荧光抗体技术_百替生物
组织荧光免疫tba检测原理
组织荧光免疫tba检测原理摘要：一、荧光免疫TBA 检测简介1.荧光免疫TBA 检测的基本原理2.荧光免疫TBA 检测的主要步骤二、荧光免疫TBA 检测原理详解1.样本处理2.荧光抗体结合3.荧光信号的检测与分析三、荧光免疫TBA 检测的优势与应用1.相较于传统免疫组化技术的优势2.在生物医学领域的应用3.在疾病诊断与研究中的应用四、荧光免疫TBA 检测的发展前景1.技术改进和创新2.在更多领域的应用拓展3.对未来医学发展的影响和推动正文：荧光免疫TBA 检测是一种利用荧光标记的二抗或荧光标记的一抗与目标蛋白结合，通过荧光显微镜检测细胞或组织中特定抗原表达的方法。
这种检测方法的优点是具有高灵敏度、高特异性，能够准确反映目标抗原在细胞或组织中的表达情况。
一、荧光免疫TBA 检测简介荧光免疫TBA 检测的基本原理是利用荧光标记的抗体与目标抗原结合，通过荧光显微镜检测特定抗原的表达。
这种方法主要依赖于荧光标记的抗体与目标抗原的特异性结合，从而实现对目标抗原的检测。
荧光免疫TBA 检测的主要步骤包括：样本处理、荧光抗体结合和荧光信号的检测与分析。
二、荧光免疫TBA 检测原理详解1.样本处理：首先需要获取待检测的细胞或组织样本，然后进行固定、洗涤和抗原修复等处理。
这一步骤的目的是使抗原表位得到充分暴露，以便于后续的荧光抗体结合。
2.荧光抗体结合：荧光抗体与已经处理好的样本进行孵育，荧光抗体与目标抗原结合。
荧光抗体可以是荧光标记的二抗，也可以是荧光标记的一抗。
荧光标记的抗体与目标抗原结合后，形成荧光抗原复合物。
3.荧光信号的检测与分析：将荧光抗原复合物放入荧光显微镜下进行检测。
荧光显微镜可以捕捉到荧光信号，通过对荧光信号的强度和分布进行分析，可以判断目标抗原在细胞或组织中的表达情况。
三、荧光免疫TBA 检测的优势与应用1.相较于传统免疫组化技术，荧光免疫TBA 检测具有更高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映目标抗原在细胞或组织中的表达情况。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
之袁州冬雪创作在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需停止双重荧光染色.双重免疫荧光标识表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1)直接法双重免疫荧光标识表记标帜：将标识表记标帜有两种分歧荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未连系的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原停止定位和定量.直接法简即靠得住，但活络度较低.(2)间接法双重免疫荧光标识表记标帜：用未标识表记标帜的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种分歧的荧光素分别标识表记标帜的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原停止定位和定量.使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来历于分歧种属，且荧光标识表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光双标技术中操纵要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，分歧点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标识表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察. 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1).条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保管更久. 5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光. 6、荧光抗体染色假阳性能够会多，需要分别设定阳性和阴性对照.二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保管4h，时间过长，能够会使荧光提前衰退. 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标识表记标帜物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标识表记标帜物; (3) 荧光标识表记标帜物对照：PBS+荧光标识表记标帜物.三、免疫荧光双标的经历之谈1、选取一抗时，要求来历于两种分歧的动物，我用的是来历于家兔和大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光信号标识表记标帜的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红). 