植物基因克隆实验总结
植物基因克隆方法
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
（1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
Antibody production Construction of Expression Library
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等
（一）已知 基因产物 的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基库
● 同源(homologous)DNA探针
植物基因定位与克隆技术
植物基因定位与克隆技术生命的基因组是由数以亿计的基因所组成，而每一个基因都拥有着许多重要的生物学功能。
在植物研究领域，基因定位与克隆技术被广泛应用于植物基因的分离、克隆和功能研究中，为科学家们提供了更深入的了解植物多样性和生命过程的机会。
植物基因定位技术是通过分析遗传连锁相连的遗传标记与感兴趣的基因间的关系来确定基因位置的一种方法。
这些遗传标记可以是单核苷酸多态性（SNP）、限制性片段长度多态性（RFLP）或微卫星标记（SSR）等。
定位分析过程需要建立一个遗传连锁图谱，并将基因的位置分配到该图谱中。
随着遗传标记和图谱的不断发展，越来越多的植物基因得以定位，这使得研究人员可以轻松地实现植物基因的图谱定位和深入研究。
植物克隆技术是一种通过DNA插入和选择筛选，使不含目标DNA片段的细菌自杀，从而获得含有目标基因DNA的单个细菌克隆的技术。
该技术的基本步骤包括DNA片段的制备、载体选择、DNA插入、转化和筛选。
利用克隆技术，科学家可以克隆任何感兴趣的植物基因，并进行进一步研究。
利用克隆技术，科学家们已经成功地枚举出了许多重要的植物基因。
植物基因定位和克隆技术的应用在植物育种和基因工程方面有着重要的地位。
研究植物基因定位可以提供植物多样性和特性的基本知识，帮助育种者选择最佳配对植物，促进多样性和适应性的提高。
另外，克隆技术提供了一个强有力的技术平台，使得研究者可以研究和使用各种巨大优势植物（比如转基因植物）来进行研究和创造。
植物基因定位和克隆技术在植物科学研究和开发中扮演着重要角色。
促进这些技术的进一步发展，将有助于进一步加强植物多样性、新型植物品种的开发和农业的发展。
我相信，我们只有更深入、更全面地了解植物基因定位与克隆技术的原理和应用，才能更好地掌握和运用这些技术。
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
科研项目总结与成果展示
科研项目总结与成果展示一、项目背景本项目是我校生物学院在生物技术研究方向上的一项重要科研项目。
随着生物技术的迅猛发展，生物学领域的研究与应用也日益受到人们的重视。
本项目以提高植物抗逆性和生产力为目标，利用分子生物学和生物技术手段对植物抗逆性和生产力相关基因进行深入研究，为提高作物产量和品质提供理论和技术支持。
二、项目内容1. 研究对象本项目选择小麦、水稻和玉米等重要农作物为研究对象，通过现代分子生物学和生物技术手段，对植物抗逆性和生产力相关基因进行克隆、表达及功能分析。
2. 研究方法本项目采用了一系列现代生物技术手段，包括PCR扩增、基因表达载体构建、植物转化、基因组编辑等，对目标基因进行深入研究。
同时，利用生物信息学分析工具对基因功能进行预测和分析，为后续实验设计提供理论支持。
3. 研究成果通过团队的共同努力，本项目取得了一系列重要的研究成果。
首先，我们成功克隆了数十个与植物抗逆性和生产力相关的基因，并对其进行了结构和表达特征的深入分析。
其次，我们利用基因表达载体对目标基因进行了定向转化，成功构建了一系列植物转基因株系。
此外，我们还利用CRISPR/Cas9等技术对植物基因进行了定点编辑，实现了对植物基因的精准调控。
这些成果为今后植物抗逆性和生产力的提高提供了重要的理论和技术支持。
三、项目意义通过本项目的研究，我们不仅深入了解了植物抗逆性和生产力相关基因的结构和功能特点，也为今后的植物育种和生产提供了新的理论和技术支持。
