免疫印迹的基本原理应用
蛋白质免疫印迹的原理和方法
蛋白质免疫印迹的原理和方法说实话蛋白质免疫印迹这事，我一开始也是瞎摸索。
先来说说原理吧。
我理解这个蛋白质免疫印迹呢，就有点像在一群小珠子（代表各种蛋白质）里找特定形状（特定蛋白质）的珠子。
我们利用抗原和抗体特异性结合这个特性。
样本里那些蛋白质就是小珠子，我们有能识别特定蛋白质（也就是特定抗原）的抗体，这就像拿个特制的小夹子去夹我们要找的那种形状的珠子。
一旦夹住了（结合了），我们就能检测到特定蛋白质的存在啦。
再讲讲方法吧。
我刚开始的时候那真是一头雾水。
首先是跑胶，这就好像是一场运动会的长跑赛道。
蛋白质样品就像一个个小运动员，根据它们大小的不同，在电场这个“发令枪”下达之后，跑得快（分子量小的）的在前面，跑得慢（分子量大的）在后面。
接下来是转膜，这一步我可犯了不少错。
我就想啊，这就好比让那些小运动员从跑道“飞”到旁边的大纸上（膜）。
我第一次转膜的时候，电流大小没设置好，那结果惨不忍睹啊。
后来才知道，就像小孩过马路要有大人领着，合适的电流就像那个领路人，能确保蛋白质顺利转运到膜上。
然后就是封闭这一步。
我感觉这时候就像在敌人（非特异性结合的东西）来之前，筑起一道墙（封闭液）。
我当时试过不同的封闭液，结果发现不同的样本和抗体可能适合不同的封闭液，这得摸索，可不能一股脑乱试。
之后就是加一抗，这一步可得小心。
一抗就是我们找特定蛋白质的关键工具。
我记得有一次，一抗的浓度我没调好，要么检测不到信号，要么整个膜黑乎乎一片，就像涂鸦画乱了一样。
后来多试几次才弄明白合适的浓度范围。
再然后加二抗，二抗就像个二传手，它能和一抗结合，还带着一种能被检测到的信号标记。
在曝光的时候，这个标记就像手电筒一样，把我们要找的蛋白质照亮，这样我们就能看到它们的存在啦。
不过二抗也得注意保存和使用，我有次二抗被污染了，整个结果就不对了。
总之啊，做蛋白质免疫印迹，每一步都要谨慎。
就像走钢丝一样，稍有不慎就可能掉下去摔得很惨，但是只要多摸索，积累经验，最终肯定能成功。
免疫印迹技术方法研究
免疫印迹技术方法研究一、前言免疫印迹技术借助的是抗体与抗原的特异性结合的作用，来检测样品中蛋白质表达情况的一项免疫学检测技术，不需要复杂的大型机器，主要依靠凝胶电泳和电转移来对蛋白质提取，最终对蛋白质进行定性定量分析。
二、内容1、技术原理（1）样品的凝胶电泳：制备凝胶，加入样品进行凝胶电泳，使样品中蛋白质分离。
（2）电印迹：所谓电印迹就是将凝胶电泳上的经过分离的蛋白转移到一个固相膜上。
因为如果让蛋白质在凝胶电泳后直接检测，部分蛋白质会嵌在凝胶里面，探针无法到达，同时可能对蛋白质条带有破坏作用，因此为了方便探针与蛋白质互相结合，将其转移到另一个与探针结合度更好的物质上，也就是固相膜。
（3）选择性封闭：为避免探针和无关物质结合，将膜上没有结合蛋白质的部分封闭，防止其他干扰。
（4）免疫结合：将抗体与膜上的蛋白质结合，使其反应，再用二抗与一抗反应。
（5）产物检测：通过二抗间接检测目的蛋白，将膜上的抗体和能发出荧光的物质结合，对产生的发光物质进行检测。
2、方法(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备:把玻璃板洗净并晾干,四边对齐，置于制胶架上。
其次配制分离胶，蛋白质的相对分子量不同制胶也不同。
分离胶制好后沿玻璃板上的一角缓慢、平稳地注入两层玻璃板中间,待其充分凝固后,把浓缩后的胶溶液沿玻璃板一角注入，立刻插入梳子。
(2)蛋白样品的前处理:将缓冲液和蛋白质样品按一定比例混合,待其沸腾若干分钟后,放入冰块中待用。
(3)样品上样和电泳:将制好的凝胶缓慢从架上取下,放进电泳槽,将缓冲液注入电泳槽,再拔出梳子。
吸取经过预处理的蛋白样品20μL加样。
打开电泳槽电源,选择稳压模式,100v左右的工作电压，待电泳时加入的指示染料到达胶底部时关闭电泳槽。
经凝胶电泳处理后，样品蛋白质带负电荷，在凝胶中游动，游动速度与分子量大小成反比，自阴极游到阳极。
（4）蛋白质转移（电转印）：将凝胶板取下,切去不用的部分,剪裁和凝胶一样大小的NC膜或PVDF膜,再在电转移液中浸泡固相膜，裁剪数张比凝胶尺寸稍微小一点的滤纸,放入缓冲液中浸泡。
免疫血清的应用之免疫印迹PPT精品课程课件讲义
方法已被广为采用，其中三种分别称为Southern、
Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋 白质。 其中Western印记又称为免疫印迹。
• 免疫印迹是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中
某种蛋白的方法。可以分为斑点印迹和电泳转移印记。
