ELISPOT酶联免疫斑点分析
elispot的原理及应用
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
结核病血清学诊断进展
结核病血清学诊断进展结核病的细菌学检查目前是结核病实验室诊断的金标准。
由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。
随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA 片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，需要相应的检测设备和检测费用高未能广泛推广。
血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器，已有多种纯化的特异性抗原可采用，可以发展成自动化检测，尤其是对痰培养阴性和肺外结核病有较为重要的辅助诊断价值，受到广泛的重视。
本文从靶抗原的选择和检测技术的改进等方面综述了结核病血清学诊断的现状和进展。
抗原的选择特异性的抗原是提高血清学检测敏感性、特异性的重要环节。
应用于血清学诊断的理想抗原应具有种的特异性及强的免疫原性。
尤其是结核分枝杆菌全基因组序列测定以后，单克隆抗体、分子生物学、蛋白质组学和比较基因组学等技术的应用，已获得多种纯化和特异性的诊断抗原。
现将当前最受关注的抗原及其临床评估结果归纳如下：1.脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。
有关LAM抗原的应用报道很多, Antunes等用美国生产的结明(MycoDot TM)试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%，特异性为92.4%，认为检测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。
2.A60(antigen 60) A60是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多糖的复合抗原。
Wu等用ELISA法检测了178例活动性肺结核患者和151例其他疾病患者血清中的IgG A60，根据受试者工作特性曲线(ROC)取261.2单位为截切值(cutoff point)，其敏感性和特异性分别为49.4%和79.5%，认为胸部X片异常的患者结合IgG A60阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。
酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及其应用研究进展
者方 面 具有 ９％ ９ 的符 合 率 。当 比较 Ｔ Ｔ方 法和 自 Ｓ
建 Ｅ ＩＰ Ｔ方 法 时发现 ， ６ 的 Ｔ Ｔ阳 性 受试 者是 ＬＳ Ｏ ３％ Ｓ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ阴性 ， ２ 的 Ｔ Ｔ阴 性 受 试 者 是 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｌ ＳＯ １％ Ｓ ＬＳ Ｏ 阳性 。另 外 ， ８ 的 Ｅ ＩＰ Ｔ Ｍ Ｔ阴性 受 试 者 是 ７％ ＬＳ Ｏ— Ｐ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｂ Ｇ阳 性 ， 这 些 人 中 大 部 分 都 接 种 过 Ｌ ＳＯ —Ｃ
胞 中检 出 １ 分 泌待 检 Ｃ 个 Ｋ的细 胞 ， 其灵 敏 度 非 常 高 。 为其 使用 了识 别 Ｃ 子 中 ２ 不 同表 位 因 Ｋ分 个 的 ２种 单克 隆抗 体 ，因而 这种 方 法有 着 高度 的特
异性 ［。 过显 色 反应 ， ５通 ］ 在细 胞 分泌 可溶 性 蛋 白的 相应位 置 上显 现清 晰 可辨 的斑 点 ，可 直接 在 显 微 镜下 人工 计数 ，或通过 Ｅ ＩＰ Ｔ分 析 系 统对 斑 点 Ｌ ＳＯ
领 域 。本 文介 绍 了 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ的原 理 和特 点 ，对 Ｅ ＩＰ Ｔ的应 用 研 究进 展 进行 了综述 。 Ｌ ＳＯ ＬＳＯ 关 键 词 ：酶联 免疫 斑 点 （Ｌ Ｓ Ｏ 应 用 Ｅ ＩＰ Ｔ 中 图分 类 号 ：￥ ５ ． ＋ ８ ２ ４３ 文 献 标 识 码 ：Ａ
进 行计 数 ， 进行 高通 量 筛选 ， 率远 远 高 于其他 检 效
测 方法 ［。Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ自创 立 至今 ２ ６ ＬＳＯ ］ ０多 年来 不 断发
Ａ ｓ ｙＥ ＩＰ Ｔ 技术 是利 用预 先包 被好 抗 原或抗 ｓａ ，ＬＳ Ｏ ） 体 的微量 板从 单细 胞 水平 检测 特异 性 抗 体分 泌 细 胞或特异 性细胞 因子 （ｙｏ ｉｅＣ） ｃ ｔｋ ｎ，Ｋ 分泌细 胞 的免 疫 学检测技 术 。 ９ ３年 ，ｅｇ ｉｋ 和 Ｃ ｅｋｎ ｋ １８ Ｓ ｄｗ ｃ ｔ ｚｒ ｉｓ ｙ 嘲 等根据 酶 联免疫 吸 附试验 （Ｌ Ｓ） Ｅ ＩＡ 的基 本原 理 结
ELISPOT技术的应用
的敏感 性 时可 以相差 １ ０倍 ， 以需 要 进行 标准 化和 验证 。 所 标
准 化 中 的一个 重 要 参 数 是包 被 抗 体 总量 ，一 般认 为每 孔 约 ０５ １ ｇ包被 抗体 可 以得 到理想 的斑点 。 ．～ ． ０
