lamp环介导等温扩增技术
lamp环介导等温扩增技术
LAMP环介导等温扩增技术是一种用于检测DNA或RNA的方法，具有快速、高度敏感和特异性等优点。下面我们来详细介绍一下这种技术的原理和应用。
一、原理
LAMP技术是一种环介导等温扩增方法，与PCR不同的是，LAMP不需要高精度的温度控制和特异性引物，只需要4-6个引物就可扩增目标序列。LAMP反应的基本步骤为：首先，在等温条件下，外部引物（F3和B3）和内部引物（FIP和BIP）结合在DNA目标序列上，形成一个环形结构；然后，在BIP的3'端内部引物（LF和LB）的作用下，DNA目标序列不断的进行扩增，最终形成一个由数以百万计的拷贝构成的扩增产物。在反应中，LF和LB作为内部补体引物，增强了反应的特异性和扩增效率。
二、优点
1、高度敏感：在LAMP扩增反应中，由于不需要复杂的环境条件和反应体系，扩增过程高效，形成的扩增产物数量极多，可以检测到非常微弱的目标DNA或RNA信号。
2、特异性强：LAMP反应需要多个引物结合于目标序列，而且引物是从多个区域的序列中选择设计的，所以扩增的产物只会与目标序列高度特异结合，不会出现交叉反应的问题。
3、环境友好：LAMP扩增只需要一个热水浴，不需要PCR反应所需的高精密温控仪器，同时反应体系中不含有有毒有害的物质，对环境及实验者均无危害。
三、应用
LAMP技术已广泛应用于临床医学、食品安全、环境检测和生物技术等领域。
1、临床医学：LAMP技术可以高效、快速、准确地检测病原微生物、基因突变和药物耐药性等，对于疾病的快速诊断和精准治疗提供了有力支持。
2、食品安全：LAMP技术可以检测微生物、病毒和其他有害物质，对于食品安全监管起到了重要作用。
3、环境检测：LAMP技术可以应用于环境污染的检测、植物病害的检测以及水质检测。
4、生物技术：LAMP技术可以用于基因组学、遗传学和分子病理学等领域的基础科研。
总之，LAMP技术作为一种新兴的DNA或RNA检测技术，具有快速、高效、经济和特异性强等优点，已成为分子生物学和生命科学领域的焦点研究。
新冠快速测试方法
新冠快速测试方法 新冠快速测试是用于检测新型冠状病毒感染的一种便捷方法。它针对新型冠状病毒的核酸或抗体进行检测，通过快速反应的原理来确定一个人是否感染了新冠病毒。下面将详细介绍几种常见的新冠快速测试方法。 一、核酸快速测试方法： 核酸快速测试是通过检测样本中新冠病毒的核酸序列来确定感染状况的一种方法。核酸快速测试有两种主要类型：RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）和LAMP （环介导等温扩增）。 1. RT-PCR： RT-PCR是目前最常用的新冠核酸快速测试方法。它通过提取病毒核酸，将其转录成相应的DNA链，然后利用聚合酶链反应来放大目标DNA区域，最后通过荧光信号来检测是否存在新冠病毒。 2. LAMP： LAMP是一种新型的等温扩增技术，与RT-PCR相比，LAMP可以在更短的时间内完成扩增反应。LAMP方法在样本中加入特定的酶和引物，通过等温条件下的多轮酶催化反应来扩增目标序列，最后通过肉眼观察扩增产物形成的悬浮状来判断是否感染新冠病毒。 二、抗体快速测试方法：
抗体快速测试是通过检测人体针对新冠病毒产生的抗体来确定感染状况的一种方法。抗体快速测试通常使用血清或唾液等样本，分为两种常见类型：免疫层析试纸法和荧光免疫检测法。 1. 免疫层析试纸法： 免疫层析试纸法是一种简便且经济的快速检测方法。它通过在试纸上加入特定的新冠病毒抗原，再将样本添加到试纸上，如果样本中存在与病毒抗原匹配的新冠病毒特异性抗体，则会发生特异性的抗体和抗原结合反应，进而形成可见的信号。例如，通常会产生线条或颜色变化。 2. 荧光免疫检测法： 荧光免疫检测法是一种高灵敏度和高特异性的新冠抗体快速测试方法。它利用荧光染料和特定的新冠抗体标记试纸。当样本加入试纸后，如果存在与新冠病毒抗体结合的新冠病毒，则会发生荧光信号，并通过设备来读取荧光信号的强度和颜色来确定感染结果。 总结来说，新冠快速测试方法主要包括核酸和抗体两种类型。核酸方法通过检测病毒的核酸序列来判断感染情况，而抗体方法则是通过检测人体产生的抗体来确定感染状态。这些快速测试方法都是为了提高新冠病毒感染的早期诊断和筛查效率，有助于及时隔离患者、做好疫情防控工作。当然，需要注意的是，快速测试方法虽然快速、方便，但其准确性和敏感性仍需进一步验证和完善，因此在使用
LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术 2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩 增 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。 2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。 可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。 目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。详见：https://www.360docs.net/doc/eb19065755.html,/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=1 1. 优缺点介绍： LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就
lamp环介导等温扩增技术
lamp环介导等温扩增技术 LAMP环介导等温扩增技术是一种用于检测DNA或RNA的方法，具有快速、高度敏感和特异性等优点。下面我们来详细介绍一下这种技术的原理和应用。 一、原理 LAMP技术是一种环介导等温扩增方法，与PCR不同的是，LAMP不需要高精度的温度控制和特异性引物，只需要4-6个引物就可扩增目标序列。LAMP反应的基本步骤为：首先，在等温条件下，外部引物（F3和B3）和内部引物（FIP和BIP）结合在DNA目标序列上，形成一个环形结构；然后，在BIP的3'端内部引物（LF和LB）的作用下，DNA目标序列不断的进行扩增，最终形成一个由数以百万计的拷贝构成的扩增产物。在反应中，LF和LB作为内部补体引物，增强了反应的特异性和扩增效率。 二、优点 1、高度敏感：在LAMP扩增反应中，由于不需要复杂的环境条件和反应体系，扩增过程高效，形成的扩增产物数量极多，可以检测到非常微弱的目标DNA或RNA信号。 2、特异性强：LAMP反应需要多个引物结合于目标序列，而且引物是从多个区域的序列中选择设计的，所以扩增的产物只会与目标序列高度特异结合，不会出现交叉反应的问题。 3、环境友好：LAMP扩增只需要一个热水浴，不需要PCR反应所需的高精密温控仪器，同时反应体系中不含有有毒有害的物质，对环境及实验者均无危害。
三、应用 LAMP技术已广泛应用于临床医学、食品安全、环境检测和生物技术等领域。 1、临床医学：LAMP技术可以高效、快速、准确地检测病原微生物、基因突变和药物耐药性等，对于疾病的快速诊断和精准治疗提供了有力支持。 2、食品安全：LAMP技术可以检测微生物、病毒和其他有害物质，对于食品安全监管起到了重要作用。 3、环境检测：LAMP技术可以应用于环境污染的检测、植物病害的检测以及水质检测。 4、生物技术：LAMP技术可以用于基因组学、遗传学和分子病理学等领域的基础科研。 总之，LAMP技术作为一种新兴的DNA或RNA检测技术，具有快速、高效、经济和特异性强等优点，已成为分子生物学和生命科学领域的焦点研究。
实验丨LAMP荧光探针方案最佳伴侣,非FEN1莫属!
