检验科微生物室多重耐药的检测及分析
多重耐药菌鉴别与分析
多重耐药菌鉴别与分析实验室鉴别主要包括菌落形态观察、生物化学试验和分子生物学检测等。
菌落形态观察是最基本的鉴别方法之一、不同细菌菌种在琼脂平板上形成的菌落具有特定的形态，如形状、颜色、边缘等。
结合常见多重耐药菌的菌落形态特点，可以初步判断是否为多重耐药菌。
生物化学试验可以进一步确定细菌的种属和耐药性。
常用的生物化学试验包括氧气要求性试验、碳水化合物代谢试验、氧化酶试验等。
通过这些试验，可以对菌株的代谢特点进行分析，从而判断是否为多重耐药菌。
分子生物学检测是一种快速、准确、灵敏的多重耐药菌鉴别方法。
其中，PCR（聚合酶链式反应）是最常用的方法之一、PCR可以扩增细菌的DNA片段，并通过特异性引物和探针检测耐药基因的存在。
此外，核酸杂交、DNA芯片和基因测序等技术也可以用于多重耐药菌的检测与鉴定。
临床分析主要包括病原菌的分离培养、抗生素敏感试验和耐药机制分析等。
病原菌的分离培养是临床分析的第一步。
通过病人患处的标本（如血、尿、脑脊液等）进行分离培养，获取纯种菌株。
然后，对纯种菌株进行形态观察和生物化学试验，初步判断是否为多重耐药菌。
抗生素敏感试验是评价细菌对抗生素的耐药性的关键方法之一、常用的方法包括纸片扩散法和微量稀释法。
通过测定菌株的最低抑菌浓度或纸片对菌株的抑菌圈直径，可以判断细菌对抗生素的敏感性，并进一步确定其耐药性。
耐药机制分析是评价多重耐药菌的发展与传播的重要手段。
通过检测菌株中的耐药基因、检查耐药基因的编码区域及其功能，可以揭示多重耐药菌形成与扩散的机制。
此外，研究菌株的群体基因组学和质粒组学，还可以了解多重耐药菌的潜在传播途径及传播速度。
综上所述，多重耐药菌的鉴别与分析是一项复杂而重要的工作。
实验室鉴别和临床分析相结合，有助于准确、及时地识别多重耐药菌，为临床治疗提供有效的指导，降低多重耐药菌传播风险，保障公共卫生安全。
临床微生物室多重耐药菌的监测与防控
三、多重耐药菌监测及预警机制 多重耐药菌监测及预警机制
（一）多重耐药菌医院感染管理 ： 1.重点部门： 重症监护病房（ICU）、新生儿室、血液科病 房、呼吸科病房、神经科病房、烧伤病房等重 点部门以及长期收治在ICU的患者，或接受过 广谱抗菌药物治疗或抗菌药物治疗效果不佳的 患者，留置各种管道以及合并慢性基础疾病的 患者等重点人群。
（三）耐药机制的表型检测 医院内感染菌常常是一些耐药菌，实验室应对这些 细菌的耐药表型进行检测。超广谱β内酰胺酶（ ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽 类抗生素的肠球菌（VRE）。
（四）分子生物学监测
医院内感染的暴发流行多数情况下均由来自同一传染 源的单一菌株所引起，感染控制程序通常要求实验室 提供证据说明感染菌株之间的基因关系。流行菌种的 鉴定、生化特征、耐药谱虽然提供感染的有力证据， 但在种内株间的区别方面能力有限，因此需要分子生 物学分型。
3、多态DNA的随机放大(random amplification of polymorphic DNA,RAPD) 多态DNA的随机放大又称随机引物PCR，在菌株的 DNA提取物中加入约10碱基的随机引物，进行PCR 扩增，然后将PCR产物进行电泳和溴乙啶染色，分 析染色图谱可用于菌株的鉴别。
4、脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE） 将菌体包埋于琼脂中，先后用酶破坏细胞壁和分解 蛋白质，以切点较少的内切酶剪切细菌的DNA，以 随时变更电场方向的电泳装置对大片段DNA进行电 泳，根据电泳图谱对菌株进行识别。
3.诊疗活动： 应当将高度疑似或确诊多重耐药菌感染患者 或定植患者安排在最后进行。接触多重耐药 菌感染患者或定植患者的伤口、溃烂面、粘 膜、血液、体液、引流液、分泌物、排泄物 时，应当戴手套，必要时穿隔离衣，完成诊 疗护理操作后，要及时脱去手套和隔离衣， 并进行手卫生。