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要自我试探，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，布景比较清晰. 3、我的阳性对照采取的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标识表记标帜物对照是PBS+荧光标识表记标帜物. 4、封闭血清是二抗来历动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清. 5、其余事项同免疫荧光单标操纵.免疫组化双重染色方法和步调在生物医学和临床研究实践中，常常需要检测两种分歧物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色.此方法有几种类型，包含免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法连系;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位摄影，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、摄影);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标识表记标帜第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);分歧种属来历的抗体双重染色.今朝，最常常使用的是最后一种方法.分歧种属来历的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测.但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占相对优势时将妨碍另外一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原.在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种分歧特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的分歧种属生物素化二抗和两种分歧显色系统.即可将分歧部位或相同部位的两种抗原显示出来.该方法用于石蜡切片时应思索所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另外一个抗体的染色成果没有影响.SP法双重染色步调1～6步调与SABC 法相同，但无需使用生物素阻断剂：7.切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可防止已显色的抗原褪色);12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;13.滴加B 特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS冲洗3次，每次5分钟;14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS冲洗3次，每次5分钟：15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟17.苏木精复染细胞核;18.水溶性封片剂封片. 在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统停止详细设计.购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂.在选择一抗时应防止定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不成防止，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种分歧颜色的荧光重叠后呈现另外一种颜色的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光)，它比SP法的显色系统更容易区别和识别阳性成果. 在停止双重染色之前，必须对所选择的一抗分别停止单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验成果和抗体定位正确后，再停止双染实验.。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
间接免疫荧光法
间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)是一种常用的特异性检测技术，也是最常见的检测技术之一，可以用于检测抗原分子的特异性结合。
一、IFA的原理：在IFA技术中，使用两种不同的抗体，分别与检测抗原结合，以形成双重抗原抗体复合物，再用夹带抗体获得体外的特异性检测反应；其中，一种抗体称作抗体，另一种抗体称作夹带抗体，具有特定免疫能力，可以将抗原抗体复合物与另外特定抗原进行特异性结合，获得所需的检测反应，而后将夹带抗体对抗原抗体复合物设定与荧光探针结合，从而实现特异性检测。
二、IFA的操作步骤：1、样品处理：将抗原进行均质处理，获得悬浮液。
