蛋白质芯片技术简述与应用前景

蛋白质芯片技术简述与应用前景 生物芯片技术是生物工程学的一项革命性的新技术，具体是指是指通过微加工技术和微电子技术在固相基质表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。自1998年美国宣布正式启动基因芯片计划以来。生物芯片技术的理论研究与实际应用在国内外迅速发展，已经成为人们获取相关信息的重要手段之一。生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破，在生物、医学、食品、环境科学等领域具有十分广阔的应用前景。 生物芯片种类繁多，就目前为止有基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片，细胞芯片，微路流芯片，糖芯片等 。本文将以蛋白质芯片为重点简述其发展及应用前景。 蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，是由固定于不同种类支持介质上的蛋白微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的，用未经标记或标记(荧光物质、酶或化学发光物质等标记)的生物分子与芯片上的探针进行反应，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理．蛋白质芯片具有以下特点：1)特异性强．这是由抗原抗体之间、蛋白与配体之间的特异性结合决定的； 2)敏感性高．可以检测出样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级； 3)通量高．在一次实验中对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高；4)重复性好．不同次实验间相同两点之间差异很小； 5)应用性强．样品的前处理简单，只需对少量实际标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测； 6)适用范围广．适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品． 目前，蛋白质芯片已经应用到生命研究、临床等多个领域，较有代表性的有： 1在病毒学研究上的应用 常规的病毒感染的检测主要依靠病原学、免疫学和分子生物学的方法。方法包括形态染色、分离培养、血清学鉴定及PCR技术等[9]。与这些方法相比，蛋白质芯片技术可在短时间内对微量蛋白大信息量的检测，并在许多病毒的感染检测中得到了广泛的应用。Perrin等[10]将基因工程重组的P24蛋白和甲基乙烯基醚/马来酸酐合成为共聚物，用非接触式点样仪将共聚物点样到96孔反应板上，以碱性磷酸酶标记的羊抗人抗体作为信号分子，检测抗HIV P24抗体，结果表明蛋白质芯片的敏感性和特异性和ELISA法相似。Zhu[11]将纯化的冠状病毒蛋白点样到FAST载玻片上，以Cy3荧光标记的抗人IgG和Cy5荧光标记的抗人IgM作为信号分子，制备成抗冠状病毒抗体检测蛋白质芯片，使用软件对信号进行处理。对流行期间400例加拿大病人的血清样本和206例中国发热病人的血清样本进行检测，表明该蛋白质芯片可以敏感、高效、大规模地检测引起SARS的病原体。这种方法还可用于检测其他类型的冠状病毒。张文等[12]将基因工程表达的HCV分片段抗原，点样到醛基化处理的载玻片上，制成芯片，以Cy3荧光标记的兔抗人IgG作为信号分子，用激光共聚焦扫描仪扫描成像，对来自3家临床单位采用ELISA试剂检测并经过临床验证的905份血清标本进行分析，结果表明蛋白质芯片检测敏感性和特异性高于ELISA法。对其中北京市红十字血液中心提供的290份经ELISA法检测弱阳性的血清样本，分别用蛋白质芯片法和酶免疫分析法进行检测，结果高度一致表明蛋白质芯片法具有操作简便，费用低廉的特点。蛋白质芯片技术不仅能够用来检测单一的病毒感染，在同步检测多种病毒感染方面也发挥着重要作用[13]。对于同步检测多种病毒感染，目前主要集中在常见的、对人类危害较大的病毒感染(HIV、HBV、HCV)的同步检测。Burgess等[14]将纯化的HIV、HCV和HBV抗原点样到胶体金处理的载玻片上，以Cy3荧光标记的鼠抗人IgG作为信号分子，用激光共聚焦扫描仪扫描成像，这一系统具有敏感、平行、快速的优点，并可同时进行三种病毒的检测。Zhang等[15]利用抗原-抗体特异性反应原理,建立抗体蛋白质芯片,进行了血清中弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒感染的集成检测尝试。实验结果验证了和经典的ELISA检测具有良好的吻合性。蛋白质芯片技术由于其检测样品的微量消耗和高通量分析等特点使其在病毒感染检测方面得到了较大发展。但目前实验研究检测的病毒感染种类有限，主要是由于特异性病毒蛋白分子纯化技术的发展滞后，同时高通量检测时病毒抗原间的交叉反应，还需要大量的实验研究筛选敏感的交叉反应较少的抗原检测片段。 2在动物源性食品安全监测上的应用 蛋白质芯片技术诞生以来，已在医学基础研究、临床诊断、药物筛选、测试与新药研发等方面得到广泛应用，但在动物源性产品中的应用鲜有报道。 2．1 动物源性产品中病原微生物的检测病原微生物是食品生物性污染的最主要因素，也是引发人体食源性疾病的主要原因。传统的检测方法是培养分离法，整个过程耗时费力，已不能满足目前食品质量与安全控制体系的要求。