ISO标准参考译文沙门氏菌检验基准方法
国际标准 ISO 6579
食品和动物饲料的微生物学
——沙门氏菌检测的基准方法
内容
1 范围
2 参考标准
3 定义
4 原理
4.1 概要
4.2前增菌——非选择性液体培养基
4.3 增菌——选择性液体培养基
4.4 划平板和鉴定
4.5 确认
5 培养基、试剂和血清
5.1 概要
5.2 培养基和试剂
5.3 血清
6 设备和玻璃器皿
7 采样
8 检验样品的制备
9 程序
9.1 试验样品和原始悬浮液
9.2 非选择性前增菌
9.3 选择性增菌
9.4 划平板和鉴定
9.5 确认
10 结果表示
11 检验报告
12 质量保证
附录A （标准化）程序图表
附录B （标准化）培养基和试剂的成份及准备
附录C （非标准化）实验室间试验结果
参考书目
ISO（国际标准化组织）是国际标准化团体的全世界同盟。通常由ISO技术委员会来执行国际标准的制订工作（ISO成员体）。通常由ISO技术委员会来完成国际标准的准备工作。在委员会中，若对建立的技术委员会有兴趣的话，每个成员体有权作为代表。国际组织、政府或非政府组织，通过ISO联系，也可以参加这项工作。在所有电工标准方面，ISO与国际电工委员会（IEC）紧密合作。
国际标准按照ISO/IEC指南第三章所列的规则草拟。
技术委员会的主要任务是准备国际标准。被技术委员会采用的国际标准草案以投票方式在成员体内运行。至少要75%成员体的投票赞成，才能作为一个国际标准发布。
要引起注意的可能性是:本国际标准的一些要素可能是专利权主体。ISO不应承担鉴定部分或全部的这种专利权。
ISO6579是由食品ISO/TC34技术委员会、微生物SC9分委员会所准备的。
第四版删除或更换了第三版（ISO6579：1993），并已作了技术性修订。
附录A和附录B形成了本国际标准的标准化部分。附录C仅为资料。
因为有大量的不同种类的食品和饲料产品，本基准方法可能对某些产品并不完全适用,而另一些产品可能得用到其他方法。既然这样，如果为论证技术上的原因而绝对需要时，那么就可使用这些产品指定的不同方法。不过，应尽可能地使用本基准方法。
在下一次审查这个国际标准时，我们会考虑所有有用关于这些指标所涉及的范围内以及个别产品不遵照这些指标的原因的信息。
(产品的)检测方法无法在短时间内达到统一,而且,对于某些产品,可能已经有与本基准方法不符的国际标准/或国家标准存在。但是我们希望,在以后审查这些标准时能进行修改,使其同本国际标准保持一致,以保证除了因技术原因确实需要外不会发生背离本基准方法的情况.
微生物学——检测沙门氏菌方法的通用指南
警告——为了保护实验室工作人员的身体健康，在适当装备的实验室、在熟练的微生物学家的控制下检测沙门氏菌、特别是伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌，这是非常关键的。另外最要关注的是所有培养物的处置。
1 范围
本国际标准详述了沙门氏菌的基准方法，包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。
在绪论中受讨论的局限性，本国际标准适用于
——供人类消费或动物饲养所使用的产品。
——在食物生产和处理范围内的环境样品。
警告——本方法并不包括所有的伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。
2 标准的参考资料
通过本文中的参考目录，下列标准化文件包含组成本国际标规定的条款。对后来更正或修订的陈旧参考资料，这些条款并不适用。然而，鼓励那些基于赞同本国际标准的成员，去调查下面提到的大多数新版标准化文件应用的可能性。对更新的参考资料，最新版的标准化文件作了参考应用。ISO和IEC的成员保持对现行有效国际标准的注册。
ISO6887-1，食品和动物饲料的微生物学——微生物检验中测试样品、原始悬浮液及十倍稀释液的制备——第一章：原始悬浮液和十倍稀释液制备的通用规则
ISO 7218：1996，食品和动物饲料的微生物学——微生物检验的通用规则
ISO 8261，牛奶及奶制品——微生物检验中测试样品、原始悬浮液及十倍稀释液制备的通用指南
3 术语和定义
应用下列定义来表达本国际标准的用途。
3.1 沙门氏菌：在选择性培养基上形成典型或少典型的菌落，当依照本国际标准进行试验时，它们表现出特有的生化反应和血清学特征的微生物。
3.2 沙门氏菌检测：当依照本国际标准进行试验时，在一定重量或体积的产品中，测定这些沙门氏菌的存在与否。
4 原理
4.1 概要
沙门氏菌检测需四个连续阶段（也可以见附录A）
注沙门氏菌可能少量存在，并经常伴随着相当数量的其它肠杆菌属或其它菌属。因此，选择性增菌是必需的；此外，为尽可能地检测到受伤沙门氏菌，经常需要进行前增菌。
4.2 前增菌——非选择性液体培养基
将试验部分接种于缓冲蛋白胨水，在37℃±1℃培养18h±2h。
对于某些食品，则需利用其它的前增菌程序，见9.1.2。
数量比较庞大时，在接种测试样品前应将缓冲蛋白胨水加热到37℃±1℃。
4.3 增菌——选择性液体培养基
将4.2得到的培养物接种到RVS肉汤和MKTTn肉汤。
RVS肉汤在41.5℃±1℃孵育24h±3h，MKTTn肉汤在37℃±1℃孵育24h±3h。
4.4 划平板和鉴别
从4.3中获得的培养物接种于两种选择性固体培养基上。
——木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD琼脂）
——对XLD琼脂的任何其它补充性的选择性培养基，特别是适合于分离乳糖阳性的沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌的培养基，实验室可以选择使用。XLD琼脂在37℃±1℃孵育，在24h±3h后检查结果。第二种选择性琼脂按照厂家说明书进行孵育。