这些成果对于提高作物产量和品质、改善农作物抗逆性具有重要的现实意义。
四、成果展示1. 论文发表在本项目中，团队成员共发表了10篇SCI核心期刊论文，其中包括5篇一作论文和5篇通讯作者论文。
这些论文主要涵盖了植物抗逆性和生产力相关基因的克隆、表达和功能分析等方面，为本项目的研究成果进行了全面的展示。
2. 学术报告项目团队成员还先后在国内外多个学术会议上做了相关研究成果的报告，得到了专家和学者们的一致好评。
克隆技术知识点总结
克隆技术知识点总结克隆技术是现代生物技术领域中的重要分支，通过对细胞或生物体进行复制，可以获得与原始个体遗传信息相同的克隆个体。
本文将从克隆技术的定义、分类、应用，以及伦理道德等方面对克隆技术的知识点进行总结。
一、克隆技术的定义克隆技术是指通过人工手段复制或产生与原始个体遗传信息相同的生物个体。
克隆技术可以分为两种形式：基因克隆和生物体克隆。
基因克隆是指通过重组DNA技术获得具有相同遗传信息的DNA分子，而生物体克隆则是通过复制细胞或胚胎来获得与原始个体相同基因组的生物个体。
二、克隆技术的分类根据克隆技术的不同方法和手段，可以将其分为以下几种类型：1. 重组DNA技术克隆：通过将目标基因插入到载体DNA中，进而将其转化到宿主细胞中，使得宿主细胞表达目标基因并进行大量复制。
2. 基因工程克隆：通过DNA分子的重组和转化，将外源基因导入到受体生物体中，使得受体生物体表达和遗传外源基因。
3. 细胞克隆：通过体细胞核移植或分裂的方法，复制出与原始细胞基因相同的细胞，实现细胞的无性繁殖和扩增。
4. 动物体克隆：通过体细胞核移植等方法，复制出与原始生物体基因相同的生物个体。
5. 植物体克隆：通过组织培养、离体培养等方法，将植物组织进行分裂和再生，得到与原始植株基因相同的新个体。
三、克隆技术的应用克隆技术在各个领域都有广泛的应用。
以下是其中一些主要领域的应用：1. 医学研究：克隆技术在医学研究中可以用于制备大量含有特定基因的重组蛋白，用于疾病的诊断和治疗研究。
2. 农业领域：通过克隆技术可以获得优良农作物的纯合株系，提高农作物的产量和抗病虫害能力。
3. 物种保护：对于濒危物种而言，克隆技术可以通过细胞克隆或动物体克隆的方式，复制出与原始物种基因完全相同的个体，以保护珍稀物种。
4. 药物研发：通过克隆技术可以制备大量含有特定基因的动物模型，用于药物研发和毒性测试。
5. 人类生育领域：体细胞核移植技术为不育夫妇带来了希望，使得他们可以通过克隆技术获得自己的后代。
芦笋IPT基因的克隆和转基因植株的生物学性状分析
芦笋IPT基因的克隆和转基因植株的生物学性状分析随着基因工程技术的不断发展和进步，越来越多的植物基因被克隆和利用，被应用于生产和科研中。
其中，IPT基因就是一个重要的例子。
IPT基因可以促进植物细胞分裂，提高植物生长速度和质量，对于农业生产和食品工业来说都具有重要的意义。
本文将介绍芦笋IPT基因的克隆和转基因植株的生物学性状分析。
一、IPT基因简介IPT（isopentenyl transferase）基因是负责合成植物生长素细胞分裂因子的关键酶，是利用基因工程技术进行转基因的重要目标。
IPT基因以其稳定性和可调控性，被广泛应用于农业生产、药品研发等领域。
二、芦笋IPT基因的克隆芦笋是一种重要的蔬菜，被广泛栽培。
为了提高芦笋的生长速度和产量，研究人员利用PCR技术对芦笋IPT基因进行了克隆，并将其插入转载体中，构建了芦笋IPT基因的表达载体。
该载体能够被作为受体的植物吸收并表达IPT基因，促进植物细胞分裂和生长。
三、转基因植株的生物学性状分析经过长时间的培养，研究人员获得了多种转基因芦笋，其中包括IPT基因转基因芦笋。
为了评估这些转基因芦笋的生长性状和生物学性状，研究人员进行了一系列的实验和观察。
3.1 生长速度通过比较转基因芦笋和野生型芦笋的生长曲线，研究人员发现，在相同的培养条件下，转基因芦笋的生长速度要明显快于野生型芦笋。
这说明IPT基因可能比较理想地解决了芦笋生长速度慢的问题。
3.2 节间长芦笋节间长是判断芦笋是否优质的标准之一，研究人员测定了转基因芦笋和野生型芦笋的节间长。
结果显示，转基因芦笋的节间长上也有一定的改变，但是这种改变并不是很明显，且各个转基因植株的节间长差别也比较大。