• 电转移印记操作可分为三个过程：
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免疫血清的应用之免疫印迹
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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开始上课！
一、实验原理
• 印迹法：将生物大分子物质（如核酸或蛋白质）通过不同
的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂 处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中 孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。 • 自从1975年建立印迹法以来，目前比较成熟的有四种印记
• 不足之处：
• 操作要求高
• 成本高
• 结果判断主要依据条带的有无以及条带的亮度
二、实验材料
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待检抗原：红细胞裂解液；2×SDS凝胶加样缓冲液； SDS-PAGE凝胶制备相关材料； 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸电泳缓冲液； 预染蛋白质Marker； 染色液，脱色液； 转膜缓冲液； 硝酸纤维素滤膜（NC膜）和定性滤纸； 洗涤液：TBST； 封闭液：以TBST稀释的3％脱脂牛奶； 免疫血清：兔/小鼠抗鸡红血球免疫血清，使用时以TBST稀释100倍； 二级抗体：HRP标记的羊抗兔IgG，使用前以TBST稀释1500倍； 显色液：3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）显色试剂； 终止液：灭菌蒸馏水。
免疫印迹实验原理
免疫印迹实验原理
嘿，朋友们！今天咱来唠唠免疫印迹实验原理。
你说这免疫印迹实验啊，就像是一场奇妙的侦探之旅！咱要找的就是那些隐藏在蛋白质世界里的“小秘密”。
想象一下啊，细胞就好比一个大仓库，里面装满了各种各样的蛋白质。
而我们呢，就是要从这个大仓库里把我们感兴趣的特定蛋白质给揪出来。
这可不容易哦，就像在一堆沙子里找一粒特别的小石子儿。
首先呢，我们得把细胞里的蛋白质都给弄出来，这就像是把仓库里的东西都倒出来摊开。
然后呢，我们利用电泳这个神奇的手段，根据蛋白质的大小啊、电荷啊等等特性，让它们排好队，各就各位。
这一步可太关键啦，就像把混乱的人群按照高矮胖瘦排好一样。
接下来，这些排好队的蛋白质就会被转移到一张膜上，就好像是把它们从一个地方搬到另一个地方。
这张膜就成了它们的新家啦。
然后呢，我们就派出我们的“秘密武器”——抗体！这抗体就像是一个个小侦探，专门去寻找我们指定的那个蛋白质。
抗体一旦找到了目标，就会紧紧地抱住它，绝不撒手。
最后，我们通过一些特殊的方法，让这个结合的地方显现出来，哇，这不就找到了我们想要的那个蛋白质嘛！是不是很神奇呀！
你说这免疫印迹实验像不像一场刺激的游戏？我们就是游戏的玩家，要运用各种策略和技巧来找到最终的答案。
而且这个实验的用处可大啦！可以帮助我们检测疾病啊、研究蛋白质的功能啊等等。
所以啊，大家可别小瞧了这免疫印迹实验，它可是我们探索蛋白质世界的一把金钥匙呢！它能让我们解开很多生命的奥秘，让我们对这个世界有更深刻的认识。
怎么样，是不是对免疫印迹实验原理有了更清楚的了解啦？是不是也觉得它超级有趣呢？快去试试吧！。
蛋白质免疫印迹的原理
蛋白质免疫印迹的原理蛋白质免疫印迹是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质在混合物中的存在并确定其分子量。
该技术基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理，通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。
蛋白质免疫印迹技术需要获取感兴趣的蛋白质样本。
这些样本可以来自细胞、组织、血清等。
通常，需要先对样本进行蛋白质提取和纯化，以获得高质量的蛋白质样本。
接下来，将蛋白质样本进行电泳分离。
常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2-DE）。
通过电泳分离，可以将蛋白质样本按照其分子量和电荷大小进行分离。
分离完成后，将电泳胶中的蛋白质转移到固定膜上。
这通常通过半湿式或干式转移的方法实现。