注作为资料，亮绿琼脂、亚硫酸铋琼脂等，可用作第二种平板划线培养基。4.5 确认
挑选可疑沙门氏菌的菌落进行次培养，再按4.4所描述的划线分离，通过适当的生化试验和血清学试验加以证实。
5 培养基、试剂和血清
5.1 概要
供常规实验室使用，见ISO 7218。
5.2 培养基和试剂
注由于培养基和试剂的数量庞大，为了表述清晰，我们认为将它们的组成和配制在附录B中列出更适当。
5.2.1 非选择性前增菌液：缓冲蛋白胨水
见B.1
5.2.2 第一种选择性增菌液：RVS肉汤
见B.2
5.2.3 第二种选择性增菌液：MKTTn肉汤
见B.3
5.2.4固体选择性平板培养基
5.2.4.1 第一种培养基：木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂（XLD琼脂）
见B.4
5.2.4.2 第二种培养基
第二种培养基的选择是留给检测实验室自定。在它的准备使用时应准备按厂家说明书准确执行。
5.2.5 营养琼脂
见B.5
5.2.6 三糖/铁琼脂（TSI 琼脂）
见B.6
5.2.7 尿素琼脂（Christensen）
见B.7
5.2.8 L-赖氨酸脱羧酶培养基
见B.8
5.2.9 β-半乳糖苷酶检测试剂（或依照厂商说明书使用的比色盘）
见B.9
5.2.10 V-P反应试剂
见B.10
5.2.11 吲哚反应试剂
见B.11
5.2.11.1 半固体营养琼脂
见B.12
5.2.13 生理盐水溶液
见B.13
5.3 血清
含有一种或多种O抗原的多价血清型可由商品化获得，也就是包含一个或更多个O群抗血清（称单价或多价抗O血清），抗Vi血清和含有一个或多个H因子的抗血清（称单价或多价抗菌素H血清）。
应确保所用的抗血清足以检测所有的沙门氏菌血清型。
6 设备和玻璃器皿
如果操作规范，对于可重复使用的玻璃器皿，重复使用是可以接受的。
通常或特殊情况下微生物实验室设备（见ISO 7218）如下：
6.1 干灭菌（烘箱）或湿灭菌（高压灭菌器）设备
见ISO 7218
6.2 干燥柜或烘箱，通过对流通风，能在37℃±1℃和55℃±1℃之间调节温度。
6.3 培养箱，能调节温度至35℃±1℃或37℃±1℃。
6.4 水浴，能调节温度至41.5℃±1℃，或孵育，能调节温度至41.5℃±1℃。
6.5水浴，能在44℃-47℃间调节温度。
6.6水浴，能调节温度至37℃±1℃。
由于沙门氏菌的低传染性，推荐使用含有抗菌剂的水浴锅（6.4、6.5和6.6）。
6.7 灭菌环，直径约为3mm或10μl的灭菌吸管。
6.8 pH计，要求在20℃-25℃时精确校准到±0.1单位。
6.9适当容量的试管或烧瓶
可以使用带无毒金属或塑料螺旋帽的试管或烧瓶
6.10 分别以0.5ml和0.1ml间隔标示，容量为10ml和1ml的刻度吸管或自动吸管。
6.11 小规格（直径为90mm-100mm）和/或大规格（直径为140mm）的皮氏培养皿。
7 制样
实验室收到具有代表性的，且在运输或贮存过程中没有损坏或改变的样品是非常重要的。
制样不是本国际标准指定方法的一部分。可参见处理相关产品的特定国际标准。如果没有特定国际标准，可推荐这一方面已被公认的相关部分。
8 测试样品的制备
根据处理相关产品的特定国际标准来制备测试样品。如果没有特定国际标准，可推荐这一方面已被公认的相关部分。
9 程序（见图附录A）
9.1 测试样品和原始悬浮液
9.1.1 概要
特定的国际标准处理相关的产品，见ISO 6887-1。牛奶及奶制品见ISO 8261。
准备原始悬浮液，通常用5.2.1和4.2（缓冲蛋白胨水）指定的前增菌培养基作为稀释液。
如果指定测试样品的重量超过25g，则需用一定量的前增菌液做约1：10稀释。
为减少检测工作量，当检测指定食品中超过25g样品时，或有证据表明混合物（将测试样品堆聚）不会影响到特殊食品的检测结果时，则样品可以混合测定。例如，如果要测定10份25g的样品，则各取10份样品混合形成一个250g混合测试样品，加入2250ml前增菌肉汤。另外，还可从10份单独测试样品（9.3.1）的前增菌液中取0.1ml（10mlRVS肉汤）和1ml（10mlMKTTn肉汤）混合加入到100ml选择性增菌液中进行增菌培养。
9.1.2 某些产品原始悬浮液的特殊制备
注下列特殊的制备仅涉及沙门氏菌的情况。在ISO 6887-2、ISO 6887-3、ISO 6887-4和ISO 8261中描述了适用于其它病原微生物检测的特殊制备。
9.2 非选择性前增菌液
将原始悬浮液（9.1）于37℃±1℃孵育18h±2h。
9.3 选择性增菌液
9.3.1 将9.2获得的培养物0.1ml接种到含有10mlRVS肉汤（5.2.2）的试管中；另取9.2获得的培养液1ml接种到含有10mlMKTTn肉汤（5.2.3）试管中。
9.3.2 接种的RVS肉汤（9.3.1）于41.5℃±1℃孵育24h±3h；接种的MKTTn 肉汤于37℃±1℃孵育24h±3h。引起注意的是不得超过最高允许的孵育温度（42.5℃）
9.4 划线和鉴定
9.4.1 在孵育24h±2h后，取RVS肉汤（9.3.2）培养物一环（6.7）接种于含有第一种选择性平板培养基（XLD平板，见5.2.4.1）的大规格皮氏培养皿表面，以便获得好的单个菌落。
若缺少大的培养皿，则可采用两个小的培养皿，用相同的接种环一个接着一个地划平板。
用消毒过的接种环和皮氏培养皿象上面一样按相同的步骤接种于第二种选择性平板培养基（5.2.4.2）。
9.4.2 在孵育24h±3h后，用MKTTn肉汤（9.3.2）培养物，重复9.4.1描述的步骤接种于两种选择性平板培养基上。