LAMP荧光探针方案最佳伴侣，非FEN1莫属! 环介导等温扩增(LAMP) 技术是一种在恒温条件下进行的DNA扩增技术之一，具有高灵敏度、扩增快速等优点，结合微流控技术和多种终点检测手段方案，在医学诊断、生物安全、农业和环境监测等领域都有广泛的应用前景。 但基于LAMP扩增技术需要精准检测，还是荧光探针法更为合适，目前市面产品，某些厂商推出的主要基于Taqman探针法，而殊不知Bst DNA Polymerase具有极强的链置换功能，即便是具有5’端外切功能的Bst DNA Polymerase,LF也是会先推起退火上去的探针，而先非切割，导致荧光信号曲线不能真实反映扩增过程，所以导致LAMP扩增跑胶结果与荧光曲线表现大相径庭。 那么我们思考发现探针退火模板后，被Bst DNA Polymerase遇到推起，但在那一瞬间会形成一个瓣状结构flap，另一方面FEN1正好具有切割5’flap的酶学功能，这两者之间似乎可以联系在一起。接下来的一些实验和理论依据更加佐证了这两者具有极高的匹配度。 1.热稳定性实验结果表明，FEN1在65℃下具有最高活性(Table 1) Table 1. 不同温度下FEN1活性 TEMPERATURE ACTIVITY% 25°C< 1 % 37°C< 5 % 45°C20 % 50°C50 % 60°C90 % 65°C100 % 70℃95 % 2.我们再基于扩增引物设计探针，后续扩增过程中Bst DNA Polymerase就会遇到已形成二级结构的引物 型探针，将其推起形成5’flap结构不就可以被FEN1直接切割，从而发出荧光(Fig. 1)。 Fig. 1 LAMP结合FEN1荧光探针检测原理示意图
lamp扩增原理
lamp扩增原理 LAMP扩增原理 LAMP是一种用于DNA扩增的方法，它的全称是Loop-mediated isothermal amplification，即环介导等温扩增。与PCR（聚合酶链式反应）相比，LAMP具有更高的扩增效率和更好的特异性，因为它只需要一个酶（Bst DNA polymerase）和四个特异性的引物来进行扩增。本文将介绍LAMP的扩增原理及其基本步骤。 一、LAMP的扩增原理 LAMP的扩增原理是通过“环式扩增”来实现的，其基本过程可以分为两个阶段：第一阶段是DNA的线性扩增，第二阶段是DNA的环式扩增。LAMP的基本原理如下： 1. 首先，一组称为F3和B3的特异引物与DNA靶标结合，形成一个F3/B3复合物。该复合物在特定的温度下，通过Bst DNA polymerase的催化作用，进行线性扩增。在该过程中，F3引物与B3引物结合的区域就会形成一个双链DNA结构，该结构具有一个单股环形DNA的结构，称为“DNA花环”。 2. 在第一阶段完成后，第二组引物（FIP和BIP）与F3/B3复合物结合，即形成FIP/F3/B3/BIP的四元复合物。在特定的温度下，FIP 引物与BIP引物结合的区域就会形成一个新的DNA花环结构，这
个花环嵌套在第一阶段的DNA花环中。这个过程被称为“环式扩增”，在这个过程中，产生大量的DNA产物。 3. 在LAMP反应结束时，可以通过如凝胶电泳、荧光探针或颜色指示剂等多种方法来检测扩增产物。 二、LAMP的基本步骤 LAMP的基本步骤包括：制备反应体系、扩增反应、检测扩增产物等。 1. 制备反应体系 LAMP反应需要一个含有DNA靶标、Bst DNA polymerase、四组引物（F3、B3、FIP、BIP）和一些缓冲剂的反应体系。反应体系的配制需要考虑到反应的温度、pH值等因素。 2. 扩增反应 将反应体系加热到适当的温度，通常为60-65℃，进行扩增反应。反应时间通常为1-2小时。 3. 检测扩增产物 可以通过如凝胶电泳、荧光探针或颜色指示剂等多种方法来检测扩增产物。其中，颜色指示剂是最常用的方法之一。如果扩增产物存
lamp等温扩增技术原理
lamp等温扩增技术原理 LAMP等温扩增技术是一种高灵敏度的基于序列特异性寡核苷酸探针的新型核酸检测方法，由于其极高的灵敏度、特异性和快速性，广 泛应用于疾病的诊断与研究中。该技术的原理可以分为以下步骤：第一步：沙门氏菌DNA引物的特异性结合并扩增 LAMP等温扩增技术采用一组详细的引物设计，使其具有高度特异性，能够在目标核酸序列的正常条件下，加速酶间反应来扩增目标序列。针对沙门氏菌的DNA扩增，引物组成为2个反向外部引物、2个内部引物和一个环引物。反向外部引物的特异性结合在目标DNA序列的 外侧，内部引物则在外部引物结合后依次将产物扩增。环引物在推进 反向内外部引物的条件下，促进并加速扩增反应的进行。该技术最大 的优势在于，即使非特异性的DNA序列存在，也能在反应系统中抑制 它们的扩增，从而提高扩增产物的特异性。 第二步：单管内扩增反应 LAMP等温扩增技术在单个反应管中完成扩增，因此省去了扩增过程中由于分离和清洗产物所需的步骤，从而能够提高扩增的效率。同时，该技术利用因特异性扩增反应而产生的大量产物来实现放大反应 信号。由于其不需要复杂的设备，仅需要水槽温度控制器和能够给温 度控制提供稳定电源的仪器即可完成。整个扩增过程中，所有反应物 成分的变化均与恒定温度下运行。 第三步：利用Dye负电荷的反应性质 由于在反应中引物的选取和调额完全根据目标DNA的序列比对所 进行，因此LAMP等温扩增技术具有绝对的特异性。同时，其采用的是 特殊的Dye（反应染色），具有负电荷和荧光反应性质，在在反应完成后，在阳性结果的情况下，消耗成本非常低。而在负性结果的情况下，由于该Dye信号使读取结果清晰方便。由此，LAMP等温扩增技术结果 得到广泛的应用，例如疾病的检测、环保检测等领域，得到了广泛应用。