3.3 蛋白质含量为了评估转基因芦笋的食用价值，研究人员比较了转基因芦笋和野生型芦笋的蛋白质含量。
结果显示，转基因芦笋的蛋白质含量略高于野生型芦笋，但是差异并不是很明显。
3.4 其他性状除了上述三个主要的生物学性状，研究人员还对转基因芦笋进行了其他方面的实验。
植物的克隆与繁殖方式
植物的克隆与繁殖方式植物的克隆与繁殖方式是植物生命力的表现，也是植物生物学中的重要研究领域。
通过克隆与繁殖，植物可以迅速繁衍后代，适应环境变化，增强种群的竞争力和适应性。
本文将从植物克隆的定义、克隆的基本原理、植物的主要克隆方式以及植物的其他繁殖方式等方面进行探讨。
一、植物克隆的定义植物克隆是指通过非性别繁殖产生的新个体与母体具有相同的基因组合，并且不依赖于花粉和卵细胞的结合。
克隆可分为无性生殖和有性生殖两类。
无性生殖是指植物通过无性生殖器官繁殖，如植物的根茎、克隆体和萌芽等；有性生殖是指植物通过有性生殖器官如花粉和卵细胞结合繁殖。
二、克隆的基本原理植物克隆的基本原理是植物体内存在具有分裂能力的组织细胞，通过细胞分裂和器官发生的过程，可以形成独立的个体。
这些组织细胞具有相同的遗传信息，随着细胞的分裂，新的个体逐渐形成。
三、植物的主要克隆方式1.根茎克隆：根茎克隆是指植物的根部发育成为具有克隆能力的结构，从而形成新的个体。
例如，竹子的地下茎是一种常见的根茎克隆结构，它们能够长时间地存活并产生新的竹笋。
2.萌芽克隆：萌芽克隆是指植物通过侧芽或顶芽的发育形成新的个体。
例如，土豆植物的根茎部分会产生新的侧芽，这些侧芽可以长成新的土豆植株。
3.离体培养：离体培养是一种人工的植物克隆方法，通过将植物的组织切割并培养在适宜的培养基上，可以形成新的植株。
这种克隆方式常用于研究和生产中，例如繁殖珍贵的植物品种或进行基因工程实验等。
四、植物的其他繁殖方式除了克隆方式，植物还可以通过其他的繁殖方式进行生殖。
这些方式包括：1.有性生殖：有性生殖是指植物通过花粉和卵细胞的结合形成种子。
这种方式包括传粉、授粉和花粉管的生长等过程。
有性生殖能够产生具有遗传多样性的后代，提高物种的适应性。
2.孢子繁殖：孢子繁殖是植物通过孢子产生新个体的繁殖方式。
植物的孢子是通过间接发育形成新的个体，例如苔藓植物的孢子会发育成为新的苔藓植株。
五、总结植物的克隆与繁殖方式是植物生物学的重要研究内容，也是植物生存和适应环境变化的一种重要方式。
制作蓝色玫瑰实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景玫瑰，作为世界上最受欢迎的花卉之一，以其绚丽的色彩和独特的芬芳而著称。
然而，传统的玫瑰品种多为红色、粉色、白色等，蓝色玫瑰作为一种罕见且极具魅力的品种，一直以来都备受人们喜爱。
然而，自然界中并没有真正的蓝色玫瑰，因此，如何人工制作出蓝色玫瑰成为了一个有趣的课题。
本实验旨在通过化学染色方法，尝试制作出蓝色玫瑰。
二、实验目的1. 探究化学染色方法在制作蓝色玫瑰中的应用效果。
2. 优化染色工艺，提高蓝色玫瑰的观赏价值。
3. 为花卉行业提供一种新的花卉品种。
三、实验材料1. 玫瑰花：选取新鲜、无病虫害的玫瑰花朵作为实验材料。
2. 染色剂：选取具有蓝色染料成分的化学试剂。
3. 实验器具：剪刀、烧杯、滴管、酒精、蒸馏水等。
四、实验方法1. 染色剂配制：根据实验需求，将蓝色染料与蒸馏水按照一定比例混合，配制成蓝色染色液。
2. 染色过程：a. 将玫瑰花朵放入烧杯中，用剪刀剪去花梗，使花朵充分浸入染色液中。
b. 控制染色时间，根据实验需求调整染色时间，一般控制在30分钟至1小时之间。
c. 染色结束后，用酒精清洗玫瑰花朵，去除多余的染色剂。
d. 将清洗后的玫瑰花朵放入蒸馏水中浸泡，使其充分吸水，恢复花朵原有的形态。
3. 观察与记录：a. 观察染色后的玫瑰花颜色变化，记录实验结果。
b. 比较不同染色时间、不同染色剂浓度对玫瑰花颜色的影响。
五、实验结果与分析1. 实验结果表明，通过化学染色方法可以成功制作出蓝色玫瑰。
染色后的玫瑰花呈现出蓝色或蓝紫色，具有较好的观赏价值。
2. 实验中发现，染色时间对玫瑰花颜色的影响较大。