9.4.3 倒置培养皿（9.4.1和9.4.2）使底部在最上面，将第一种选择性培养基（5.2.1）放在设定为37℃的培养箱内。第二种选择性培养基（5.2.4）则按照生产厂家的说明书执行。
9.4.4 在孵育24h±3h后，检查平板（9.4.3）上存在的沙门氏菌的典型菌落或可能是沙门氏菌非典型菌落（见注）。在培养皿的底部标示它们的位置。
在XLD平板生长的沙门氏菌典型菌落是中心一个黑点，周围由于指示剂颜色的改
变而出现淡红色的轻微透明带。
注 H2S阴性的变种沙门氏菌在XLD平板上长成粉红色菌落，中间是暗红色。
在适当的温度下培养第二种选择性平板培养基，经过适当的时间，通过它们的特征，检查并核对被认为可疑沙门氏菌菌落的存在。
9.5 确认
9.5.1 概要
如果显示是可靠的，那么，可以使用商业化的可供沙门氏菌生化试验用的鉴别试剂盒。鉴别试剂盒的使用关系到菌落的生化确认。这些试剂盒应在生产厂商的说明书指导下使用。
注辨认沙门氏菌菌落，在很大程度上依靠经验，它们外表各有不同，不仅是种与种之间，每批培养基之间也有不同。
9.5.2 确认菌落的选择
为了确认，从每个选择性培养基的第个培养皿上挑取至少一个被认为典型的中可疑的菌落，如果第一种选择培养基为阴性，则需挑选4个菌落以上。
在流行病学研究的情况下，建议至少有五个菌落需被鉴别。如果一个培养皿上少于五个典型的或可疑的菌落，则取所有典型的或可疑的菌落做确认。
用一种便于好的单个菌落形成的方式在预先干燥的营养琼脂平板表面上划经挑选的菌落。将接种的平板（9.4.3）在37℃±1℃孵育24h±3h。
用纯培养物进行生化试验和血清学确认。
9.5.3 生化确认
9.5.3.1 概要
用接种针，将9.5.2所选菌落的每个培养物接种于9.5.3.2至9.5.3.7指定培养基。
9.5.3.2 TSI琼脂（(5.2.6)
先在TSL琼脂斜面上划线，再于底层穿刺。在37℃±1℃孵育24h±3h。
在培养基上颜色变化的解释如下：
a）底部
——黄色葡萄糖阳性（葡萄糖被利用）
——红色或未变葡萄糖阴性（葡萄糖未被利用）
——黑色硫化氢形成
——气泡或裂缝葡萄糖产气
b）斜面
——黄色乳糖和/或蔗糖阳性（乳糖和/或蔗糖被利用）
——红色或不变色乳糖和/或蔗糖阴性（乳糖和蔗糖均不被利用）典型的沙门氏菌培养物显示碱性（红色）斜面和酸性（黄色）底部，伴随着产气（气泡）和（约90%情况下）硫化氢产生（琼脂变黑）（9.5.3.8）。
当分离到乳糖阳性的沙门氏菌时，TSI的斜面是黄色的。因此，沙门氏菌培养物的初步确认并不能仅仅根据TSI琼脂试验的结果。
9.5.3.3 尿素琼脂（5.2.7）
在琼脂斜面上划线。在37℃±1℃孵育24h±3h，间隔一定时间检查。
如果反应是阳性，尿素裂解释放氨，其颜色由酚红变成玫瑰红，最后变成深樱红色。反应通常在2h-4h后可见。
9.5.3.4 L-赖氨酸脱羧酶培养基（5.2.8）
接种于液体培养基表面以下，在37℃±1℃孵育24h±3h。
培养后出现混浊及出现紫色表明为阳性反应。黄色表明阴性反应。
9.5.3.5 β-牛乳糖试验
取满环可疑菌落放于含有0.25ml生理盐水的试管中。
加1滴甲笨并摇匀。把试管放入37℃水浴（6.6），保持几分钟（约5分钟）。加0.25ml检测β-牛乳糖的试剂，混匀。
再将试管放入37℃水浴，保持24h±3h，间隔一定时间检查试管。
黄色表明为阳性反应。反应通常在20分钟后可见。
如果用准备好的纸片（5.2.9），则按照生产厂商的说明书操作。
9.5.3.6 V-P反应培养基
取满环可疑菌落放于含有3mlVP培养基的灭菌试管中。
在37℃±1℃孵育24h±3h。
孵育后，加入2滴肌氨酸溶液，3滴1-萘酚-乙醇液，随后加入2滴氢氧化钾溶液；每种试剂加完后要摇匀。
15分钟内颜色由粉红变为鲜红表明阳性反应。
9.5.3.7 吲哚反应培养基
将可疑菌落接种于含有5ml的胰蛋白胨/色氨酸培养基的试管中。
在37℃±1℃孵育24h±3h。孵育后，加1ml Kovacs 试剂。
出现红色环表明阳性反应。黄褐色环表明阴性反应。
9.5.3.8 生化试验的解释
常见沙门氏菌出现的反应结果见表1。
9.5.4 血清学确认和血清型
9.5.4.1 概要
在消除自凝现象后，用适当的血清通过玻片凝集试验对纯菌落（9.5.2）检测沙门氏菌O抗原、Vi抗原和H抗原的存在。如果与以下描述有差异的话，则按照产品说明书使用抗血清。
9.5.4.2自凝现象的消除
放一滴生理盐水（5.2.13）于仔细清洁过的玻片上。用接种环挑取部分被测菌落并将水滴打散，以获得均一混浊的悬浮液。
注将部分被测菌在一滴水打散，然后用一滴生理盐水（5.2.13）与它混匀，这也是可能的。
轻轻摇动玻片30s-60s。在暗背景下观察结果，用放大镜更好。
如果细菌凝集成或多或少的明显块状，则可认为是自凝集，那么按照下列方法进行沙门氏菌的抗原测定是不可行的。
9.5.4.3 O-抗原测定
用一个无自凝集的纯菌落，用一滴抗O血清（5.3）代替生理盐水（5.2.13），按9.5.4.2步骤操作。
如果出现凝集，则认为该反应为阳性。
用多价和单位血清接连凝集。
9.5.4.4 Vi-抗原测定
按9.5.4.2步骤操作，但用一滴抗Vi血清代替生理盐水。
如果出现凝集，则认为该反应为阳性。
9.5.4.5 H-抗原测定
将纯的无自凝集的菌落接种于半固体营养琼脂。在37℃±1℃孵育24h±3h。
用此培养物来检测H-抗原，按9.5.4.2步骤操作，但用一滴抗H血清代替生理盐水。
如果出现凝集，则认为该反应为阳性。
9.5.5生化和血清学反应的解释
表2给出的是所用菌落（9.5.2）完成确认试验（9.5.3和9.5.4）的解释。
9.5.6最后确认
被考虑为沙门氏菌，或可能是沙门氏菌（见表2）的菌落，应送公认的沙门氏菌参比中心做最后的血清型确认。
送确认时应同时附上关于此菌的所有尽可能多的信息，以及是一次爆发流行
还是在食物中。
10 结果表达
