乳酸脱氢酶酶活力测定

实验六乳酸脱氢酶酶活力测定

及紫外吸收法测定蛋白质含量

目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理；

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为

简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。

试剂和器材

一、试剂

50m mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：

A: 50 m mol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200ml。

B: 50 m mol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500ml。

取溶液A 31.5ml ＋溶液B 68.5ml, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。

10m mol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。

0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1ml 摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29ml, 使其完全溶解。现用现配试剂。

二、材料

动物肌肉、肝、心、肾等组织。

三、器材

组织捣碎机，紫外分光光度计，恒温水浴，移液管(5ml, 0.1ml), 微量注射器（10ul）。

操作方法

一、制备肌肉匀浆

称取20g 兔肉, 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L Ph6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。

二、LDH活力测定

试验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10μl，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A340nm，连续测定3min，以A 对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340nm/min减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制A340nm/min下降值在0.1－0.2之间。

三、数据处理

计算每毫升组织提取液中LDH活力单位

LDH活力单位（U）/ml 提取液＝（A340nm/min⨯稀释倍数）/

（酶液加入量（10μl）⨯10-1

提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml ⨯总体积

注意事项

（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。

（2）酶液的稀释度及加入量应控制A340nm/min下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。（3）NADH溶液应在临用前配制。

思考题：

1. 简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。

实验之二：紫外吸收法测定蛋白质含量

实验原理

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

一、试剂：

[1] 标准蛋白质溶液：任选一种。

（1）牛血清清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配制成浓度为1毫克/毫升（mg/mL）的溶液。

（2）卵清蛋白质溶液：将约1克卵清溶于100毫升0.9%氯化钠溶液中，离心，取上清液，按微量凯氏定氮法测其蛋白质含量，用0.9%氯化钠溶液稀释至蛋白浓度为1毫克/毫升。

[2] 待测蛋白质溶液：浓度为1毫克/毫升左右的溶液。

二、器材：

[1] 紫外分光光度计[2] 吸量管[3] 试管和试管架

操作方法

下面介绍四种紫外吸收法：

1. 280nm的光吸收法

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