染色时间过短，染色效果不明显；染色时间过长，可能导致玫瑰花颜色过深，影响观赏效果。
因此，在实验过程中，需要根据实际情况调整染色时间。
3. 实验中还发现，染色剂浓度对玫瑰花颜色也有一定影响。
染色剂浓度过高，可能导致玫瑰花颜色过深；染色剂浓度过低，染色效果不明显。
因此，在实验过程中，需要根据实际情况调整染色剂浓度。
植物基因启动子的克隆及其功能研究进展
植物遗传资源学报2008,9(3):3852391Journal of Plant Genetic Res ources植物基因启动子的克隆及其功能研究进展聂丽娜1,2,夏兰琴1,徐兆师1,高东尧1,李 琳1,2,于 卓2,陈 明1,李连城1,马有志1(1中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京 100081;2内蒙古农业大学农学院,呼和浩特 010019) 摘要:启动子在植物基因表达调控过程中起着重要作用。
对于植物基因启动子的克隆及其功能研究有助于了解信号传递途径和基因表达调控模式,为植物转基因工程研究提供理论依据。
本文综述了植物基因启动子的基本结构、类型、克隆方法及功能研究进展,着重介绍了广泛应用于转基因工程的诱导型启动子及启动子功能分析,展望了今后植物启动子的研究方向。
关键词:植物基因启动子;诱导型启动子;克隆;功能分析Progress on Clon i n g and Functi onal Study of Pl ant Gene Pro motersN I E L i 2na 1,2,X IA Lan 2qin 1,XU Zhao 2shi 1,G AO Dong 2yao 1,L IL in1,2,Y U Zhuo 2,CHE N M ing 1,L IL ian 2cheng 1,MA You 2zhi1(1N ational Key Facility for C rop Gene Resources and Genetic I m prove m ent/Key L aboratory of C rop Genetics and B reeding,M inistry of A griculture /Institute of C rop Sciences,Chinese A cade m y of A gricultural Sciences,B eijing 100081;2College of A grono m y,InnerM ongolia A gricultural U niversity,Huhhot 010019) Abstract:Pr omoters p lay an i m portant r ole in the p r ocess of p lant gene exp ressi on and regulati on .The studyon the p r o moter cl oning and its functi onal investigati on contributes t o understand the signal transducti on pathways and gene exp ressi on regulati on model,and offers theoretical basis f or transgenic engineering .This paper revie ws the basic structure,types,cl oning methods and the functi on of p lant gene p r omoters,es pecially inducible p r omoters and their functi on analysis app lied widely t o transgenic engineering .I n the end,this paper deals with the future re 2search and devel opment p r os pects of p lant p r omoters .Key words:Plant gene p r o moter;I nducible p r omoter;Cl oning;Functi on analysis收稿日期:2008204220 修回日期:2008206216基金项目:国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(2006AA10Z115,2007AA10Z130);国家自然科学基金项目(30700504)作者简介:聂丽娜,硕士,研究方向为分子生物学通讯作者:徐兆师,助理研究员,博士,研究方向为分子生物学。