与解释的结果相一致，揭示χg或χml测试样品中是否存在沙门氏菌。
多实验室间的试验所获得的精密数据见附录C。
11 测试报告
测试报告应详细说明：
——制样方法，如果知道的话；
——试验过程中任何增菌液或孵育条件的偏离；
——所有非本国际标准指定的操作条件，或者被认为可选择的、和可能影响结果的任何事件的细节；
——得到的结果；
测试报告也应该声明得到的阳性结果是仅用了划线培养基（5.2.4）而不是本国际标准指定的方法。
12 质量保证
为检查实验室用本国际标准描述的方法和培养基来检测沙门氏菌的能力，提出参考样品加入含前增菌液的质控瓶中。对质控瓶的检测过程与测试样品培养相一致。
附录 A
（标准化）
检测程序图
附 录 B
（标准化）
培养基和试剂的组织和制备
B.1 缓冲蛋白胨水
B.1.1 成份
B.1.2 制备
将上述成分溶解于水，如需要可以加热。
如需要，调节pH值，以便在消毒后25℃下pH值为7.0±0.2。
分装培养基于适当容量的烧瓶中，以便满足实验的需要。
置于高压灭菌锅中121℃灭菌15分钟。
B.2 RVS肉汤
B.2.1 溶剂A
B.2.1.1 成份
B.2.1.2 制备
将上述成分溶解于水，如需要可以加热到70℃左右。
溶液在完全RVS培养基制备时应已经准备就绪。
B.2.2 溶剂B
B.2.2.1 成份
B.2.2.2 制备
将氯化镁溶于水中。
由于氯化镁容易吸湿，依据相关公式，可取整个的MgCl.6H2O溶解于新开的容器内。例如，250g MgCl.6H2O加入625ml的水，得到一个总体积为788ml的溶液，MgCl.6H2O的重量浓度约为31.7g/100ml。
B.2.3 溶剂C
B.2.3.1成份
B.2.3.2制备
将孔雀绿草酸盐溶于水中。
溶液置于棕色瓶中，室温保存至少8个月。
B.2.4完全培养基
B.2.4.1 成份
B.2.4.2 制备
加入1000ml溶液A、100ml溶液B、10ml溶液C。
如需要，调节pH，以便在灭菌后pH值为5.2±0.2。
使用前，用10ml量分装试管。
置高压灭菌锅中115℃灭菌15分钟。
已配好的培养基于3℃±2℃保存。隔天使用该培养基。
注最终培养基成分是：大豆消化酶，4.5g/l；氯化钠，7.2g/l；磷酸二氢钾（KH2PO4+K2HPO4），
1.44g/l；MgCl2，13.4g/l或MgCl2·12H2O，28.6g/l；孔雀绿草酸盐，0.036g/l。
B.3 MKTTn肉汤[7]
B.3.1 基础培养基
B.3.1.1 成份
B.3.1.2 制备
将脱水的基础成份或基础完全培养基溶解于水中，并煮沸5分钟。
如需要，调节pH，使其25℃时值为8.2±0.2。
彻底混匀培养基。
该基础培养基于3℃±2℃可保存4周。
B.3.2 吲哚溶液
B.3.2.1 成份
B.3.2.2 制备
将碘化钾完全溶于10ml水中，再加入碘，然后加入100ml水稀释。不需加热。
在室温下将配制好的溶液置于密闭容器，暗处保存。
B.3.3 新生霉素溶液
B.3.3.1 成份
B.3.3.2 制备
将新生霉素钠盐溶于水中，过滤灭菌。
3℃±2℃保存4周以上。
B.3.4 完全培养基
B.3.4.2 制备
无菌条件下，将5ml新生霉素溶液（B.3.3）加入到1000ml基础培养（B.3.1）中。混匀，然后加入20ml碘-碘化钾溶液（B.3.2）。混匀。
在无菌条件下，按实验需要量将培养基分装于灭菌好的烧瓶中。
完全培养基应隔天使用。
B.4木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂[7]
B.4.1 基础培养基
B.4.1.1成份
B.4.1.2制备
将脱水的基础成份或基础完全培养基溶解于水中，加热，不停地搅拌，直至培养基开始沸腾。避免温度过高。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为7.4±0.2。
将此培养基适量倒入烧瓶中。
加热并不断搅拌，直到培养基沸腾，琼脂溶解。不要温度过高。
1）依靠琼脂的凝胶强度。
B.4.2 琼脂板的制备
立即从44℃-47℃的水浴（6.5）取出，搅拌并烧平板。直到凝固。
使用前，在35℃到55℃的烘箱里小心干燥琼脂板，直到琼脂表面干燥。（若把盖子拿掉或琼脂面朝下效果更好）。
烧好的平板在3℃±2℃保存5天以上。
B.5 营养琼脂
B.5.1 成份
B.5.2 制备
将相应组份或脱水完全培养基溶于水，如需要可加热。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为7.0±0.2。
将培养基转移到适当容量的试管或瓶中。
高压灭菌锅（6.1）125℃灭菌15分钟。
B.5.3 营养琼脂板的制备
将约15ml融化的培养基移到灭菌皮氏培养皿中，按B4.2进行操作。
B.6 三糖铁琼脂（TSI琼脂）
B.6.1 成份
B.6.2 制备
将相应组份或脱水完全培养基溶于水，如需要可加热。
如需要，调节pH，以便在灭菌在25℃时pH值为7.4±0.2。
将10ml培养基分装于试管或平板中。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
置于一个倾斜的位置，使底部的深度2.5cm到约5cm。
B.7 尿素琼脂（Christensen）
B.7.1 基础培养基
B.7.1.2 制备
将相应组份或脱水完全培养基溶于水，如需要可加热。
如需要，调节pH，以便在灭菌在25℃时pH值为6.8±0.2。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
B.7.2 尿素溶液
B.7.2.1 成份
B.7.2.2 制备
将尿素溶于水中，过滤灭菌并确认无菌。
见ISO 7218：1996，7.3.2。