恒温扩增技术的原理与用途探究
恒温扩增技术的原理与用途探究即通过对靶序列的特异性扩增，使其产生大量拷贝，以达到检测水平。主要包括以下技术。环介导等温扩增技术，又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术，是由Notomi等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。LAMP的核心是具有链置换活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段（即5’端的F1、F2和F3区和3’端的B3c、B2c和B1c区，其中F2区和B2区为目的扩增片段）的4条特殊引物的设计，分别为上游内部引物（FIP，由F1c区和F2区组成）、下游内部引物（BIP，由B1c区和B2区组成）、上游外部引物（F3，由F3区组成）及下游外部引物（B3，由B3组成）。整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。⑴起始阶段：FIP的F2序列首先和模板F2c结合，引领合成互补链；随后，F3与模板F3c结合，在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有FIP的完整互补链。此单链5’端F1c和F1自我碱基配对形成环状结构。以此链为模版，引物BIP和B3以相同的方式引领另一端链合成、链替换，从而形成哑铃状结构的单链。F1c末端可自发引领补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。此产物可作为下一阶段的起始物为LAMP基因的扩增循环提供模板。⑵循环扩增阶段：引物FIP与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,；释出链游
离3c端自身成环,引发链延伸取代并释放FIP引领合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。引物BIP和FIP与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链DNA片段。LAMP灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，结果易于判定，这些优点使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。如：Suzuki、Iwata、Ihira等分别建立了巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、人类疱疹病毒6型（HSV6）的LAMP检测方法[8-10]；Iwanoto、Hara-Kudo、Seki等分别针对肺结核分支杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌建立了LAMP检测系统，并对其灵敏度和特异性进行了评价[11-13]；而Lin、Han等分别以弓形虫病、四种疟原虫疾病为研究对象，比较了LAMP与real-timePCR、nestedPCR的检测效能，证明LAMP技术可以作为流行区现场快速而简便的疾病筛选工具[14,15]。但因建立时间较短，LAMP仍存在一些不足，其中最大的缺点就是容易出现假阳性。由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下扩增，引物之间有可能互补而扩增出现非特异性条带。此外，产物鉴定只针对有或无，缺乏一定的特异性。 1989年首先报道的以转录为前提的和核酸扩增技术[16]。该技术从互补的靶核酸（一般为RNA）合成DNA分子开始，以新合成的cDNA为模版进行转录。反应系统主要涉及三种酶活性
恒温扩增技术综述
