酵母表达体系
蛋白表达概述
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源 DNA 插入，因此是表达大片段 DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
选择合适的载体需要考虑的因素： ?目的蛋白的应用 ?目的蛋白已知特定信息 ?克隆策略
目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
?对于我们来说，最常用和最需掌握的是 大肠杆菌表达系统
Factors in E.coli protein expression
vector
Strain
growth conditions
一个蛋白要成功的在 E.coli 系统表达，就是要根据表达目的在 载体，菌株和培养条件 三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到 ⑴目的基因的表达产量高 ;⑵表达产物稳 定;⑶生物活性高 ;⑷表达产物容易分离纯化。
酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化
酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【摘要】NPR1是水杨酸介导的系统获得性抗性(SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子.在SA诱导下,NPR1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合,以启动下游基因的表达.本研究通过PCR扩增获得拟南芥中NPR1基因CDS序列,经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上,并成功将其转化至Gold酵母菌株中.为利用酵母双杂交筛选NPR1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础.%NPR1 is an indispensable transcription co-factor in SAR induced by salicylic acid.Upon the SA stimuli,NPR1 is translocated into the nucleus and interacts with some transcription factors,and then starts the expression of downstream genes.In this study,CDS sequence of NPR1 was cloned into two yeast expression vectors pGBKT7 and pGADT7,and then was transformed into yeast Gold strain.This study laid a foundation for sifting other possible proteins in transcriptional complex with participation of NPR1 by Yeast Two-Hybrid and elucidating its interaction model in plant defense signal transduction pathways.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2013(027)003【总页数】4页(P213-216)【关键词】NPR1;基因克隆;酵母双杂交载体;酵母转化【作者】肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q78拟南芥NPR1是水杨酸(Salicylic acid)介导的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子，其包含的BTB/POZ结构域［1］以及锚蛋白重复序列是行使其生物学功能的基础［2］。
真核表达系统的选择和高效表达策略
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信号肽序列
• 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自 身的信号肽和酵母本身的信号肽. 有些蛋白 的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可 试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵
酵母表达系统的优点此外采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制目的蛋白的表达如gal110半乳糖诱导ph05胞外无机磷诱导和hse37温度诱导生长繁殖迅速培养周期短工艺简单生产成酵母菌用于真核基因的表达分析既具有原核表达系统生长迅速操作简单价格便宜等优点具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程因而特别适用于大量生产真核重组蛋白正是由于有这些优点使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组研究的前列是应用最为普遍的真核表达系统之一
容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。
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巴斯德毕赤酵母表达系统
• 巴斯德毕赤酵母菌株： • 一 般 用 于 外 源 基 因 表 达 的 Pichia pastoris 菌 株 有
Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168 等. 根据利用甲醇的能力, 可将巴斯德毕赤酵母分为3 型: ①Mut + 型为甲醇快利用型, 此型毕赤酵母具有完整的 AOX1 和AOX2 基因, 绝大多数毕赤酵母为Mut + 表型。 ② Muts 型,此型毕赤酵母菌(如KM71) 细胞AOX2 基因编码的 醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut型(如M2G10023) , 此型毕赤酵母AOX1 及AOX2 基因均 被敲除,为甲醇不利用型。研究发现, 蛋白酶缺陷型毕赤酵 母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源 目的蛋白的酶解。 一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用 Muts 表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢 利用型有时比Mut+ 型菌株能够达到更高的表达量。
微生物表达体系
微生物表达体系微生物表达体系是生物工程领域的重要技术，主要用于将外源基因或DNA 片段在微生物细胞中进行表达。
该体系主要包括表达载体、宿主菌、启动子、增强子、终止子、调控元件和表达产物检测等方面。
1.表达载体表达载体是用来携带目的基因进入宿主细胞并使其表达的载体。
根据来源不同，表达载体可分为质粒载体、噬菌体载体和病毒载体等。
其中，质粒载体是最常用的载体之一，具有稳定、易于操作等优点。
构建表达载体时，需要将目的基因插入到载体中，并通过一定的调控元件对基因表达进行控制。
2.宿主菌宿主菌是指用于外源基因表达的微生物细胞。
根据用途和特点不同，宿主菌可分为原核宿主菌和真核宿主菌。
原核宿主菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，真核宿主菌如酵母、霉菌等。
选择合适的宿主菌可以提高目的基因的表达水平，并降低生产成本。
3.启动子启动子是DNA分子上一段可与RNA聚合酶结合的序列，是基因表达的关键元件之一。