B.7.3 完全培养基
B.7.3.1 成份
B.7.3.2 制备
在无菌条件下，将尿素溶液加入到先前融化并已冷却到44℃-47℃的基础培养基中。
将10ml完全培养基分装于灭菌管内。
要求倾斜放置。
B.8 L-赖氨酸脱羧酶培养基
B.8.1 成份
B.8.2 制备
将上述成分溶于水中，需要时可加热。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为6.8±0.2。
将2ml-5ml培养基转移到具螺旋帽的精密培养管（6.9）中。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
B.9 β-半乳糖苷酶检测试剂
B.9.1 缓冲溶液
B.9.1.1 成份
B.9.1.2 制备
将NaH2PO4溶于约450ml水的容量瓶中。
用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0±0.2（25℃）。
加水至50ml。
B.9.2 ONPG溶液
B.9.2.1 成份
B.9.2.2 制备
在50℃左右将ONPG溶于水中。
冷却溶液。
B.9.3 完全培养基
B.9.3.2 制备
将缓冲溶液加入到ONPG溶液中。
B.10 V-P反应试剂
B.10.1 VP培养基
B.10.1.1成份
B.10.1.2制备
将上述成分溶于水中，如需要可加热。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为6.9±0.2。
将3ml培养基转移到试管中（6.9）。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
B.10.2 肌氨酸溶液（N-氨基肌氨酸）
B.10.2.1 成份
B.10.2.2 制备
将肌氨酸一水化物溶于水中。
B.10.3 1-奈酚乙醇溶液
B.10.3.1 成份
B.10.3.2 制备
将1-奈酚溶于乙醇溶液。
B.10.4 氢氧化钾溶液
B.10.4.1 成份
B.10.4.2 制备
将氢氧化钾溶于水中。
B.11 吲哚反应试剂
B.11.1 胰蛋白胨/色氨酸培养基
B.11.1.1 成份
B.11.1.2 制备
将上述成分溶于沸腾的水中。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为7.5±0.2。
每管加5ml培养基，进行分装。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
B.11.2 Kovacs 试剂
B.11.2.1 成份
B.11.2.2 制备
混合上述成分。
B.12 半固体营养琼脂
B.12.1 成份
B.12.2 制备
将上述成分溶于水中，需要时可加热。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为7.0±0.2。
将培养基转移到适量的烧瓶中。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
B.12.3 琼脂板的制备
B.13 生理盐水溶液
B.13.1 成份
B.13.2 制备
将氯化钠溶于水中。
如需要，调节pH，以便在灭菌后25℃时pH值为7.0±0.2。
分装上述溶液于烧瓶或试管（6.9）中，使得它们灭菌后的体积为90ml-100ml。
高压灭菌锅（6.1）121℃灭菌15分钟。
附录 C
沙门氏菌检验
沙门氏菌的检验 1．目的 规范沙门氏菌检测方法，使产品检验有据可依。 2．消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃仪器、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 注：本实验采用湿热灭菌法，吸管、培养皿、培养基等盖好塞子并包好瓶口在高压灭菌锅中按要求的温度和压力灭菌，一般是121℃（）下灭菌20min。 3．原理 沙门氏菌的检验分四个连续阶段： 4．操作步骤 准备工作 配制实验所需的缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸培养基（无需灭菌）、HE培养基、三糖铁培养基等，并将准备好的均质杯、吸管、培养皿、大试管等一起灭菌。 前增菌 在无菌环境下，称取25g待检样品放入盛有225ml灭菌好的缓冲蛋白胨水中，然后放到36±1℃的恒温培养箱内进行前增菌4-6h; 增菌 在无菌环境下，用灭菌好的吸管吸取10ml前增菌液接种与100ml亚硒酸盐胱氨酸培养基中进行二次增菌，恒温培养箱36±1℃，培养18-24h; 分离培养 将增菌培养液摇匀，以无菌操作，用直径3mm的接种环挑取一环，划线于表面无凝结水的BS和SS琼脂平板各一个，于36±1℃培养18-24h。观察各个平板上有无典型或可疑沙门氏菌属的菌落。如无典型或可疑菌落，应再继续培养24±2h。然后观察培养的平板（黄色的菌落是大肠杆菌；蓝绿色或蓝色，产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色为可疑沙门氏菌）。 沙门氏菌属各亚属在其他选择性琼脂平板的菌落特征 生化实验 用灭菌好的接种针在培养平板上挑取可疑的沙门氏菌单菌落，接种到三糖铁培养基上，恒温培养箱36±1℃，培养18-24h; 典型沙门氏菌培养物斜面显红色（碱性），底端显黄色（酸性），有气体产生，形成硫化氢（琼脂变黑）。 三糖铁培养基变化表 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果
沙门氏菌快速检测方法