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 关键词:恒温扩增;PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展,基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中,恒温扩增技术就是在此背景下出现的.与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增(rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop—mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification,SDA)、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification,NASBA) 和解链酶扩增（helix dependent amplification,HAD）,这些技术各有特点,这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况,下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增(rolling circleamolification, RCA)是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1］,可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状DNA 完全互补）的线状单链.线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA 可用于非
思路丨LAMP 等温扩增技术常见问题总结
思路丨LAMP 等温扩增技术常见问题总结 Q1：LAMP有哪些特点？ ●仅需一种酶Bst DNA Polymerase参与； ●恒温60-65℃，30-60 min完成扩增反应； ●灵敏度高，比传统的PCR高2～5个数量级； ●操作的简便性及对仪器设备和人员要求低。 Q2：LAMP扩增引物如何设计？ Fig 1. 扩增引物设计位置示意图 设计要点： ●引物区域之间的距离： F2和B2的5'端之间的距离为120-180 bp； F2和F3以及B2和B3之间的距离是0-20 bp； 环形区域（F2的5'端到F1的3'端，B2的5'端到B1的3'端）的距离为40-60 bp。 ●引物区域Tm值： 富含GC和常规的引物Tm值为60-65°C； 富含AT 的引物Tm值为55-60°C。 ●GC含量： 在富含GC或通常区段一般为50-60%； 在富含AT区段一般为40-50%。 ●3'端避免富含AT，以避免二级结构形成。
Q3：LAMP的环引物LF或LB有什么作用？ 环引物可以结合环区域，增强扩增效率。据实验结果表明，使用环引物扩增所需的时间仅是 不使用环引物的三分之一到二分之一，可在30 min内实现扩增。 Q4：如何对RNA进行RT-LAMP检测？ 可以通过在反应体系中添加适量的逆转录酶，巨匠生物已推出耐高温逆转录酶二代（A TG#R111），耐受72℃，利于复杂长链RNA在高温下打开二级结构，进行高效逆转录。 Q5：为什么做LAMP实验经常会有假阳性产生？如何避免？ ●同一区域移液高拷贝（10^6 copies/μl 或更高）的模板，则可能会发生污染； ●由于灵敏度过高，导致引物试剂在容易污染的环境下反复开盖，极易污染气溶胶后，产 生假阳性； ●样本制备区/试剂准备区/加样区/反应区等尽可能做到分区； ●每次试验前后或者步骤之间对空气和工作区以及移液器，要用核酸清除剂或10%漂白 剂消毒清除气溶胶污染； ●引物设计设计多套作为备选，通过实验测试挑选最佳引物组。 Q6：SNP可以用LAMP法区分嘛？ 可以。可结合RNase HII（A TG#E207）酶学功能，以LF或LB为基础，在SNP位点设计MB荧光探针: /FAM/DNA-rN-DNA/Dab/，通过荧光信号检测，高灵敏度区分WT和MT。 Q7：LAMP有些哪些产物检测方式 琼脂糖凝胶电泳；荧光探针检测；核酸染料可视化显色。 Q8：LAMP荧光探针法检测是否有较好的方案？ 由于Bst DNA polymerase具有较强的链置换活性，经实验测试发现，一般Taqman探针适配
环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展讲解
生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年增刊·技术与方法· 核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段,其中PCR技术最为常用。但在应用过程中人们发现PCR技术存在一些不足,如靶基因易被污染,可能引起非特异性扩增,多种因素可以产生抑制扩增反应,扩增反应时间较长,一般需要几小时,需要比较昂贵的PCR仪,不利于在基层实验室推广应用等。2000年,日本学者Notomi等[1]建立了一种新的核酸扩增方法—— —环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP技术,该技术克服了PCR技术的一些缺点。