2、抗体处理：将样哮抗体在恒温下进行稀释，然后添加到抗原悬浮液中，放置回温处理反应，补充抗体，使抗原与抗体完全结合形成复合物。
3、夹带抗体处理：将夹带抗体加入复合物，在恒温下进行反应，以获得抗原/夹带抗体复合物，从而实现特异性检测。
4、荧光标记：将荧光探针与夹带抗体完全结合，使抗原/夹带抗体复合物呈现特定的荧光，从而实现特异性检测。
5、检测：利用适当的仪器检测复合物的活性，并完成IFA的检测。
三、IFA的应用：IFA可以直接用于病毒、细菌、植物、动物等微生物抗原的检测，也可以用于检测抗原蛋白、血清病原体等，具有一定的临床实用价值。
1、应用于病原体鉴定：通过将IFA进行优化，可以对人体和动植物病原体进行识别、诊断和鉴定，给临床实践带来重要的参考价值；2、应用于鉴定疾病：IFA还可以用于检测某种疾病的免疫检测，例如常见的疾病，如流感病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、病毒性肝炎慢性病毒、HIV/AIDS等；3、应用于临床诊断：IFA可以用于对各种疾病进行鉴别诊断和检测，例如：癫痫、睑缝螨虫病、先天性心脏病、脑外膜炎、肺炎、病毒性心肌炎等疾病；4、应用于药物开发：可以在药物研究和开发中应用此技术，以研究对病原生物体或抗原分子的特异性作用，使药物开发进程更加准确、可靠；五、IFA技术优势：1、IFA是一种精确度高、特异性能强的检测技术，可实现灵敏性检测，快速和实时检测，有效提高疾病的检测效率；2、IFA有较强的合并性，可以同时结合不同的抗体，能够更好地检测抗原分子特异性反应；3、IFA具有较低的污染风险，实验中没有生物体的接触，可以有效地控。
atp生物荧光检测法
atp生物荧光检测法1 关于ATP生物荧光检测ATP生物荧光检测（Adenosine Triphosphate, ATP，Bioluminescence Assay）是一种测量ATP的快速非标方法，被广泛应用于药物研究、细胞活力测定等领域。
该技术结合荧光的高灵敏度和特定酶标志剂的特性，用于检测ATP浓度，从而对生物样本中的ATP 有效测定。
2 原理ATP生物荧光检测广泛使用测量ATP水平的标志物：luciferin、luciferase和ATP二聚体。
Luciferin在参与luciferase酶催化下结构变性致使ATP水解，分解成氨基酸和抗坏血酸与荧光分子，荧光发射。
其形成了一个可以传输荧光信号的化学反应环传输系统，以测量样品中ATP的水平。
3 反应过程为了完成ATP生物荧光检测，先需要将试样加入荧光检测的底物液中搅拌均匀，其含有luciferase、luciferin、ATP三组分，使得ATP进入luciferase-luciferin的反应体系以形成多元荧光化合物。
当荧光分子经过荧光位点时，那里的能量足以激发luciferin分子，其分子内部会发生光荧光发射。
狭窄的荧光道范围（550-600nm）可以聚集有效紫外线，有效降低背景，大大提高信/噪声比（S/N），从而实现对ATP浓度的检测。
4 适用领域ATP生物荧光检测法能快速原则性地检测多种生物体内ATP含量，用于检测细胞活性、细胞能量代谢状况等，具有抗干扰性强等优点，因此，在以下领域非常有用：（1）药物研发：可以快速准确测定不同药物对细胞ATP含量的影响。
（2）微生物营养和病原体：可用于研究营养保护性和ATP合成途径。
（3）细胞代谢：可用于开展细胞代谢及细胞能量代谢的研究。
（4）其他：还可用于以微量的ATP作为发光信号的细胞报告系统，检测活性过程中的因素，如触发酶和α-肽。
总而言之，ATP生物荧光检测是一种有效的方法，用于测定生物样本中的ATP含量，有助于深入研究ATP的活性，动物组织和细胞的代谢，以及药效学和毒理学研究等。
组织荧光免疫tba检测原理
组织荧光免疫tba检测原理（原创实用版）目录1.荧光免疫 TBA 检测的原理概述2.荧光免疫 TBA 检测的组成部分3.荧光免疫 TBA 检测的具体步骤4.荧光免疫 TBA 检测的优点与局限性正文荧光免疫 TBA 检测是一种常用的免疫学检测方法，其原理主要基于抗原和抗体的特异性结合，通过荧光信号的强度反映样品中目标物质的含量。
该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，被广泛应用于临床检验、生物研究和药物筛选等领域。
荧光免疫 TBA 检测主要由以下几个部分组成：1.荧光标记抗体：荧光标记抗体是荧光免疫 TBA 检测的核心组成部分，其作用是与样品中的目标抗原特异性结合，形成抗原 - 抗体复合物。
2.荧光标记二抗：荧光标记二抗作用于抗原 - 抗体复合物，通过与荧光标记抗体结合，将荧光信号进一步放大。
3.TBA 检测试剂：TBA（Tetramethylbenzidine）是一种发光底物，与过氧化氢在碱性环境中发生化学反应，产生可见光信号。
荧光免疫 TBA 检测的具体步骤如下：1.制备标准品和样品：将目标物质制备成一定浓度的标准品和待检测的样品。
2.荧光标记抗体的制备：制备针对目标抗原的荧光标记抗体。
3.荧光免疫反应：将荧光标记抗体与标准品或样品混合，使其与目标抗原特异性结合。
然后加入荧光标记二抗，进一步放大荧光信号。
4.TBA 检测：将混合液加入 TBA 检测试剂，观察荧光信号的强度，从而判断样品中目标物质的含量。
荧光免疫 TBA 检测具有以下优点：1.灵敏度高：该方法可以检测到非常低浓度的目标物质。