此技术操作在 ９ ６孔 培 养 板 上 进行 ，直 接 以培 养 板 的 Ｐ Ｆ膜 等为 基 质 ． 被 上 特 异性 单 克 隆抗 体 ， ＶＤ 包 之后 ， 培 养 在 板 孔 内加 入细胞 培养 基 、 检测 的细 胞及 抗 原刺 激 物进行 培 待 养 。在特 异性 抗 原或 非 特异 性 有丝 分 裂 原 的刺 激 下 ， Ｔ细 胞
１９ ９ ７年 ， 一 台 全 自动 化 的 Ｅ ＩＰ Ｔ读 板 机 面 世 …； 第 ＬＳ Ｏ ⑤ Ｅ ＩＰ Ｔ技 术 的应用 得 到报 道 ， 种 技术 被认 为是 细胞 免 疫 ＬＳ Ｏ 这 发展 的一 项关 键 性技 术 。 目前 ， ＬＳ Ｏ Ｅ ＩＰ Ｔ的技 术得 到 了不 断 的发 展 ， 用 前 景广 阔 。 应
就 开始 分泌 各种 细胞 因子 。 胞 因子 当 即就被 位于 细胞 下方 细
４１ 、－ 胞准 备 ① 细 胞分 离 ： ３细 由于 红细 胞溶 血 和血 小板 分 泌
的 抑制 因子能 影 响 Ｔ细 胞功 能 ，所 以 Ｐ ＭＣ Ｂ ｓ的分 离是 必 需 的 如果 经过 处理 和 分离 后红 细 胞在 细 胞沉 淀 中仍 可看 到 ，
２ Ｅ ＩＰ ＬＳ ０Ｔ 的 基 本 原 理
４１ ．． 被 规程 使 用 Ｐ Ｄ 建 议 预 湿 时 每 孔加 入 １ ｌ的 ２包 Ｖ Ｆ， ５
７ ％酒 精 来克 服 膜 的疏 水性 。避免 过 长 的孵 育 时 间 ， 酒精 ０ 因 的挥发 会 导致膜 的高疏水 性 。酒 精 必须 有效 地 被 洗掉 ， 留 残 的酒精 会 干扰 斑点 的形 成 。抗体 的选择 根据 实 验要 求 而定 ， 还 需考 虑抗 体敏 感性 等 。 品试 剂 盒在 检测 同一 个细 胞 因子 商
ELISPOT的技术优势及其在动物免疫研究中的潜力
下显色 ， 出现 紫色 （ Ｋ 待 Ａ Ｐ和底 物 的产物 ） 或红 色 （ Ｒ Ｈ Ｐ和底 物 的产 物 ） 点时 ， 明检测 的细胞产生 了 Ｃ 。此时可用计 斑 说 Ｋ 算机辅 助成像分 析系统或显微 镜计算 斑点 数 ， 用斑 点形成 并
的二抗 ， 加入 Ａ Ｐ Ｈ Ｐ Ｋ 或 Ｒ 标记 的链亲和素 ， 室温孵育 ３ 。 ｈ
（ ） Ｐ ＳＴ ｅｎ２ ４ 用 Ｂ － ｅ ．０对 ９ ｗ ６孔板 再 洗 ５ ， 入底 物 室温 次 加
本相 似 ， 即通过 生 物酶 高催化 效率 放 大反应 效果 ， 而达 到 进 很高 的敏感 度 ， 于检测微量 的抗原 或抗体 。其实 验设计 是 便
维普资讯
安徽 农 业 科 学 。ｏｍａ ｏ Ａ ｈ ｉ ｇ Ｓｉ２０ 。５２ ）７６ Ｊｕ ｌ ｆ ｎｕ Ａ ｎ．ｃ．０７３ （５ ：８２—７６ 。９３ ８３７ １
责任编辑
李布青
责 任 校对
俞 洁
Ｅ ＩＰ Ｌ Ｓ ＯＴ 的 技 术 优 势 及 其 在 动 物 免 疫 研 究 中 的 潜 力
酶 联 免 疫 斑 点 技 术 （ ｎ ｍ－ｎｅ ｍ ｎｓ ｔＡｓ ， Ｅ ｚ ｅｉ ｄＩ ｕｏ ｏ ｓ ｙ ｙ ｌｋ ｍ ｐ ａ Ｅ ｐｒ 是 ２ 世 纪 ８ 年代 中期 Ｃ ｒｓ 等 以 Ｅ Ｉ ｕｓＣ ） ０ ｒ ｏ ｚｋ ｋ ｅ ｉｙ ＬＳ Ａ技术基
本原理和方法 为基础 ， 建立起来 的一 种 既可 以在 体外进 行单 细胞 水 平 的特异 性 抗 体分 泌 细胞 检测 ， 又可 以对细 胞 因子
（ｏ ｅ ｄ ｈ ｅ ｘ ａｅ Ⅷ ） Ｈ ｒ ｒ ｉ ｒ ｉ ｓ， ｓａｓｐ ｏｄ 标记 的链 亲 和素 结合 。 底物 ， 经
酶联免疫斑点试验流程图
酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。
Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。
(仅供参考)mouse IFN-γ-Elispot说明书
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技术原理
A.用抗 IFN-γ 的单克隆抗体包被在检测孔的底部。 B.分离待检测样本的淋巴细胞。 C.将待测细胞放入检测孔中培养约 20 小时，同时加入特 异抗原。在培养期间，对特异抗原有反应的 T 淋巴细胞就会 被激活，开始分泌特定的细胞因子（如 IFN-γ），这些细胞因 子同时被板底的单克隆抗体捕获；对特异抗原没有反应的细 胞则不受刺激，也不分泌特定的细胞因子（如 IFN-γ）。 D.移出细胞，板底留下细胞因子的潜在影像。 E.这种潜在的影像可以通过酶联显色的方式变成真正的 影像——斑点。 F.每一个斑点代表了一个对特异抗原有反应的特异性 T 淋巴细胞。斑点的数目多少就反映了样本的细胞免疫的识别 状态：斑点多说明免疫识别状态好，斑点少说明免疫识别状 态差或者出现免疫耐受。
5. 酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔， 100μL/well。37℃孵育 1hr。
6. 洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/well，洗涤 5 次。 每次停留 30-60s。最后一次，在吸水纸上扣干。
7. 显色：将现配的 AEC 显色液工作液加入各实验孔，100μL/well。 室温避光静置 15-45min（在 20 -25℃，显色 25min 较合适）。若 室温低于 20℃，建议在 37℃孵箱做显色，每隔 5-10min 检查一次。
无血清培养基。如果没有，可用含 5-10%胎牛血清的
RPMI-1640 培养基代替。
骨科结核感染T细胞斑点检测(SPOT)