目前已在人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测中取得重要进展,在疫病诊断领域显示出广阔的应用前景。 1LAMP技术原理 LAMP技术依赖于能够识别靶序列上6个独立区域的两对特异性引物(内引物:FIP和BIP;外引物:F3和B3和一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶,在等温条件下可高效、特异的扩增靶序列。LAMP反应过程是先由外部引物扩增出内部引物扩增所需要的模板,即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引导合成靶基因DNA 片段,由于内部引物扩增的DNA片段含有与该引物5’端DNA 片段的反向互补序列,因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构,另外一条内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应,在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构,形成哑铃状结构,如此往复循环最后形成花椰菜形状的茎—— —环结构的DNA,数量级可达109~1010拷贝,电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成,呈梯状条带。 LAMP反应体系和PCR反应体系相似,即由模板、引物、聚合酶、dNTP和缓冲液组成。但LAMP使用四个引物,聚合酶为Bst DNA聚合酶。LAMP扩
环介导等温扩增引物设计
环介导等温扩增引物设计 环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种常用的核酸扩增技术，其最大的优势是可以不受限地在恒定温 度下进行反应。为了实现快速、准确、可靠的DNA扩增，合理的引物 设计是至关重要的。下面就环介导等温扩增引物的设计进行详细介绍： 一、引物长度 引物长度对扩增效率和特异性有很大影响。通常建议引物长度在18- 24bp之间，太短的引物会导致扩增效率低下，太长的引物则容易出现 多个峰或非特异性扩增。因此，在长度的选择上需要平衡扩增效率和 特异性，一般来说，20bp左右的引物是比较适合的选择。 二、引物序列选择 引物序列选择需要保证具有较低的自身互补性和互补性。通常情况下，引物中应避免出现多个重复序列，避免引物间形成二级结构或者嵌套 回路，可以通过NCBI的Primer BLAST或DNAMAN等软件进行序列比对，评估引物设计的准确性。 三、环结构设计 与PCR引物不同，LAMP引物一般会在5’端和3’端添加的特殊序列（FIP和BIP）和环的序列。它们是设计LAMP的关键部分，必须确保 它们的特异性和互补性。FIP和BIP序列需要匹配到目标序列上，而 F1c和B1c环序列主要用于在反应过程中拉开靶DNA，为DST和DHT提 供起始端。 四、引物浓度
引物浓度对LAMP反应影响也很大，它的作用是影响LAMP反应的灵敏 度和特异性。在引物浓度过高时，会出现非特异性扩增和产生大量的 非特异性产物；而在引物浓度过低时，则可能影响LAMP反应的灵敏度。因此，在引物浓度的选择上也需要进行优化。 综上所述，环介导等温扩增引物设计是一项较为关键的技术，涉及到 引物长度、序列选择、环结构设计和引物浓度等方面。在实际操作中，需要根据样品特点和实验要求来进行引物设计。同时，还需要结合实 验优化引物浓度以及其他实验条件，以获得高灵敏度和高特异性的扩 增结果。
环介导等温扩增技术原理
环介导等温扩增技术原理 引言 随着生物技术的快速发展，分子生物学中的核酸扩增技术逐渐成为研究的重要工具之一。而环介导等温扩增技术作为一种新的核酸扩增方法，具有快速、简便、高效等优点，在生物医学研究、临床诊断、食品安全等领域发挥着重要的作用。 等温扩增技术的背景 传统的PCR（聚合酶链式反应）技术是通过循环升温、降温的方法来完成DNA扩增 过程。然而，该技术要求精确的温度控制，对设备和试剂的稳定性要求很高。此外，传统PCR扩增过程中存在高温引起的扩增产物降解等问题。因此，研究人员不断寻求一种更为简便、高效的核酸扩增方法。等温扩增技术由此应运而生。 等温扩增技术的原理 等温扩增是指在恒定的温度下，通过酶的作用，在核酸模板的辅助下，使扩增产物逐渐积累的过程。其中，环介导等温扩增技术作为一种新兴的等温扩增方法，与其他方法相比具有更高的特异性和敏感性。 环介导等温扩增技术的反应体系 环介导等温扩增技术通常包括三个主要组分：核酸模板、引物和酶。 核酸模板 核酸模板是等温扩增的起始物质，可以是DNA或RNA。在反应过程中，核酸模板会 经历多次复制，从而实现扩增。 引物 引物是用来引导扩增反应的小片段核酸序列。在环介导等温扩增技术中，引物会与核酸模板序列互补结合，作为复制的起始点。