在半湿式转移中，将电泳胶和膜以间隔层叠放置，通过电流将蛋白质从胶体转移到膜上。
在干式转移中，将电泳胶和膜分开，使用特定的设备将蛋白质转移到膜上。
转移完成后，膜上的蛋白质被固定在膜上，形成蛋白质膜。
为了防止非特异性结合，膜上的蛋白质被处理成一定的条件，如用乙酸酐等进行酰化处理。
这样可以增加膜上蛋白质与抗体之间的特异性结合。
接下来，将蛋白质膜进行免疫染色。
首先，在蛋白质膜上加入特异性抗体。
这些抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，用荧光标记的或酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。
这些二抗可以识别并结合一定类型的抗体，从而实现对蛋白质的检测和定量。
使用相应的检测方法观察和分析蛋白质的存在与性质。
常用的检测方法包括荧光成像、放射免疫测定和酶联免疫测定。
这些方法可以通过测量光信号、放射性信号或酶反应产物的生成来确定目标蛋白质的存在与性质。
总结起来，蛋白质免疫印迹技术是一种基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理的实验技术。
通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，对于研究蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。
蛋白质免疫印迹技术【62页】
免疫应答的类型
（一）固有性免疫应答（innate immune response) 又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体
在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。
（二）适应性免疫应答（adaptive immune response） 又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出
每2～3周加强免疫一次。 在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血，
制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需 再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达 到预期水平时，即可放血制备抗血清。
ห้องสมุดไป่ตู้
抗体的产生顺序与丰度
（七）抗血清的采集与保存
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血， 一是颈动脉放血，也可心脏采血。
解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五 上）。
2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置 （加少量NaOH促溶） （周四下午）。
苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠
标记部位 头 左前肢 左后肢 背 右前肢 右后肢 左耳朵 右耳朵
组号 1 2 3 4 5 6 7 8
生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。 （具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）
抗原和免疫原性
抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特 异性反应的物质。
常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。
效价 抗血清的效价，就是指血清中所含 抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用 的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体 均适用。
免疫印迹原理
免疫印迹原理
免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，其
原理基于蛋白质的免疫识别和特异性结合。
首先，需要通过SDS-PAGE电泳技术将待检测的蛋白质样品
进行分离。
然后，将分离后的蛋白质转移到固相膜上，常用的固相膜有聚乙烯二醇（PVDF）和亚硝酸纤维素膜（NC）。