医院多重耐药菌感染的监测及分析
医院多重耐药菌感染的监测及分析首先，医院应建立一套完善的监测系统来追踪和记录多重耐药菌感染。
这可以包括对患者进行定期的耐药菌检测，将检测结果与医院感染控制委员会进行共享。
此外，医院还应监测多重耐药菌的类型和分布情况，以便了解哪些病房和科室容易发生多重耐药菌感染。
在对多重耐药菌感染进行分析时，医院可以从以下几个方面进行考虑：首先，医院可以分析患者的临床数据和感染病例的特征。
通过对多重耐药菌感染患者的病程、症状和治疗历史等进行分析，可以确定患者的风险因素和易感因素。
这有助于指导医生在诊断和治疗过程中的决策，并预测可能的并发症和治疗效果。
其次，医院可以分析抗生素的使用情况和耐药性发展趋势。
通过检查医院抗菌药物的使用率、使用频率和使用模式，可以了解抗生素在医院中的滥用情况以及多重耐药菌产生的原因。
此外，还可以对多重耐药菌的传播途径和扩散方式进行分析，以防止和控制感染的传播。
最后，医院可以对抗生素的使用政策和感染控制措施进行评估。
通过对医院内部感染控制政策和措施的分析，可以确定哪些政策和措施对控制多重耐药菌感染起到了积极的作用，哪些需要进行改进。
这有助于提高医院的感染控制水平，防止多重耐药菌感染的发生。
综上所述，监测和分析医院多重耐药菌感染是一个复杂而重要的工作。
仅仅依靠单一的监测手段是不够的，需要综合运用临床数据分析、抗生素使用分析和感染控制政策评估等方法来全面了解和控制多重耐药菌感染的发生和传播。
只有持续地加强监测和分析，才能有效防控医院多重耐药菌感染的风险，保障患者的安全和健康。
多重耐药菌-检验与解读
2013年《整治方案》
❖ 明确规定标本送检率 ❖ 住院病人抗生素使用前微生物检验样本送检率不低于30% ❖ 接受限制性使用级药物治疗的住院患者，使用药物之前送检
率不低于50% ❖ 接受特殊使用级药物治疗的住院患者，使用药物前送检率不
低于80%
2013年卫计委《抗菌药物专项整治方案》
❖ 提高标本质量，提高血液和无菌部位标本送 检比例
曼不动杆菌
米诺环素
可选择相对敏感药物 联合用药
替加环素体外有抗菌 活性
微生物报告解读
有效利用病原菌及耐药监测信息
❖ 误区
❖ 标本检出细菌一定要用药
❖ 应走出误区
❖ 区别细菌感染、定植、污染
❖
困惑？
定植
❖ 定义：微生物在人体体内一定生境或解剖位 置落脚或存活但并不引起疾病的状态
感染
❖ 定义一：病原菌进入人体增殖并与机体相互斗争（作用）的 过程。
头孢吡肟、头孢噻 厄他培南 利
亚胺培南／西司他汀、 美罗培南、帕尼培南 ／倍他米隆治疗有效： 体外敏感的环丙沙星、 头孢他啶、头孢吡肟 可能有效
亚胺培南／西司他汀、 美罗培南、帕尼培南 ／倍他米隆治疗有效
产碳青霉烯酶肠杆菌 粘菌素、多粘菌素B、替加环素 科细菌（包括产 NDM-1的细菌
碳青霉烯类耐药的鲍 粘菌素、多粘菌素B、替加环素
一、产超广谱β-内酰胺酶的细菌(ESBL)
❖ 产超广谱β-内酰胺酶 ❖ 从简单的β-内酰胺酶演变而来 ❖ TEM-1,2； SHV-1
广谱酶，导致大肠埃希菌和克雷伯菌对氨苄西林，头孢唑林和哌拉西林耐药 ❖ ESBLs
超广谱－内酰胺酶，由TEM-1，2 和 SHV-1突变而来，可同时水解青霉素 类、头孢菌素类以及单环类的氨曲南。在以往的报告中如果ESBL阳性，我 们会报告该菌株对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南耐药。2010年1月CLSI （美国临床和实验室标准协会，是美国国家标准协会最早认定的标准制定 机构，其制定的微生物临床检验标准及操作规范被视为相关检验领域的金 标准）修订了头孢菌素和氨曲南的解释标准后对ESBL不再作常规报告，但 ESBL检测可能对流行病学调查或感染控制是有益的。一些菌株随着三代头 孢菌素治疗时间的延长可发展为耐药菌株。