启动子能够识别和结合到DNA分子上的特定序列，并招募RNA聚合酶，从而启动转录过程。
不同的启动子具有不同的转录效率和调控特性，因此选择合适的启动子对目的基因的表达至关重要。
4.增强子增强子是指一段可增强基因表达效率的DNA序列。
它能够增强启动子的转录效率和稳定性，从而提高目的基因的表达水平。
增强子通常位于启动子的上游或下游，其作用效果与位置和方向有关。
选择合适的增强子可以提高目的基因的表达效率。
5.终止子终止子是一段能够终止转录的DNA序列。
它能够识别特定的转录终止信号，并招募转录后处理因子，从而终止转录过程。
终止子的作用效果与其位置和方向无关，因此在构建表达载体时需要考虑目的基因的转录终止信号，以避免出现不正确的转录终止。
6.调控元件调控元件是指能够对基因表达进行调节的DNA序列。
根据作用方式不同，调控元件可分为激活元件和抑制元件。
激活元件能够增强基因的表达效率，而抑制元件则能够降低基因的表达水平。
通过调节调控元件，可以对目的基因的表达进行精确控制。
生物技术制药重点及名词解释
生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰（RNAi）药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定（原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。
基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
c. 启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响
研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的 表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考 虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就 近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大 量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目 的基因的表达效率。
影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素
1.目的基因的特性 2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数 3.宿主的甲醇利用表型 4.分泌信号 5.产物稳定性 6.翻译后修饰
பைடு நூலகம்
b. 翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结 合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是 起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就 是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密 码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和 翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位 于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体 RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。 ５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
构建表达载体的策略
⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列
的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的 基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的 问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后 面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合 蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降 解，最后可以将融合多肽切除。
3. mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译 工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程； 4. 基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强 子序列存在。
酵母双杂交表达载体pGADT7—tTGA2的构建及酵母菌的转化
酵母双杂交表达载体pGADT7—tTGA2的构建及酵母菌的转化作者：何乐肖牧徐健阮颖来源：《安徽农业科学》2014年第30期摘要[目的]研究TGA2在植物系统获得抗性中所起的作用，阐明其作用机制。
[方法]通过PCR扩增获得拟南芥中TGA2基因全长CDS序列，克隆至pGADT7酵母表达载体，并转化至AH109酵母菌株中。
[结果]重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆，经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功。
将重组质粒又转化到AH109酵母菌中，并在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。
[结论]为进一步研究TGA2参与水杨酸诱导抗性基因表达的作用机制奠定了良好的基础。
关键词 AtTGA2；CDS克隆；酵母转化中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10467-02作者简介何乐（1990- ），女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：分子抗性。
*通讯作者。
TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域，可以结合到PR1基因启动子应答性的顺式作用元件。
它因含有TGACCG/as1（Activation seguence1）元件而得名[1-2]。
该类启动子通过与NPR1 基因协同作用参与植物对病害的防御作用。
具体作用方式为NPR1 寡聚体中的半胱氨酸残基分子间二硫键被水解还原，形成NPR1单体，NPR1单体具完整的核定位序列，使其能够转移到细胞核内并与结合在PR1基因启动子区的TGA类转录因子相互作用，调控PR基因的表达和系统性抗性（SAR）的产生[3-6]。
不同TGA成员有2种方式与NPR1互作，第一种是TGA与NPR1直接结合，正向调控PR1基因的表达和抗性的产生，两者结合的强度、保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。
如在一些植物体内，在防卫反应启动子被激活的过程中，TGA因子能与激活子序列（as1）或类as1启动子元件相结合，如拟南芥中的PR1。
毕式酵母表达常见问题及解析
毕式酵母表达常见问题及解析点击次数：433 作者：佚名发表于：2008-08-27 15:20转载请注明来自丁香园1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。