骨科临床应用（一）
γ 干扰素释放试验在骨关节结核病诊断中的 应用价值研究
贾红彦, 张宗德等，北京胸科医院，Diagn Microbiol Infect Dis, 2013
特点 H. Jia, et al. Diagn Microbiol Infect Dis, 2013
确诊病例（培养阳性者）、 疑似结核病（组织活检或 发现干酪性肉芽肿并且抗 结核治疗有效）和非活动 性结核病患者（确诊为其 他疾病、未抗结核治疗而 病情好转）
患者例数(%)
确诊结核 (n=12)
临床诊断结核(n=3) 确诊＋临床诊断结核 (n=15)
ELISPOT检测阳性例数 11(91.6) (%)
2(66.7)
13(86.7)
ELISPOT检测阴性例数 1(8.4)
1(33.3)
(%) 结核性骨关节炎患者ELISPOT检测结果
2(13.3)
ELISPOT检测诊断骨结核(包括确诊与临床诊断)的敏感性、特异性、 阳性预测值和阴性预测值分别为86.7%（13/15），61.9% （13/21），61.9%（13/21），和86.7%（13/15）。
结核感染T细胞斑点检测技术 （T-SPOT.TB）及其临床应用
检验科细菌室
结核病……你真正了解吗？
•肺外结核病占全部结核病的15%-20% •死亡人数占全部结核病死亡数14.1%-17.6% •上升趋势
新疆结核病疫情
• 我区仍然是全国结核病高发省区之一，每年报告肺结核 发病人数近5万例。
• 根据2010年结核病流行病学调查结果，我区活动性肺结 核患病率、涂阳肺结核患病率、菌阳肺结核患病率分别 为全国平均水平的3.3倍、3倍和3.6倍。
结核（27）
tspottb技术用于辅助诊断结核临床病例报道
T SPOT TB技术用于辅助诊断结核临床病例报道莫凌，孟成艳，张舒，金嘉琳，张文宏作者单位: 200040上海，复旦大学附属华山医院感染科通讯作者: 张文宏，Email: zhangwenhong@退修稿：0074基金项目: 国家重点基础研究发展计划（2005CB523102 ）近年来，我国结核病的发病率有上升趋势，临床上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核病，而目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与治疗带来困难。
ELISPOT （en zyme-li nked immu no spot assay,酶联免疫斑点法）技术是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞［1］。
由ELISPOT发展来的T SPOT TB （结核感染T细胞斑点试验）技术就是通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性的细胞因子IFN- Y来诊断是否存在结核感染。
1.ELISPOT技术原理该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“ RD1 ”的基因序列［2］，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。
RD1编码产生两种蛋白：ESAT-6 和CFP-10 （culture filtrate protein ）, ESAT-6 和CFP-10 作为特异性抗原刺激机体T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN- 丫。
根据这一原理，T SPOT技术利用结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌丫干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。
外周血单核细胞，结核特异的混合抗原A和混合抗原B （分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片断），对照试剂一起加入预先包被抗丫干扰素抗体的微孔培养板进行培养。
当外周血单核细胞中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌丫干扰素。
酶联免疫斑点试验、抗结核抗体平行检测菌阴性结核价值对比
酶联免疫斑点试验、抗结核抗体平行检测菌阴性结核价值对比摘要：目的：比较结核感染T斑点试验（TSOP.TB）和结核抗体试验在菌阴性结核诊断中的敏感性和特异性以及应用价值。
方法：对疑患菌阴性结核的290例患者进行前瞻性研究。
收集患者临床资料，采用TSOP.TB和结核抗体试验进行结核病的诊断，比较二者对结核病诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。
结果：290例疑患结核病患者最终确诊结核 119例。
TSOP.TB试验在敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值等方面显著优于抗结核抗体试验（P＜0.05）。
结论：TSOP.TB较结核抗体有更高的灵敏性和特异性，更适于作为结核病的筛检试验。
关键词：酶联免疫斑点试验；抗结核抗体试验；结核；诊断快速诊断和治疗是控制结核病的关键。
结核病诊断的金标准是在胸水、痰或其他临床标本中找到结核分枝杆菌。
但由于抗酸染色的敏感性和特异性差、结核菌培养时间长，限制了其在临床上的广泛应用。