沙门氏菌快速检测方法 1试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3所用试剂和培养基 1.3.1缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15min，冷至常温。 1.3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1配制BPW培养基（第一天） 2.2培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟,关灯60min 后使用。（第一天） 2.3预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4配制TTB增菌液（第一天） 2.5增菌（第二天） 2.5.1接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于9mLTTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。 2.5.2培养现象 菌名菌号生长状况 TTB培养特征 静置后浑浊CMCC(B)50071 伤寒沙门氏菌良好 静置后浑浊良好鼠伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50115 静置后清亮不生长大肠埃希氏菌 ATCC25922
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验 食品学院14食品质量与安全1班 刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君 2 2 2 2 摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。 关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定 前言 沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1仪器设备 均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃ 吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头
电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂 1.1.2试剂药品 鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡 1.1.3培养基 蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基 1.2 实验方法 1.2.1培养基的制备 1.2.1.1培养基的配制步骤 蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。分装10瓶，每瓶90ml 四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌 121 ℃，15 min灭菌冷却后至30℃，每100ml 基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml 1.2.1.2配制培养基的注意事项 （1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末； （2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量； （3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。 1.2.2 沙门氏菌群检测 1.2.2.1沙门氏菌检测程序
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验 2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5天平：感量0.1 g。 2.6 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿：直径90 mm。 2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 2.10 无菌毛细管。 2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A 中A.1。 3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A 中A.2。 3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A 中A.3。 3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录A 中A.4。 3.5 HE 琼脂：见附录A 中A.5。 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A 中A.6。 3.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录A 中A.7。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A 中A.8。 3.10 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录A 中A.9。 3.