Howell等∞3采用俗称软蚀刻的微接触印刷技术(Mierocontact printing，灶CP)对抗体进行修饰以保持其生物活性，再将其物理吸附于硅烷化修饰的玻片上，通过高分辨率的扫描探针显微镜(ScanningProbe Microscopy，SPM)进行分析，制作了一种可用于检测大肠杆菌E．coli 01 57：H7和鲑肾杆菌(Renibacteriumsalmoninarum)的抗体微阵列“3。实验结果显示，该芯片与其他病原菌的交叉反应少，检出浓度为7×10 7cfu／ml，检测时间为40 min。由此说明蛋白质微阵列是一种很有效的微生物检测方法。 2．2 动物源性产品中兽药残留的检测 兽药残留是兽药使用后残存于动物体内的微量兽药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。动物产品中兽药残留能造成对人体的潜在慢性危害。预防这种危害的最有效方法就是加强对动物产品中兽药残留检测的力度，因此检测动物源性产品中的兽药残留同样具有重要意义。目前研究较多的检测技术主要有活体检测法、化学检测法、酶抑制法和仪器分析法等，但它们无法在时间和成本上同时满足实际应用的需要。蛋白芯片检测兽药残留的方法具有简单、快速和高通量的特点，可以满足社会发展对食品安全检测产品的需要。该试剂盒可以实现对猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝和牛奶中磺胺总量、链霉素总量、恩诺沙星以及氯霉素的定量检测。除具有灵敏度高、特异性强、样品前处理简单、检测方便快速等优点，还可实现对上述多种兽药的同时并行检测，极大地节省了检测费用，缩短了检测时间，进而提高了检测效率。 2．3动物源性产品中转基因食品的检测 自1994年，美国第一个转基因植物产品——转基因番茄获得FDA的批准进入市场以来，转基因农作物在全球内飞速发展。转基因食品就是用转基因生物生产和加工的食品，也叫基因修饰食品(GMF)，可以进一步分为转基因植物食品、动物食品和微生物食品∞3。由于转基因食品含有转基因技术导入的外源基因和外源基因在受体内的表达产物，所以对其安全问题争议很大。目前国际上还没有一份严肃的科学报告证实转基因食品是永久安全的。因此，对转基因食品进行检测和标识已势在必行。基因芯片可以检测出食品中是否含有转基因，以及含有何种转基因。目前国际上转基因产品的检测还没有统一的方法和标准，常用的转基因作物检测方法有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、Southern杂交法、Northern杂交法、Western杂交法和生物测定检测法等。但这些方法只能对单个检测目标进行检测，并存在假阳性高或检测时间周期长等问题。而迅速发展起来的基因芯片技术通过设计不同探针阵列、使用特定分析方法可使该技术具有很高的应用价值，具有高通量、微型化、自动化和信息化的特点，是转基因食品检测方向，可弥补传统方法不足。转基因作物检测基因芯片是将目前通用报告基因、抗性基因、启动子和终止子特异片段固定于玻片上制成检测芯片，将从待检样品中提取DNA扩增、标记后与芯片进行杂交，杂交信号扫描后可经过软件进行分析判断。它选择检测的报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景选择标记，通常是在离体条件下易于检测的酶或发光蛋白。它还可同时检测报告基因、抗性基因、启动子和终止子，非常适合于转基因作物及加工品检测， 使之具有广阔发展前景。 3蛋白质芯片技术在肿瘤检测中的应用 蛋白质芯片技术在肿瘤研究领域中进展最快。随着肿瘤细胞的发生，肿瘤患者体内某些蛋白质会发生上调或下调，或产生新的与肿瘤关联的异常蛋白， 而蛋白质芯片技术可以描绘出患者体液中所有蛋白质表达情况。根据正常与异常的蛋白质表达谱的差异，从而建立肿瘤的指纹谱，指纹谱的优点是不受任何单个肿瘤标志物的特异性灵敏度的限制，可以及早地反映肿瘤的发生、发展情况。对肿瘤的早期诊断、病情监测、疗效评估及预后均有重要意义。目前，蛋白质芯片用于肿瘤研究已经发现了包括与卵巢癌、前列腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌等相关的蛋白，并在肿瘤发病机理的研究领域亦取得了相当的进展。 3.1前列腺癌 前列腺癌是男性最常见的肿瘤，前列腺特异性抗原(PSA)是检测前列腺癌的主要标志物，但由于其特异性低，因此在前列腺癌早期诊断中的应用受到了限制。运用蛋白质芯片质谱技术能快速地从细胞裂解物、血浆、精液中鉴定出4种检测前列腺癌相关标志物：前列腺特异抗原，特异性酸性磷酸酶，特异膜抗原、前列腺特异肽。结合激光俘获微切技术，从获得的纯前列腺癌细胞裂解液中先后发现了3个上调蛋白质，用蛋白质芯片技术可以检出通过血清前列腺的特异性抗原检测不出的前列腺癌患者…。 3.2卵巢癌 卵巢癌常用的肿瘤标志物是CAl25。在80％晚期患者中CAl25升高，但在早期只有50％一60％增高，CAl25单独作为标志物的阳性预测值较小，因此需寻找特异性和灵敏度更高的标志物。用疏水性C16蛋白质芯片检测56例卵巢癌和66例非恶性肿瘤患者的血清，结果发现在质／荷比值为534、989、2111、2 251和2 465处的5个峰值同时变化，对于诊断具有重要意义。采用蛋白质谱结合生物信息学从卵巢癌患者血清中筛选出7个生物标志物，并纯化了其中3个标志物。结果显示，单个标志物的检测敏感性不如CAl25，但由4个标志物组成的蛋白质谱模型则远比CAl25敏感旧J。 3.3乳腺癌 x光透视是目前人群体检早期发现乳腺癌行之有效的方法，但当病变被检测出时已有许多患者发生了转移，从而失去了治疗时机。因此如何及早发现乳腺癌是科研医务工作者努力的目标。从乳腺癌患者的血清样品中检测出一种28．3KD的