2.特异性强：荧光免疫 TBA 检测具有很高的特异性，能够准确识别目标抗原。
3.操作简便：实验操作简单，结果易于观察。
然而，荧光免疫 TBA 检测也存在一定的局限性，例如对抗体质量要求较高，易受环境因素影响等。
免疫荧光共定位试剂
免疫荧光共定位试剂
免疫荧光共定位试剂是一种用于免疫染色的试剂，常用于在细
胞或组织中标记目标蛋白的位置。它结合了免疫检测和荧光显
微镜技术，可以通过荧光显微镜观察到标记的蛋白的位置和分
布情况。
免疫荧光共定位试剂通常由两种主要成分组成：抗体和荧光染
料。首先，一种针对目标蛋白的抗体与样品中的目标蛋白结合，
形成抗原-抗体复合物。然后，荧光染料与抗原-抗体复合物结
合，使目标蛋白标记上荧光信号。最后，在荧光显微镜下观察
标记的蛋白的位置和分布。
免疫荧光共定位试剂广泛应用于细胞生物学、免疫学、病理学
等领域的研究中。通过观察标记蛋白的位置，可以揭示生物样
品中不同蛋白的相互关系、细胞器的分布和功能，以及细胞或
组织中蛋白的表达和定位异常等信息。因此，免疫荧光共定位
试剂成为了研究生物学过程和疾病机制的重要工具。
免疫荧光b细胞亚型
免疫荧光b细胞亚型
免疫荧光是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定细胞表面或细胞内的特定抗原。
在免疫学中，B细胞是免疫系统中的一类重要细胞，其主要功能是产生和分泌抗体。
根据表面标记物的不同，B细胞可以被分为不同的亚型。
以下是一些常见的免疫荧光标记用于鉴定B细胞亚型的抗体：
1. CD19：CD19是B细胞特异性标志物，广泛表达于成熟的B细胞和B细胞肿瘤细胞。
使用CD19抗体进行免疫荧光染色可以帮助鉴定B细胞的存在和数量。
2. CD20：CD20是B细胞特异性膜表面抗原，广泛表达于正常B细胞和B细胞肿瘤细胞。
CD20抗体可以用于鉴定B细胞以及与其相关的疾病。
3. IgD和IgM：IgD和IgM是两种B细胞受体表面抗体，在B细胞发育过程中起重要作用。
通过检测IgD和IgM的表达，可以区分不同阶段的B细胞。
4. CD27：CD27是一个活化标记物，在记忆B细胞和某些浆细胞上高度表达。
CD27抗体可以帮助鉴定记忆B细胞和浆细胞亚群。
5. CD38：CD38是浆细胞和一部分记忆B细胞表面的标志物。
通过检测CD38的表达，可以鉴定浆细胞和与其相关的B细胞亚型。
需要注意的是，这只是其中一些常见的B细胞亚型的免疫荧光标记物，并且还有其他更多的标记物可用于鉴定不同的B细胞亚型。
具体使用哪种标记物取决于研究者的需求以及实验设计。
1。
组织荧光免疫tba检测原理
组织荧光免疫TBA检测原理概述组织荧光免疫TBA（Tissue-based Assay）检测是一种常用于研究和诊断组织样本中蛋白质的表达和分布的方法。
该技术利用荧光标记的抗体与目标蛋白质特异性结合，通过显微镜观察荧光信号的分布情况，从而达到检测和分析目标蛋白质在组织中的表达水平和分布模式的目的。
原理组织荧光免疫TBA检测是基于免疫组织化学的原理，结合荧光标记技术，使得目标蛋白质在组织切片上产生可见的荧光信号。
其主要步骤包括固定组织样本、抗原修复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、荧光标记和显微镜观察。
固定组织样本首先，需要将待检测的组织样本进行固定，以保持组织的形态结构和蛋白质的空间分布。
常用的固定方法包括冷冻固定和石蜡包埋固定。
抗原修复组织样本在固定过程中可能会导致蛋白质的空间结构发生改变，影响抗体的结合效率。
因此，需要进行抗原修复，以恢复蛋白质的原始结构。
常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。
阻断非特异性结合为了减少非特异性结合，需要对组织样本进行阻断处理。
通常使用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）、羊血清和小鼠血清等。
一抗孵育将与目标蛋白质特异性结合的一抗加入到组织样本中，进行孵育。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，具体选择根据实验需求和目标蛋白质的特性来决定。
二抗孵育一抗与目标蛋白质结合后，需要加入与一抗特异性结合的二抗。
二抗通常是与荧光染料偶联的抗动物免疫球蛋白（IgG）。
二抗的选择要根据一抗的种属和亚类来确定。
荧光标记二抗与目标蛋白质结合后，可以通过荧光标记的方式使其产生荧光信号。
常用的荧光染料有荧光同型素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）和青蛋白（Cy5）等。
显微镜观察最后，利用荧光显微镜对组织样本进行观察和记录。
荧光信号的强度和分布情况可以反映目标蛋白质在组织中的表达水平和分布模式。
应用组织荧光免疫TBA检测广泛应用于医学研究和临床诊断中。
它可以用于研究肿瘤标志物、免疫细胞标记物、细胞凋亡指标等蛋白质的表达和分布情况，从而揭示疾病的发生机制和进展过程。
biotin标记的抗体在流式中的应用
biotin标记的抗体在流式中的应用Biotin标记的抗体是一种常用的荧光标记技术，广泛用于流式细胞仪分析。
这种标记技术具有高灵敏度和高特异性，常用于筛选目标细胞和研究细胞表面蛋白的表达和变化。