接下来，将蛋白质固定在固相膜上，并用非特异性蛋白质进行封闭，以防止非特异性结合。
之后，将待检测的蛋白质与特异性的抗体结合，这些抗体通常是动物经免疫后制备的，可以识别并结合目标蛋白质。
接着，通过荧光素酶体（如辣根过氧化物酶）或荧光染料等进行二级抗体的标记，以便识别和检测蛋白质-抗体结合。
这样，待检测的蛋白质可以通过相应的信号表现出来。
最后，通过相应的检测系统（如X射线胶片或成像仪），可
以观察到与目标蛋白质结合的蛋白带，其强度和位置可以用来定量分析目标蛋白质的表达量和大小。
总之，免疫印迹是一种通过特异性抗体识别和结合目标蛋白质的方法，并利用荧光素酶体或荧光染料等标记物进行检测，用以分析蛋白质的表达量和大小。
这种方法广泛应用于生物医学研究领域，为疾病相关蛋白质的检测和分析提供了有力的工具。
免疫印迹
免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越快.此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带).第二阶段为电转移:将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1～2A),通电45min转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位:将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色.常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断.在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒,可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体.免疫印迹法免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
研7免疫印迹技术1
Western Blot
第一节 概论
1.什么是Western Blot?
Western Blot:又叫蛋白免疫印迹，是 指将蛋白转移到固相载体上，而后利 用相应的方法来进行检测，是检测蛋 白质特性、表达与分布的一种最常用 的方法。
2. Western Blot的用途?
（1）研究一些体外的蛋白质分子，寻找目 的蛋白是否存在样品当中 （2）蛋白质的表达情况，上调或下调表达， 在不同的样品中，如疾病和正常的样品之 间的表达差异性。
1.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称 Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺 （简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联 而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此 为支持物进行电泳。 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白 质分子所带电荷的差异及分子大小的不同 所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干 条区带。
SuperSignal® 底物与二抗HRP,AP反应,显色或发光
5
SuperSi单抗 或兔多抗)
4
HRP,AP标记二抗与一抗－蛋 白复合物结合
2 1
电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上 漂洗和封闭
第三节 流程
1、蛋白样品的制备
2、SDS-PAGE电泳 3、转膜 4、封闭 5、一抗杂交（孵育） 6、二抗杂交（孵育） 7、检测
3.蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液： DTT 1M TrisHCl(pH6.8) 1M DTT SDS 10 ml 20 ml 4 g 20 ml 0.2 g
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM
③ 4%SDS
④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
免疫印迹电泳法的原理
免疫印迹电泳法的原理
免疫印迹电泳法，也称为Western blot（西方印迹）或蛋白印迹法，是一种用于检测特定蛋白质在混合物中的存在和数量的分析技术。