多重耐药菌感染的监测分析与防控措施
多重耐药菌感染的监测分析与防控措施随着抗生素的广泛应用，多重耐药菌感染已经成为当今世界范围内的一大公共卫生问题。
多重耐药菌对抗生素的耐药性使得医治感染变得更加困难，严重危害患者的生命安全。
及时的监测分析和有效的防控措施显得尤为重要。
一、多重耐药菌的定义和分类多重耐药菌是指对两种或两种以上的抗菌素具有耐药性的细菌。
按照其抗药谱的扩展程度，多重耐药菌可以分为三种类型：Ⅰ型多重耐药菌（MDR，Multidrug Resistant），即对至少一种抗生素耐药；Ⅱ型多重耐药菌（XDR，Extensively Drug-Resistant），即对多种抗生素耐药；Ⅲ型多重耐药菌（PDR，Pandrug-Resistant），即对所有已知抗生素耐药。
二、多重耐药菌感染监测分析1. 监测对象多重耐药菌感染的监测对象主要包括医院内的患者、医护人员和医疗设施，以及社区环境中的相关标本等。
2. 监测内容（1）多重耐药菌感染的发病情况：对医院内患者发生的多重耐药菌感染进行统计，包括感染类型、部位、病原菌、感染情况等。
（2）多重耐药菌的耐药谱分析：对多重耐药菌的耐药谱进行分析，了解其对各类抗生素的耐药情况，以指导临床用药。
（3）多重耐药菌的传播途径和机制：研究多重耐药菌的传播途径和机制，了解其在医疗环境和社区环境中的传播规律，为制定有效的防控策略提供依据。
3. 监测方法（1）临床标本检验：对临床患者的分泌物、组织等标本进行菌落计数和耐药菌分离鉴定。
（2）分子生物学检测：利用分子生物学技术对多重耐药菌进行分子水平的检测和分析，包括耐药基因检测、耐药菌分子分型等。
（3）环境监测：对医疗机构的医疗设施、空气、水等环境进行定期的监测，了解多重耐药菌的分布情况。
三、多重耐药菌感染的防控措施1. 加强感染控制措施（1）强化手卫生：医护人员和患者必须严格遵守手卫生的规范，避免交叉感染。
（2）严格执行无菌操作：手术室、医疗器械等环境必须保持无菌，避免手术感染。
医院多重耐药菌感染的监测及分析
医院多重耐药菌感染的监测及分析目的：了解医院多重耐药菌的分布情况，为临床治疗和合理制定医院感染控制措施提供依据。
方法：使用DL-96朱海迪尔全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏试验，对分离到多药耐药菌的分布进行调查分析。
结果：共分离出病原菌1726株，多重耐药菌643株，占37.52%；643株多重耐药菌中革兰阳性球菌占17.41%，革兰阴性杆菌占82.58%；前3位分别是大肠埃希菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和鲍氏不动杆菌；主要分布在ICU、干二和呼吸内科，分别为16.79%、15.52%和11.19%；发生医院感染的部位主要是呼吸道和泌尿道。
结论：临床应合理应用抗菌药物，加强对老年及危重患者多重耐药菌的监测与控制，特别要关注泛耐药的产生与流行。
近年来多重耐药菌在医院的广泛流行已经引起越来越多人们的关注，医院多重耐药菌感染已成为世界范围的威胁[1]。
为了更好的控制和减少多重耐药菌在医院内的传播，提高广大临床医务人员对多重耐药菌的重视，从而更好的控制医院多重耐药菌感染的发生，现对2010年10月-2011年10月笔者所在医医院各科室多重耐药菌的分布情况进行回顾性分析，并报道如下。
1 资料与方法1.1 菌株来源2010年10月-2011年10月从笔者所在医院住院患者各种临床标本中分离到的多药耐药菌(MDRO)，共643株。
1.2 方法医院感染管理科专职人员每天到检验科收集并整理细菌耐药检验报告单，剔去同一患者相同标本的重复菌株，对监测出的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产ESBLs大肠埃希菌、产ESBLs肺炎克雷伯菌、泛耐药鲍氏不动杆菌和泛耐药铜绿假单胞菌进行统计分析。