本文将详细介绍如何使用biotin标记的抗体进行流式细胞仪分析。
第一步：实验材料准备在进行biotin标记的抗体在流式中的应用前，需要准备一些实验材料。
主要包括：1. biotin标记的一抗：选择与目标细胞表面蛋白特异结合的抗体，并在其分子结构中引入磷酸化或硫酸化的生物素官能团。
2. 垂直着陆的亲生素：可与biotin结合，并形成牢固的配对，以便生物素标记后的一抗能被流式细胞仪检测。
3. 流式细胞仪：选择适当的流式细胞仪，其具有高灵敏度和高分辨率的测量能力。
第二步：生物素标记和染色首先需要将生物素-邻硝基苯酯与一抗反应，以将生物素标记引入到一抗中。
然后，通过基于流式细胞仪的染色方法，将生物素-biotin-avadin配对加入到检测细胞的表面。
这个过程中，生物素标记的一抗与目标细胞表面的蛋白结合，生物素-biotin-avadin配对则与生物素标记的一抗结合形成牢固的结合，将生物素标记的一抗定位到细胞表面。
第三步：流式细胞仪分析现在将标记好的细胞加入到流式细胞仪，使用流式细胞术检测细胞表面分子的表达和分布。
当激光击中细胞上表面搭载生物素标记的一抗时，它会产生一个特定的荧光信号，流式细胞仪能够将该信号与细胞的其他特征进行比较。
通过比较不同的细胞群体之间的生物素标记抗体结合渐变，能够准确的描述目标细胞表面蛋白的表达和变化。
总结综上所述，biotin标记的抗体在流式中的应用是一种有效的荧光标记技术，能够高效地标记目标细胞表面的蛋白，进而揭示目标细胞的表达和特征。
该技术具有高灵敏度和高特异性的优点，对于细胞定量和分析、疾病诊断和药物筛选等方面均具有广泛的应用前景。
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www.100biotech.com service@100biotech.com 第二节 荧光抗体技术 一、荧光抗体的制备 （一）抗体的荧光素标记 用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取igg后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以fitc标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌4～6h后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。
透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含fitc的0.01mol/lph9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对pbs透析法去除游离色素。低速离心，取上清。
标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法可采用透析法或层析分离法。
（二）荧光抗体的鉴定 www.100biotech.com service@100biotech.com
荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a2801≈1.0，分别测读a280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。
按公式计算。
f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。
抗体工作浓度的确定方法类似elisa间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。
荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。
二、免疫荧光显微技术 免疫荧显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。
（一）标本的制作 www.100biotech.com service@100biotech.com
荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。
常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。置－10℃保存或立即使用。
（二）荧光抗体染色 于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用25～37℃30min，不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。用pbs充分洗涤，干燥。
（三）荧光显微镜检查 经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。 荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。首先要选择好光源或滤光片。滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。在光源前面的一组激发滤光片，其作用是提供合适的激发光。激发滤光片有两种。mg为紫外光滤片，只允许波长275～400nm的紫外光通过，最大透光度在365nm；bg为蓝紫外光滤片，只允许波长325～500nm的蓝外光通过，最大透光度为410nm。靠近目镜的一组阻挡滤光片（又称吸收滤光片或抑制滤光片）的作用是滤除激发光，只允许荧光通过。透光范围为410～650nm，代号有og（橙黄色）和gg（淡绿黄色）两种。观察fitc标记物可选用激发滤光片bg12，配以吸收滤光片og4或gg9。观察rb200标记物时，可选用bg12与og5配合。 www.100biotech.com service@100biotech.com