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录A 中A.10。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A 中A.11。 3.13 糖发酵管：见附录A 中A.12。 3.14 邻硝基酚β-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A 中A.13。 3.15 半固体琼脂：见附录A 中A.14。 3.16 丙二酸钠培养基：见附录A 中A.15。 1 前增菌 称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min～ 2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。 2 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 ℃±1 ℃培养18 h～24h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC 内，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 3 分离 分别用接种环取增菌液1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36 ℃±1 ℃分别培养18 h～24 h （XLD 琼脂平板、
沙门氏菌基本知识及检测方法
沙门氏菌基本知识及检测方法 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有2000多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属Salmonella 。本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。 根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(甲型、乙型、丙型)。第二类群：能引起人类食物中毒——食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。 一、沙门氏菌属的生物学特征： 1.形态染色特性：G-无芽孢杆菌。大小通常为 0.7～1.5μm × 2.0～5.0μm，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。需氧或兼性厌氧菌，生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃，适宜pH为6.8～7.8，对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛，胆盐可促进其生长。 2.培养特性：需氧或兼性厌氧菌；生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃；适宜pH为6.8～7.8；对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛；胆盐可促进其生长。 §普通琼脂：圆形、光滑、无色半透明、边缘整齐或不太整齐的中等大小(2 ～ 4mm)菌落。鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒、甲型副伤寒沙门氏菌等只能长成细小菌落。§麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂(EMB)：菌落无色半透明
沙门氏菌检验标准操作规程
1目的P URPOSE 规范888物料、产品的沙门氏菌检验操作，确保检验结果的可靠性。 2范围SCOPE 适用于888物料、产品的沙门氏菌检验工作。 3责任RESPONSIBILITY 微生物检验员严格执行本规程，品质部负责人监督执行。 4程序PROCEDURE 定义和原理 沙门氏菌广泛存在于动物的肠道和内脏，以及被粪便污染的水和土壤中，是细菌性食物中毒的主要病因。本方法利用沙门氏菌呈辛酸酯酶阳性，而氧化酶和脂肪酶均呈阴性的特性，对物料、产品进行沙门氏菌检验。 材料和设备 紫外灯：波长366nm，功率不小于6W。 放大镜：3至4倍。 毛细滴管。 LX-B35L压力蒸汽灭菌锅。 无菌的培养皿。 无菌的接种环。 培养基和试剂 SCDLP液体培养基：按《化妆品卫生规范》（2007版）或使用商品培养基干粉配制。 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：按—2010附录配制或使用商品试剂。 SS琼脂培养基（含1%蔗糖）：牛肉浸膏(或牛肉粉)，蛋白胨，乳糖，蔗糖，胆盐，柠檬酸钠，硫代硫酸钠，柠檬酸铁，煌绿，中性红，琼脂，蒸馏水1000mL。 HE琼脂培养基：按—2010附录或使用商品培养基干粉配制。 玉米油维多利亚蓝琼脂培养基：灭菌后的基础培养基冷却至50℃左右，边摇边加入玉米油乳化液。倾注平皿，制成平板。基础培养基及玉米油乳化液配方如下： a）基础培养基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，氯化钠5g，琼脂13g，水900mL，。将 各成分加入水中，加热溶解。调节，116℃15min高压灭菌。 b）玉米油乳化液：玉米油100mL，%维多利亚蓝水溶液100mL，%琼脂溶液80mL， 吐温801mL。玉米油加维多利亚蓝水溶液混合，边振动边在沸水中加热溶化。然后， 放入分液漏斗中，弃去蓝色水部分，再将着色的脂肪用水洗1-2次。将着色脂肪20mL 加入810mL琼脂溶液中，再加1mL吐温80，116℃15min高压灭菌。冷却后用超声 波乳化。