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）采用的结核分枝杆菌特异性抗原为早期分泌原靶蛋白6（ESAT-6）或培养滤液蛋白10（CFP）-10，其编码基因RDI为卡介苗（BCG）和绝大多数非结核分枝杆菌所缺失，避免了结核菌素试验（PPD）出现的交叉反应，这种方法无论在敏感性还是特异性发面均得到了极大的认可。
本研究比较ELISPOT与抗结核抗体试验对菌阴肺结核的诊断价值。
1.资料和方法1.1一般资料对象2011年7月到2012年8月吉林大学第一医院呼吸科疑诊或待排除结核患者290例，年龄55-76，平均（62.78）岁。
所有患者均有反复咳嗽、咳痰伴发热等临床症状，有肺部感染的影像学表现，3次痰涂片未找到抗酸杆菌且二次痰培养均阴性。
在其他详尽检查基础上同时进行酶联免斑点试验与抗结核抗体试验。
根据检测结果综合判断分析，对疑为菌阴患者给予实验性抗结核治疗。
根据最终治疗和随访结果，进行最终确诊。
诊断标准：（1）典型肺结核临床症状和胸部Ｘ线表现；（2）抗结核治疗有效；（3）临床可排除其他非结核性肺疾病；（4）PPD强阳性，血清抗结核抗体阳性；（5）肺外组织病理证实结核病变；（6）BALF检出抗酸分枝杆菌；（7）支气管或肺组织病理证实结核病变；符合（1）-（5）的三项或（6）、（7）任意一项即可确诊。
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ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。
因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。
•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。
细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。
BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，应用德国AID的ELISPOT 酶联斑点分析系统可以对斑点进行分析得出结果。
ELISPOT 分析仪的出现解决了以下问题•哪些斑点是抗原特异性T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T 细胞研究价值）•斑点大小的意义•在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸•如何从单个细胞基础上分析•实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？几次重复实验才能使结果更有意义？简介ELISPOT技术ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。
其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。
静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。
一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。
微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。
ELISPOT技术的过去ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。
Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。
从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大小，同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。
ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单，但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在ex vivo T细胞功能研究。
要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。
早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不够、数据分析重现性低。
这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。
与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。
图一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）与传统标准薄膜（Panel B）并行实验的比较结果。
同样的人体PBMC 样品，在通过完全相同的实验，Panel A呈现较清晰的小色点。
第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证，也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。