2 结果2.1 标本分布1726株多药耐药菌的标本中，来自痰标本占64.5%、尿标本占18.6%、脓标本及分泌物占10.2%、脑脊液标本占1.5%、血标本占1.3%、其他占3.9%。
2.2 病原菌分离率全院共分离病原菌1726株，其中多药耐药菌643株，占37.25%。
季度多重耐药菌监测分析
2020年第二季度多重耐药菌监测分析为确保我院临床抗菌药物合理使用，减少或减缓耐药菌株的产生，根据《卫生部办公厅关于抗菌药物临床应用管理有关问题的通知》（卫办医政发﹛2009﹜38号）、《抗菌药物临床应用指导原则》《医院感染监测规范》等规定和要求，院感科对2020年第二季度微生物送检标本及药敏结果进行了分析总结，供各临床科室参考，并请按相关规范正确选择、使用抗菌药物。
一、病原菌种类2020年第二季度我院送检微生物学培养共2349例，检出菌株634株，检出率27.0%，多重耐药菌检出403例，多重耐药率63.6%。
（2020年第一季度我院送检微生物学培养共2017例，检出菌株551株，检出率27.3%，多重耐药菌检出324例，多重耐药率58.8%。
）多重耐药率较上一季度上升约4.8%。
二、病原菌分布情况：第二季度全院送检标本中检出革兰氏阳性菌187株，多重耐药菌98株，多耐率52.4%；检出革兰氏阴性菌405株，革兰氏阴性耐药菌299株，多耐率73.8%。
表1—2020年第二季度革兰氏阳性菌检出情况病原体检出细菌数所占比例金黄色葡萄球菌46 24.6%溶血葡萄球菌43 23.0%屎肠球菌25 13.4%粪肠球菌14 7.5%表皮葡萄球菌13 7.0%其他棒状杆菌12 6.4%其他葡萄球菌3418.2%合计187 100.0%图1—2020年第二季度革兰阳性菌构成表2—2020年第二季度革兰氏阴性菌检出情况病原体 检出细菌数所占比例 铜绿假单胞菌 11528.4% 肺炎克雷伯菌 111 27.4% 大肠埃希菌 93 23.0% 鲍曼不动杆菌 52 12.8% 其他阴性菌 34 8.4% 合计405100.0%图2—2020年第二季度革兰阴性菌构成三、送检标本检出菌情况：临床送检标本共2349例，检出菌634例，检出率27.0%，多耐数403例，多耐率63.6%，具体情况，见表3.表3—2020年第二季度各标本检出菌情况标本送检数检出数检出率(%) 多耐数多耐率(%)痰37028075.6817963.93血14061148.117969.3尿20311657.17662.5分泌物634063.52460导管尖端401025990其他2677427.73678.6合计234963426.9940363.56四、科室多重耐药菌感染情况：多重耐药菌感染前6名依次是：ICU128例，呼吸内科一14例，创面修复5例，神经外科一、神经外科二、神经外科三各4例。
多重耐药菌的实验室检测
多重耐药菌的实验室检测近年来，国际上陆续报道“超级细菌”引起感染病例报道引发公众的极度关注，多重耐药菌也成为医院感染重要的病原菌。
为此，卫生部发布《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南（试行）》，指导医疗机构通过强化多种耐药菌医院感染的管理，做好多重耐药菌所致感染的预防和控制。
《指南》要求医务人员合理使用抗菌药物，避免因药物使用不当导致细菌耐药的发生。
要求临床微生物实验室至少每半年向全院公布一次临床常见分离细菌菌株及其药敏情况，定期向临床医师提供最新的抗菌药物敏感性总结报告和趋势分析，提高临床抗菌药物处方水平。
多重耐药菌（Multidrug-Resistant Organism,MDRO）,主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌。