酶 环介导等温扩增技术中主要使用的酶是DNA环介导聚合酶（Bst DNA polymerase）。该酶具有良好的耐热性，可以在高温条件下活性稳定，并且具有DNA依赖性DNA聚合酶和脱氧核苷酸酶活性。 环介导等温扩增技术的具体过程 环介导等温扩增技术主要通过以下几个步骤完成扩增过程： 1. 首先，将反应体系中的DNA模板加热至解链温度，使DNA模板解链成两条单链。 2. 然后，引物与DNA模板序列互补结合，形成引物-模板复合物。 3. 酶（Bst DNA polymerase）结合在引物-模板复合物上，并且开始在DNA模板的3’端进行DNA合成。该酶具有脱氧核苷酸酶活性，可以在DNA合成过程中消除RNA、DNA杂质。 4. DNA合成过程中，Bst DNA polymerase具有环形DNA依赖性的分段合成特性。 当到达模板的某个特定序列时，酶会停止复制，并通过转移引物进入下一个目标序列。这样，扩增产物就形成了一个环状结构。 5. 当酶遇到扩增产物的环状结构时，它可以通过酶的3’→5’外切酶活性，在复 制的同时切割环状结构。这个过程会形成一个线性的扩增产物，线性的扩增产物可以重新参与新一轮的扩增反应。 6. 不断循环以上步骤，扩增产物逐渐累积，最终达到指定的扩增效果。 环介导等温扩增技术的优势 相比于传统PCR技术，环介导等温扩增技术具有以下几个明显的优势： 简便快速 环介导等温扩增技术不需要复杂的温度变化，只需恒温即可完成扩增。这样可以节省操作时间，减少实验的复杂性。
02钉螺血吸虫感染的环介导等温扩增技术检测操作说明
钉螺血吸虫感染的环介导等温扩增技术检测 （Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP） 一、实验器材和主要试剂准备 1.仪器设备 台式高速离心机(1.5/2.0 ml离心管转头，转速要求≥10,000 r/min)；恒温水浴箱（可调温37～65℃）； 迷你（微型）离心机（0.2 ml离心转头）； 漩涡震荡器； 电动组织研磨器； 移液器一套（量程包括100或200～1000μl, 20～200μl，0.5或1μl～10μl）； 耗材：Tip头、1.5和2.0ml微量离心管、0.2 ml PCR 反应管、厚玻璃板、乳胶手套或一次性手套、一次性口罩 2．主要试剂 试剂盒：细胞（组织）基因组DNA提取试剂盒，钉螺体内血吸虫核酸检测试剂盒。 二、操作流程 1、操作者首先穿好工作服，戴好干净口罩和手套，整理实验桌台面，建议用DNA酶变性剂喷在移液器、实验台面，去除环境中外源DNA 的污染。 2、从现场获取的钉螺若干只，按照以下步骤进行样品预处理和钉螺基因组DNA提取： （1）用（pH 8.0）灭菌TE缓冲液漂洗钉螺2遍，干净吸水纸上晾干。
（2）取同一个环境的钉螺10只置干净厚玻片上，压碎钉螺； （3）用干净镊子去大部分钉螺外壳，挑取钉螺软体组织置干净2.0 mL微量离心管内，加400 μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；40 μl蛋白酶K液，置冰上用电动研磨器研磨软体组织，工作条件 15 s，间隔5 s，共2次； （4）将研磨处理的钉螺样本放置56°C水浴充分裂解，期间每30 min 取出离心管放置振荡器上充分混匀30 s，水浴时间2～3 h（或 过夜）从水浴箱中取出裂解样品管，继续行基因组DNA提取；（5）加入400 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，10s简短离心以去管盖内壁的水珠。注意：加入 缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底， 可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯； （6）加入400 μl无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，10 s简短离心以去除管盖内壁的水珠； （7）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）。12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废 液，将吸附柱CB3放回收集管中； （8）向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废 液，将吸附柱CB3放入收集管中； （9）向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例 1．LAMP引物的设计： LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 如图所示：
2．扩增原理 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板 F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。