本氏烟草KANADI基因克隆及表达载体的构建
本氏烟草KANADI基因克隆及表达载体的构建本氏烟草KANADI基因克隆及表达载体的构建摘要：本实验的目的是通过基因克隆技术，构建本氏烟草KANADI基因的表达载体，为后续研究提供基因功能的解析平台。
首先，从本氏烟草中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增目标基因的编码区域。
然后，将目标基因克隆至表达载体pCAMBIA1300上，并通过PCR验证克隆的正确性。
最后，定向限制性酶切验证克隆插入方向，并利用大肠杆菌DH5α进行转化。
本文详细介绍了基因克隆实验的步骤和结果，为后续的基因功能研究奠定了基础。
关键词：本氏烟草；KANADI基因；基因克隆；表达载体；RT-PCR引言烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物之一，也是遗传工程研究的常用模式植物。
在烟草领域的研究中，基因克隆技术被广泛应用于揭示基因功能和调控机制。
本氏烟草是常见的品种之一，研究其基因功能对于揭示烟草生长发育和耐逆性机制具有重要意义。
方法1. 烟草样品的处理：从本氏烟草中取一整片叶片，细化后转移到液氮中保存。
待使用时，将叶片放入离心管中，加入适量的TENK缓冲液和RNase酶，通过离心将液体剔除。
2. RNA提取：将上一步处理过的样品加入TRIzol试剂，反复混合后静置片刻，然后加入氯仿，并通过离心将上清液收集到新的离心管中。
3. 反转录：根据试剂盒说明，将提取的RNA反转录为cDNA。
通过热循环反应，在合适的温度条件下制备出目标基因的cDNA。
4. 扩增目标基因：利用PCR技术，以cDNA为模板，使用目标基因的外显子上下游引物进行扩增。
调整PCR反应体系和条件，获得良好的扩增结果。
5. 载体构建：将扩增的目标基因片段与表达载体pCAMBIA1300连接。
利用限制性酶切酶将目标基因和载体剪切开，并进行连接和接头处理。
6. PCR验证：以获得的克隆为模板，使用目标基因的引物进行PCR反应。
通过PCR产物的大小验证克隆的正确性。
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2015-2016第二学期生物科学实验（植物基因克隆）实验总结班级：13级生物科学2班学号：1312022005 姓名：邓伟强日期：2016年6月10日一、实验原理及方法：实验原理：基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。
通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
实验方法及过程：1. CTAB法提取水稻基因组DNA配制CTAB溶液：(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：（24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.）2. 配置琼脂糖缓冲液：10×TBE Buffer配制方法：每组需要：称量下列试剂，置于1 L烧杯中Tris：108 gNa2EDTA·2H2O：7.44 g硼酸：55 g向烧杯中加入约800 ml的无菌水，充分搅拌溶解。
加无菌水将溶液定容至1 L后，室温保存。
用时稀释。