常见多重耐药菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）细菌、耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌（CRE）（如产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶[NDM-1]或产碳青霉烯酶[KPC]的肠杆菌科细菌等）、耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CR-AB）、多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌（MDR/PDR-PA）和多重耐药结核分枝杆菌。
临床微生物实验室耐药菌的监测工作，是多重耐药菌感染预防与控制工作的前提，因此，临床微生物室必须做好多重耐药菌检测试验的标准化工作，为临床多重耐药菌感染预防与控制提供准确的依据。
现将2010年CLSI标准中有关MRSA、VRE、ESBLs、肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的检测标准发给各临床微生物实验室，仅供参考。
产NDM－1细菌的实验室诊断包括筛查、表型确认和基因确证三个步骤。
（一）表型筛查。
在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法（K－B法）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查，如果达到以下标准，需要进行性表型确认。
厄他培南特异性较低，不推荐用于筛查试验。
检验科微生物室多重耐药的检测及分析
检验科微生物室多重耐药的检测及分析随着抗生素的广泛使用和滥用，多重耐药菌的出现已成为医疗界面临的重要难题。
为了有效地控制和预防多重耐药菌的传播，及时发现和识别这些菌株至关重要。
因此，涉及该领域的微生物检测成为了检验科中的重要一环。
多重耐药菌的检测方法通常包含两个主要步骤：细菌培养和药敏试验，这对于临床检验科来说是一个老生常谈的话题。
另外，使用分子生物学技术，如PCR方法可以快速、精准地检测出菌株中存在哪些基因。
在实际应用中，涂片法是最基本的方法之一，常用于血液、尿液等样本中微生物的检测。
此外，还可以采用涂布培养法、PCR法、质谱法等技术进行多重耐药菌的检测。
在多重耐药菌的药物治疗方面，通常采用联合用药是较为有效的方法。
对于单个抗生素的耐药菌，可根据药敏试验结果，选用敏感的抗生素进行治疗。
但在临床实践中，对于多重耐药的菌株，往往要使用多种抗生素进行联合治疗。
维持合理的抗菌药物使用，合理使用联合用药，严格控制抗生素的使用范围、剂量和时限，以及加强环境卫生和个人卫生的管理，这些都是有效地防控多重耐药菌传播的关键。
中华医学会感染病学分会建议：在医疗机构，尤其是重症监护室等高风险科室设立感控小组，制定科室感控策略和标准操作规程，建立多重耐药菌感染预防和控制长效机制等防范措施。
总之，检验科微生物室在多重耐药菌的检测及分析方面发挥着重要作用。
只有加强经验积累，不断学习并更新技术、完善分子生物学等微生物学技术手段，才能提高多重耐药菌的检测率和灵敏度，更好地开展细菌培养和药敏试验，并做好多重耐药菌检测相关数据的统计和分析，为临床治疗和防控工作提供更加实用、可靠的数据支持，更好地服务于人民健康。
检验科微生物室多重耐药菌的检测及分析
检验科微生物室多重耐药菌的检测及分析多重耐药菌（MDR）是指对两种或两种以上药物产生耐药性的细菌，它们在诊疗和预防感染疾病方面对细菌药物治疗提出了很大的挑战。
目前，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌在内的多种MDR菌株已经被分离出来，这些菌株的检测和分析具有重要的临床意义。
一、分离MDR菌株分离MDR菌株是检测和分析MDR的第一步。