没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题，诸如；•实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应？•斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？•能否相信斑点是由单一的细胞造成？· ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围？·如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？ELISPOT 技术的现在1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特定T细胞的体外检测技术。
藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹，ELISPOT 分析技术可提示T 细胞免疫系统的两个重要参数：抗原特定T细胞的clone族群大小；和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2。
多年来经过数十个研究团队的致力研究，对于ELISPOT分析技术本身的几个问题，也有了科学上的验证。
目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。
在适当的实验设计下，ELISPOT Cytokine 斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑点形态学与Time Response 分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。
也因为如此，ELISPOT是个免疫学上的标竿技术，它可以允许科研人员在几乎自然生理条件下，观察细胞实际分泌Cytokine的进程，进而可以得到药理学信息，阐明免疫调节药物如何影响T 细胞分泌各类cytokine的速率。
药物抑制T细胞免疫一般可通过两程截然不同的机转；使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小，或减少每Precursor T细胞的cytokine产能，而ELISPOT技术能提供双份信息。
上图：典型Elispot Plate Layout 右图：实验结果ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特定T细胞免疫学上独占鳌头。
此技术是当世唯一准许百万分之一1:1000,000的准确分析，如此强效的解析力使流式细胞技术也望其项背，以目前国内外常规的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技术的灵敏度一般限制在1:10,000。
这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究是必须的，因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频率通常低于万中取一。
此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球，解冻后PMBC与新鲜分离样品有相当的效价，没有丧失功能。
这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样，如果试验牵涉全国多个临床试验机构，病人血样可冰存并同时集中在「中央实验室」一齐被测试。
同理，一个血样或标准对照品可被分装小份，被送到不同检验中心进行测试，以交互比对，同时有利LISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化。
流式细胞intracellular cytokine技术之灵敏度仅是万中取一ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。
事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。
ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。
科学实证的本质，在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性，传统的人工计算法显然无法达到此一要求。
这就是Elispot Reader酶联斑点分析仪应运而生。
分析ELISPOT实验数据的过程中，Elispot Reader仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后储存成TIF檔；这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目，如果使用Elispot Reader分析软件，可以先设定条件，然后同时分析斑点的大小，以推估激素分泌的多寡。
预料像Elispot Reader这一类自动图像扫描分析仪器，将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点，彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题，进一步推广该技术的新颖应用。
Elispot Reader可以提供不同的数据格式，包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。
ELISPOT 未来展望据笔者的观察，ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到全新的智识。
从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。