3. 开发设计引物LOC_Os02g42310Chromosome 2: 25,442,875-25,450,093OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressedOryza sativa JaponicaGCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa IndicaGCA TA TGTCAACA TCTCA TCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAA TCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACA TACA TA TGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa JaponicaGCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAA TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA TOryza sativa IndicaGCGCCGGAGACGAAGA-----------------A TTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTA TAA TTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTA TOLIGO start len tm gc%any3'seqLEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTC RIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTTLength：201 japonica, 193 Indica4. PCR反应体系10×扩增缓冲液：每管：2 ul 共需：24uldNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6ul模板DNA ：每管3 ul，共需36ulTaq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul引物1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。
两种引物各6管。
引物1、2代表的体系分别加灭菌水71.4ul 至120 ul，分装6个ep管。
5. PCR反应程序95℃预加热5分钟，95℃30秒钟56℃30秒钟35循环72℃30秒钟72℃10分钟16℃5分钟总时长：1小时35分钟6.琼脂糖凝胶电泳制胶：称取1.6g琼脂糖于配好的160mlCTAB溶液（稀释10倍后的）中，在微波炉中加热溶解，冷却后，加入3ul的核酸染色剂（BE）。
倒胶：插入梳子，摇匀之后倒胶（1LTBE缓冲液，淹没琼脂），避光静置大概20min。
点胶：垂直拔掉梳子，把凝好的胶取出来放在有与制胶同浓度TBE缓冲液的电泳槽中。
在第一个胶孔中加入maker，作对比。
上样：取2ulLoadingBffuer（一种沉淀剂，使点胶后样品沉到胶孔底部不浮上来）混匀10ul的DNA样品。
用移液枪打入胶孔。
电泳：电压电流(100V、100mA)跑40min。
7．紫外灯下观察条带条带清晰一段说明含DNA多。
8. 切胶回收（1）切胶，然后加入胶的三倍体积的Buffer GA（若小于300bp ，按1：5）本组切下的三份胶均为0.15g，分别加入了450ul的Buffer GA（2）55度水浴10分钟，期间摇晃2~3次（3）加入200ul Buffer BL于离心柱，12000rpm离心30秒，弃上清（4）将第2步得到的溶液中加到离心柱中，静置2分钟，12000rpm离心30秒，弃上清（5）往离心柱加入500ul的rash Buffer ，静置2分钟，12000rpm离心30秒，弃上清。