用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：1，上样时没有目的蛋白，可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了；2，目的蛋白结合在FP LC柱子上没被洗脱；3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰；4，电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看与基线相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。
2、问：我现在做的是裂殖酵母表达，表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法，但我转化了好几次都没有结果，是否也可以用电转化，在多克隆位点把质粒线性化？参考见解：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。
化学转化法对酵母转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。
查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。
3、问：我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?参考见解：对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒（比如９K等）的菌作为对照，诱导过程中同样加入甲醇，诱导的时间均一样，每次样品都会有一个对照。
几种表达系统的比较
几种表达系统的比较生物技术通报・综述与专论・BIOTECHNOLOGY BULLETIN2002年第2期几种表达系统的比较吴丹仇华吉童光志(中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150001) 摘要: 随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展,许多有应用潜力的蛋白分子有待开发。
不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键。
对细菌、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞4种表达体系作一概述,并讨论各自优缺点及常见问题。
关键词: 表达系统大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞ComparisonofSeveralExpressionSystemsWuDan QiuHuaji TongGuangzhi(NationalKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnologynVeteriResearchInstitute ChineseAcademyofAgricultSciencesAbstract: Withthedevelopmentofrecombinant,manytypesofproteinthathavepotential valuesneedtobeproduced.expressonlevelsamongdifferentproteinex2pressio nsystems.Soit’scriticaltosystemforproteinproduction.Thisreviewwillsum2m arizetheadvantagesand,insectandmammalianexpressionsystems,andalsodis cussthesolutionstoKeywords Ecoli Yeast Insectcells Mammaliancells 随着生物化学和分子生物学技术的发展,使人们得以更深入地了解蛋白质分子的一级和二级结构,这样就可以有目的的进行改造,创建新的有价值的蛋白质分子。
常用的蛋白质表达体系
常用的蛋白质表达体系
常用的蛋白质表达体系有多种，包括原核细胞体系、哺乳动物细胞体系和酵母细胞体系。
在原核细胞体系中，常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）和单核细胞（S. cerevisiae）。
大肠杆菌是最常用的原核表达宿主，具有生长快、易操作、高产量的优点。
通过将目标基因插入质粒中，然后将质粒转化到大肠杆菌中，利用其自身的表达机制来产生蛋白质。
单核细胞是酵母菌的一种表达宿主，相比于大肠杆菌，其优点包括可以进行异源蛋白质糖基化、易扩展培养规模等。
哺乳动物细胞体系是一种常用的真核蛋白质表达体系，可用于表达复杂的蛋白质，尤其对于需要正确的蛋白质修饰的研究非常重要。
哺乳动物细胞常用的表达宿主包括CHO细胞、HEK293细胞等。
CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是最常用的哺乳动物细胞表达系统之一，具有高产量和稳定的表达特点。
HEK293细胞（Human Embryonic Kidney 293 cells）也广泛用于蛋白质表达，其优点包括易于培养、高表达能力和适用于多种蛋白质修饰。
另外，酵母细胞体系也是常用的蛋白质表达体系。
酵母细胞表达宿主包括酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赢酵母（P. pastoris）。
酿酒酵母是一种单细胞真核生物，具有低成本、易于操作和较高的蛋白质产量的优点。
而毕赢酵母则适用于表达高产量的蛋白质和进行复杂的蛋白质修饰。
总之，不同的蛋白质表达体系有各自的优缺点，研究人员可根据需要选择合适的表达宿主进行蛋白质表达研究。
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毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢.为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株,可占可溶性蛋白的 30％以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97％的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰:酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的(50—150 个甘露糖残基）短得多。
菌株:GS115 （ Mut+, Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子,紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达,Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签）胞内表达型载体：pPICZ A，B，and C，一：分子克隆1。
设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13—pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C)2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM）：4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0。
5μlO up to 50μlddH2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3。
双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl）DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1％的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离，并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1：9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。