以下是免疫印迹电泳法的基本原理：
电泳分离：首先，样品中的蛋白质被用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）或其他电泳方法进行分离。
SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带有负电荷，同时解除蛋白质的二级结构，使其线性化。
蛋白质根据大小在凝胶中迁移，从而实现对蛋白质的分离。
转移：分离后的蛋白质被转移到聚丙烯酰胺膜（或其他类型的膜，如硝酸纤维素膜）。
这个步骤通常称为电转移，它将蛋白质从凝胶转移到膜上，保持了蛋白质的相对位置。
阻塞：通过在膜上添加一种非特异性的蛋白质，通常是牛血清蛋白（BSA）或非脂干奶粉，来“阻塞”膜上未被分析的部分。
这可以防止后续的抗体结合到非特异的位点上。
抗体结合：将一种特异性的抗体加入，使其与目标蛋白结合。
这个抗体通常是对目标蛋白的特定亚单位具有亲和力的抗体。
二次抗体结合：引入另一种被称为“二次抗体”的抗体，这种抗体通常是与常见实验动物（如兔子或小鼠）的抗体结合的抗体。
这个二次抗体被标记上荧光剂、酶或其他检测标记物，以便在后续检测步骤中识别。
检测：使用化学发光、荧光、酶标记等方法来检测标记的二次抗体，从而显示出特定蛋白质的存在和相对数量。
通过这个过程，研究人员能够确定混合物中是否存在特定的蛋白质，并定量其相对含量。
免疫印迹电泳法在分子生物学和生物化学研究中得到广泛应用。
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免疫印迹的基本原理应用
1. 简介
免疫印迹是一种常用的生物化学实验技术，用于检测特定蛋白在混合物中的存
在和定量。
它是一种高灵敏度和高特异性的方法，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍免疫印迹的基本原理和应用。
2. 基本原理
免疫印迹的基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白结合，并通过标记物（例如酶、放射性同位素或荧光染料）来检测和可视化结合事件。
具体步骤如下：
1.样品制备：将待测样品（例如细胞提取物、血清或体液）进行蛋白质
提取和纯化，得到待测蛋白的混合物。
2.SDS-PAGE电泳：将待测蛋白混合物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-
PAGE）分离，根据蛋白质大小和电荷分离出不同位置的蛋白带。
3.转膜：将分离的蛋白通过电泳法转移到聚合物膜（例如聚乙烯二醇膜）
上，以便进行进一步的蛋白检测。
4.阻断：通过在转膜后处理中加入蛋白质（例如牛血清蛋白）来阻断非
特异性结合位点，减少假阳性的生成。
5.一次抗体结合：加入特异性一次抗体，使其与目标蛋白结合形成抗原
-抗体复合物。
6.清洗：用缓冲液进行多次洗涤，去除非特异性和非结合的蛋白质。
7.二次抗体结合：加入酶标记的二次抗体，使其与一次抗体结合。
8.清洗：再次用缓冲液进行多次洗涤，去除非特异性和非结合的二次抗
体。
9.可视化：加入特定底物，使酶催化底物的转化产生可检测的信号（例
如染色或荧光）。
通过使用专门的成像设备或软件，可以记录和分析这些可视化的结果。
3. 应用
免疫印迹技术在许多生物医学研究领域中得到了广泛应用。
以下是免疫印迹技
术的一些主要应用：
3.1 蛋白定量
免疫印迹技术可以用于精确测量特定蛋白在混合物中的存在和相对含量。
通过
将待测蛋白与已知浓度的标准蛋白进行比较，可以推断待测蛋白的浓度。
3.2 蛋白相互作用研究
免疫印迹技术可以用于研究蛋白与其他蛋白或分子之间的相互作用。
通过检测
特定蛋白与其他蛋白的结合情况，可以揭示蛋白的功能和信号传导的机制。
3.3 蛋白表达分析
免疫印迹技术可以用来检测蛋白在不同组织或细胞中的表达差异。
通过比较不
同样品中特定蛋白的信号强度，可以研究蛋白在不同生理状态或疾病状态下的表达变化。
3.4 研究疾病标记物
通过免疫印迹技术可以鉴定特定蛋白在疾病发生和发展中的作用。
通过检测疾
病患者和健康人群中特定蛋白的表达差异，可以找到潜在的疾病标记物，并用于诊断和预测疾病的进展。
3.5 药物开发与筛选
免疫印迹技术可以用于药物开发与筛选。
通过检测特定蛋白与药物的结合情况，可以评估药物的疗效和选择合适的药物。
4. 结论
免疫印迹是一种重要的实验技术，能够在生物医学研究中提供有关特定蛋白的
重要信息。
通过了解免疫印迹的基本原理和应用，我们可以更好地理解和利用这一技术，并将其应用于相关研究领域。
以上就是免疫印迹的基本原理和应用的简要介绍，希望对读者理解和应用免疫
印迹技术有所帮助。