（四）实验的类型 1．直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合（图17-1）。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。
图17-1 直接免疫荧光法原理示意图 2．间接法可用于检测抗原和抗体，原理见图17-2。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。
图17-2 间接免疫荧光法原理示意图 www.100biotech.com service@100biotech.com
图17-3 补体结合免疫荧光法原理示意图 3．补体结合法本法是间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪（图17-3）。本法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。
4．标记法本法用fitc及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。
三、在医学检验中的应用 荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。标本材料可以是培养物、感染组织、病人分泌排泄物等。本法较其他鉴定细菌的血清学方法速度快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能作为一种补充手段使用，而不能代替常规诊断。荧光抗体染色法对脑膜炎奈氏菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、布氏杆菌和炭疽杆菌等的实验诊断有较好效果。荧光间接染色法测定血清中的抗体，可用于流行病学调查和临床回顾诊断。免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断常用方法之一。免疫荧光技术在病毒学检验中有重要意义，因为普通光学显微镜看不到病毒，用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况。 www.100biotech.com service@100biotech.com
在寄生虫感染诊断中，间接荧光抗体染色法有非常广泛的应用。间接免疫荧光试验（ifat）是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。常用抗原为疟疾患者血液中红内期裂殖体抗原。ifat对肠外阿米巴、尤其是阿米巴肝脓肿也有很高的诊断价值，所用抗原是阿米巴培养物悬液或提取的可溶性抗原。
免疫荧光法还是检测自身抗体的好工具，在自身免疫病的实验诊断中应用广泛。其突出优点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分，并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。主要有抗核抗体、抗平滑肌抗体和抗线粒体抗体等。抗核抗体的检测最常采用鼠肝作核抗原，可做成冰冻切片、印片或匀浆。用组织培养细胞如hep-2细胞或hela细胞涂片还可检出抗着丝点抗体、抗中性粒细胞浆抗体等。应用免疫荧光技术可以检出的其他自身抗体有抗（胃）壁细胞抗体、抗双链dna抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体、抗骨髓肌抗体及抗肾上腺抗体等。
荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析（flowcytometry）。在这种分析方法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各处数据。这种方法可用于检测细胞大小、折散率、粘滞度等，更常用于t细胞亚群等的检测。
免疫荧光技术 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客 www.100biotech.com service@100biotech.com
观性不足，技术程序也还比较复杂。 (一) 原理与方法 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影 (二) 荧光抗体的制备 1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血清的效价与特异性是矛盾的，通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是IgG类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。