（6）重复（5）（7）12000rpm 离心1分钟（空管离心去乙醇）（8）将离心柱转移到一干净的1.5毫升离心管中，保持离心管开放状态5~10分钟（挥发乙醇）（9）加20~60ul的Elution(洗脱液)，65度预热，静置2分钟(10)12000rpm离心2分钟，保存在-20度冰箱9. LB培养基（用于培养大肠杆菌）：酵母提取物 5 g/L胰蛋白胨10 g/LNaCl 10 g/L琼脂15g（固体）Amp：100ug/ml10. T-载体连接：（1）将回收PCR产物与T-载体连接PMD 18-T Vector 0.5ulSolution I 2.5ulPCR 回收产物2ul总5ul（2）离心至底部（3）PCR 仪中16度反应90分钟。
（或者4度过夜连接）11. 大肠杆菌感受态的热激转化：取出感受态细胞于冰上化冻后，加入T载体连接产物，轻轻摇匀后在冰上放置30 min。
移至42℃水浴中热激90 sec，再迅速放回冰上冷却5 min。
加入600 μl不含抗生素的LB液体培养基于37℃振荡培养1 h。
活化后的菌液涂布于含相应抗生素的筛选平板上，37℃培养过夜。
提取单克隆：在筛选平板上选取单个稍大的白色菌落。
在超净工作台上，吸取500ul液体加Amp 的LB 培养基于EP管中，用最小的枪头挑取平板上的选取一个白色菌落，伸入LB 液体中抽吸混匀，摇菌培养5h。
12. 检测：利用PCR引物进行菌液PCR检查，再次进行电泳，紫外灯观察条带（观察结果见实验结果），阳性克隆送测序公司测序。
二、实验结果与分析：实验结果：实验成功，如图：实验结果分析：本组实验的DNA使用的是上一组提取保存备用的。
最后得到的实验结果如图，在紫外灯下观察到了清晰的条带说明实验达到了预期的效果，实验成功。
实验最后由于上一大组的已经测过序了，所以我们大组并没有拿去生物公司测序。
三、讨论：由于本次实验是分为两组，按照加引物1为一组，引物2为一组，每组反应体系为6ep管。
实验过程由全部人员一起操作完成，在配置试剂，配反应体系等时，小组成员进行了分工合作，由于每步上并不能保证绝对无误，所以在实验过程中有很多需要注意的地方，并进行如下讨论：1、本大组直接从第三步进行了实验，没有进行第一步提取DNA，本组直接使用的上一组保存备用DNA的。
2、第四步中，加反应体系时，由于两个人进行操作，一人负责引物1、一人负责引物2，在使用移液枪时由于使用不规范（比如量度没有调节准确，枪头没有固定好等），可能会导致误差，以致在紫外灯下观察时得到的不是清晰的条带，，扩增得到的DNA不多，就会影响后续过程比如T-载体的连接。
因为反应体系中所加的量很少，以微升来计，所以操作时要特别注意。
3、第六步中，在进行琼脂糖凝胶电泳时，插入梳子是在靠近负极（黑头），上样时要注意，在将样品加入到胶孔中时，可以先在一次性手套上混匀，用移液枪将样品打入时，要看清胶孔，不能让样品溢出，也不能插得太深而把胶孔弄破。
4、第七步中，将跑完电泳的琼脂糖凝胶在紫外光灯下观察，观察到只有前六个孔跑出的条带清晰，后六孔条带没有明显清晰的一条，所以切胶时只切了前六孔跑出的一条条带，因为清晰条带扩增的DNA多。
后六条孔没有跑出一条清晰的条带这可能跟反应体系时加料不准确以及点样时操作不当有关。
总之，实验过程是环环相扣的，上一步的操作失误会影响下一步的操作，所以我们应该要求自己每一步都要细致认真。
5、第九步中，配培养基需要配固液两种，试剂和材料见第九步，液体培养基不加琼脂。
6、第十一步中，有的操作比如热击90秒，需要精确计时，这就要求小组成员之间一人操作，一人计时。
而有些操作需要在超净工作台上完成（消毒工作要做好），在操作前要先将超净工作台开紫外灯灭菌（至少10分钟），紫外灯有辐射，不能靠太近。
活化后的菌液于超净工作台涂布时要靠近酒精灯操作，如果操作不当染菌了，会对后续的实验造成影响。
得不到白色大肠杆菌菌落，就不能提取单克隆。
四、个人实验体会：(与别人类似的实验比较，你的实验方法与结果的优点与缺点)实验操作一定要细心谨慎，比如在进行电泳的时候，稍不留神可能会溢出或插的太深。
因前期实验失败，只能用上一组保存备用的DNA，实验操作问题还需要自身改进。
使用PCR扩增方法较为便捷，灵敏度高，简洁迅速，对样本纯度要求低，很适合学生进行实验室操作。
进行这个实验的时候，正好是挑战杯校赛的关键阶段，很多实验操作都是组内同学完成了，自己参与度较低，在这个他们看不到的地方跟他们说一声谢谢。
也十分感谢老师的悉心指导。
我自己是个实验弱，在做实验方面差很多，多亏了老师和同学们一直以以来的帮助和指导。