在临床样本（如血液、尿液、呼吸道分泌物）中，通过涂布法、培养法等方法将细菌分离出来。
分离后，对细菌进行鉴定，确定其种类和药敏性，确认是否为MDR菌株。
二、对MDR菌株进行药敏试验药敏试验是检测MDR的重要手段。
目前常用的药敏试验方法有纸片扩散法和肉汤微量稀释法。
纸片扩散法：将含有不同抗生素的纸片排列成一排，将待测菌株培养在厚度均匀的琼脂上，然后将含有纸片的培养基倒到琼脂上，在便携培养箱中培养，观察纸片周围是否有抑菌圈，根据圈直径的大小确定其对不同抗生素的敏感性。
肉汤微量稀释法：在96孔板中，每孔加入不同浓度的抗生素，然后将待测菌株接种在每个孔中，然后放入培养箱中培养，根据细菌生长的情况确定其对不同抗生素的敏感性。
三、对MDR菌株进行分子生物学鉴定对MDR菌株进行分子生物学鉴定是确定菌株的基因型和耐药基因的状态。
这可以通过聚合酶链反应（PCR）和基因测序等方法实现。
其中的主要步骤包括：1. 提取MDR菌株的DNA，可以采用酚-氯仿法或商业酶解试剂盒。
2. 制备PCR反应体系，包括模板DNA、引物、酶、缓冲液和水。
引物的设计可以根据目标基因序列设计，或者用商业引物。
3. 进行PCR反应，按照反应条件和程序进行PCR扩增。
4. 洗脱PCR产物样品后，进行DNA测序。
可以使用Sanger测序技术或者下一代测序技术，如MiSeq或Ion Torrent。
5. 对产生的测序数据进行分析，使用基因测序软件（如Geneious或CLC Workbench）对序列进行拼接、比对和注释。
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检验科微生物室多重耐药的检测及分析
近年来，随着多种抗生素大规模的应用，导致了耐药菌的不断出现，而且不断发展着，已成为全球医学界普遍关注的问题。
因此，如何预防和控制多重耐药菌病菌的传播，已成
为医学领域中的一项重要任务。
近年来，微生物检验技术的快速发展促进了人们对耐药性
的认识和对治疗和预防控制的掌握，为临床治疗和预防控制提供了可靠的技术保障。
本文
将介绍检验科微生物室中多重耐药检测的方法及分析。
1. 材料及方法
1.1 检测菌株的分离
从临床标本或环境中分离出疑似多重耐药菌株，进行纯化和鉴定。
对于分离的耐药菌株，应先进行基本的细菌学鉴定，并进行生化特性分析和16S rRNA序列分析，确定其物种和属于哪一类菌群。
1.2 药敏试验
使用不同规格的纸片法、药敏仪法和MIC测定法进行多重耐药菌的药敏试验，检测菌
株的耐药性状况并获取药物敏感性结果。
1.3 分子生物学检测方法
使用PCR技术检测耐药菌株中的ARGs和MGEs基因，如ESBLs、AmpC β-lactamases 等，确定耐药机制，从而进行群体分析和传播链的剖析。
2. 结果及分析
通过对多重耐药菌的核酸提取、PCR扩增和限制性酶切鉴定，确定该细菌菌株为耐药菌。
对于分离的耐药菌株，应对其物种和属于哪一类菌群进行细菌学鉴定。
可通过荧光PCR、MALDI-TOF质谱技术和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定。
选择适当的药敏试验方法，如文盘扩散或E-test, 对菌株药敏性进行检测。
根据CLSI 或EUCAST指南，对菌株药物敏感性进行分析，并根据敏感性、中介敏感和耐药性各项指标，确定菌株的药物敏感性结果。
同时，对临床上经常使用的药物进行监测，从而为合理使用
提供参考。
使用PCR技术鉴定菌株中ARGs和MGEs等相关基因，如ESBLs、AmpC β-lactamases 等，对于菌株的耐药机制进行确定化。
可采用RPA、LAMP和数字PCR等方法，对于ARGs和MGEs基因进行快速检测。
另外，还可通过PFGE、MLST、WGS等技术，形成菌株的DNA指纹图，促进耐药菌株的研究和数据的共享。
3. 结论。