试验找到最优水平组合，因而很受实际工作者青睐。