转化到克隆型感受态(DH5α和Top10)，使用低盐LB培养基,加入25 μg/ml Zeocin，双酶切法鉴定重组质粒后，送测序。
双酶切鉴定体系（10μl）DNA(空载体或目的基因）6μlBamHⅠ0。
5μlXholⅠ0.5μl10×Buffer K 1.0μl二：线性化重组质粒1.提取重组质粒20ml低盐LB培养基(25 μg/ml Zeocin），提取150ul重组质粒2.重组质粒线性化体系：重组质粒线性化体系（80μl)重组质粒70μlSac1/PmeⅠ2μlBuffer 8μl37℃水浴酶切过夜(约12—24小时），取0.5—1ul酶切后质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳检测,可冻存在—20℃。
3. 线性化产物的浓缩(若回收的线性化质粒浓度大于100ng/ul,则不需要浓缩，50ml酵母培养液得到200ul感受态细胞，使用10ul线性化质粒+100ul感受态进行电转）(1）65℃，20min灭活限制性内切酶（2)加入等体积（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）,振荡均匀，RT，12000rpm,离心1min，取上清。
(3)加入等体积氯仿，振荡均匀,RT，12000rpm,离心1min，取上清。
(4)加入0.1倍体积醋酸钠(pH=5.2，3M）,2倍体积预冷无水乙醇，振荡均匀,-80℃，放置30min后，4℃，12000rpm,离心40min.(5）将沉淀用70％乙醇500ul，洗两次，14000rpm,4℃，离心10min，晾干后，加入10ulddH2O溶解即可，—20℃保存。
三: 酵母电转化感受态细胞的制备1 活化酵母菌：取出存于-20℃冰箱的GS115无抗YPD平板,挑取单克隆,划线于新的无抗YPD平板上,30℃烘箱培养16h2 挑取酵母单菌落，接种到50ml无抗YPD液体培养基，250rpm，30℃培养15h3 取50μl菌液接种于100ml培养基中，250rpm，培养至OD值在1。
2～1。
5之间.4 分装菌液至灭菌的50ml离心管，4℃，3700rpm,离心10min5 弃上清，加50ml预冷至4℃的无菌水，重悬细胞，剧烈震荡200次，4℃,3700rpm,离心1min，重复用无菌水洗一次。
6 弃上清，用2ml 1M山梨醇（1M）清洗沉淀后，加入400ul 1M 山梨醇重悬四：电转化至酵母感受态细胞中1取5µl线性化回收产物，加入至100µl新鲜制备的电转化感受态细胞中，混匀移入干净的1。
5ml EP管中（避免气泡出现）。
2取预冷于—20℃的电极杯，放在冰上。
设置电转化参数：电压1200V,时间5ms。
3将重组质粒与感受态细胞混均匀后，加入到电极杯中，等待1-2min（使细胞DNA体系与电极杯能充分接触，利于电转的成功）4立即向电转杯中加入1ml山梨醇，用移液枪充分混匀。
从电转杯中吸出液体,加入到灭菌1.5ml EP管中.30℃烘箱1h（1—2）复苏5 取出复苏的菌液，4000rpm，离心5分钟, 弃掉800µl上清.将剩余的300µl细胞重悬,涂含有25µg/ml Zeocin抗性的YPDS平板上，30℃培养箱避光，倒置培养3天。
五：(可省略直接进行小试)菌落PCR鉴定待YPDS 的Zeocin TM平板上长出单克隆后，挑取单克隆,接种于YPD液体培养基中,加25µg/mlZeocin TM抗生素。
避光培养，转速250rpm，30℃培养16小时。
酵母菌落PCR鉴定体系如下：PCR鉴定反应体系（50μl）菌液0.5μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer(10μM）1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl10×Easy Tag buffer(Mg2+ plus）5μlEasy Tag DNA Polymerase 0.5μlO up to 50μlddH2PCR反应程序设定：PCR鉴定反应流程预变性95℃ 5min变性95℃ 60sec 45 个循环退火54℃ 60sec延伸72℃ 90sec再延伸72℃ 10min保存4℃1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果.六：小试1.挑取隆菌落,接种到5ml YPD培养基，28—30℃培养过夜，全部转入20-50mlBMGY中，28-30℃培养至OD600=2—6, 4000rpm离心10min，弃上清,将菌体转入50-100ml BMMY中,加入1%甲醇诱导表达.2.若蛋白小于10kDa，分别12，24h取样，SDS-PAGE检测；一般情况,12，24，36h分别取样，SDS—PAGE检测表达情况七：重组蛋白的表达1、挑取酵母阳性单克隆菌落，接种于5ml YPD中，28-30℃培养过夜。
全部转入100ml BMGY培养基中，加抗生素Zeocin TM至浓度2ul/ml,250rpm，28—30℃摇床培养16—18h。
用紫外分光光度计测OD值为2—6。
2、将培养的酵母菌取出，分装至50ml离心管中，4000rpm， 4℃，离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入20-30ml的BMMY培养基重悬酵母菌。
3、将菌液倒入400ml培养基的2L锥形瓶中，每瓶加入2ml（体积分数为0。
5%）的甲醇，250rpm,30℃培养，诱导蛋白表达.4、每隔24小时，向瓶中加入4ml甲醇诱导（体积分数为1%），诱导96小时左右。
5、收菌:取出培养瓶，4500rpm,离心30分钟,取上清，倒入50ml高速离心管中，14000rpm，离心40min。
弃沉淀物,取上清或者破菌，进行纯化配制溶液1。
Low Salt LB Medium with Zeocin™10 g Tryptone5 g NaCl5 g Yeast Extract1. Combine the dry reagents above and add deionized, distilled waterto950 ml。
Adjust pH to 7.5 with 1N NaOH. Bring the volume up to 1 liter。
For plates, add 15 g/L agar before autoclaving.2。
Autoclave on liquid cycle at 15 psi and 121°C for 20 minutes。
3. Allow the medium to cool to at least 55°C before adding the Zeocin™ to 25 μg/ml final concentration。
Store plates at 4°C in the dark。
Plates containing Zeocin™ are stable for up to 2 weeks。
2. YPD (+ Zeocin™） Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter)1% yeast extract2% peptone2% dextrose （glucose）+ 2％ agar+ appropriate concentration of Zeocin™1. Dissolve： 10 g yeast extract 20 g of peptone in 900 ml of water.2. Include 20 g of agar if making YPD slants or plates.3. Autoclave for 20 minutes on liquid cycle。
4。
Add 100 ml of 20% dextrose (filter—sterilize dextrose before use).5。
Cool solution to ～60°C and add the appropriate amount of Zeocin ™ from a 100 mg/ml stock solution。