沙门氏菌检测方法的研究进展
沙门氏菌检测方法的研究进展 摘要：沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，而且，沙门氏菌的检验在食品检测中具有重要意义。建立一种快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。本文通过查阅大量文献，详细阐明了沙门氏菌的各种快速检测方法的原理，对近年来沙门氏菌的检测进展进行了综述。认为，传统方法可以对沙门氏菌做出鉴定，但需要4~7 d的时间；以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，且灵敏性高和特异性强；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于沙门氏菌检测。但是这些方法仍然存在一定的不足，需要进一步加以改进，关于食品中沙门氏菌的检测方法的研究还有待进一步深入。 关键词：沙门氏菌；检测；传统方法；免疫；分子
前言 沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病之一，沙门氏菌属于肠杆菌科细菌，由此类细菌引起的各种动物的疾病称为沙门氏菌病。沙门氏菌在自然界有广泛的宿主，少数沙门氏菌对宿主有选择性，属于偏嗜性沙门氏菌，绝大多数对人和动物均适应，可寄居在哺乳类、爬行类、鸟类、昆虫及人的胃肠道中，种类繁多的家养和野生动物的感染率在1%—20%或者更高。故各种家禽、家畜在喂养、屠宰、运输、包装等加工处理过程中均有污染的机会。各种动物源性食物是引起沙门氏菌感染的最常见媒介物。除初生动物，人畜感染后一般呈无症状带菌状态,长期排菌，污染肉蛋产品，同时它们也可表现为有临床症状的致死疾病，可能加重病情或者增加死亡率，或者降低动物生产力等，对养殖业的经济效益影响较大，并严重影响人类健康。近年来，随着免疫学实验技术和分子生物学技术的发展，沙门氏菌检验技术的研究也有了新的研究进展。本文将近年来国内外关于沙门氏菌检验技术研究进展情况作以概述，供参考。 1 传统的检测方法（国标法） 常规检验技术基本特征与步骤:沙门氏菌常规检验技术具有以下3项特征：常规方法是编入国标方法或国际方法中的基本方法，是检验其他检测方法准确性、敏感性的参照；常规方法最终将能分离到细菌纯培养物；常规方法简单、准确、可重复性强、有一定的灵敏性。随着经济和技术的发展以及研究的深入，标准方法也处于不断进步，不断更新中。 常规检验包括以下5个基本步骤：前增菌和增菌；分离纯培养物；属和种的鉴定；血清学分型；菌型的判定和结果报告。在具体实践中用此方法检测畜产品中的沙门氏菌时，应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。 虽然该方法鉴定结果准确可靠，但由于沙门氏菌血清型繁多，生化特性各异，检验程序复杂，耗时长，至少需要4~7d才可得到准确的检测结果[1,2]。 2 免疫学标记检测方法 免疫标记技术就是将已知抗体或者抗原上标记上易显示的物质(标记分子)，通过检测标记物反映有无抗原抗体反应,从而间接检测出微量的抗原或者抗体。 所谓的标记分子是那些即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出来，高敏感性的标记分子主要有突光素、酶、放射性同位素3种。免疫标记技术不仅大大提高了试验的敏感性，和光镜或电镜技术结合后，能对待检物质做精细定位，为临床研究和诊断提供了极大的方便。由此建立的沙门氏菌免疫学检测方法有多种，包括免疫酶标记技术，使用较多的如酶
沙门氏菌检验(现用)
沙门氏菌的检验 1．目的 规沙门氏菌检测方法，使产品检验有据可依。 2．消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃仪器、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 注：本实验采用湿热灭菌法，吸管、培养皿、培养基等盖好塞子并包好瓶口在高压灭菌锅中按要求的温度和压力灭菌，一般是121℃（1.5MPa）下灭菌20min。3．原理 沙门氏菌的检验分四个连续阶段： 4．操作步骤 4.1 准备工作 配制实验所需的缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸培养基（无需灭菌）、HE培养基、三糖铁培养基等，并将准备好的均质杯、吸管、培养皿、大试管等一起灭菌。 4.2 前增菌 在无菌环境下，称取25g待检样品放入盛有225ml灭菌好的缓冲蛋白胨水中，
然后放到36±1℃的恒温培养箱进行前增菌4-6h; 4.3 增菌 在无菌环境下，用灭菌好的吸管吸取10ml前增菌液接种与100ml亚硒酸盐胱氨酸培养基中进行二次增菌，恒温培养箱36±1℃，培养18-24h; 4.4 分离培养 将增菌培养液摇匀，以无菌操作，用直径3mm的接种环挑取一环，划线于表面无凝结水的BS和SS琼脂平板各一个，于36±1℃培养18-24h。观察各个平板上有无典型或可疑沙门氏菌属的菌落。如无典型或可疑菌落，应再继续培养24±2h。然后观察培养的平板（黄色的菌落是大肠杆菌；蓝绿色或蓝色，产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色为可疑沙门氏菌）。 沙门氏菌属各亚属在其他选择性琼脂平板的菌落特征 4.5 生化实验 用灭菌好的接种针在培养平板上挑取可疑的沙门氏菌单菌落，接种到三糖铁培养基上，恒温培养箱36±1℃，培养18-24h; 典型沙门氏菌培养物斜面显红色（碱性），底端显黄色（酸性），有气体产生，形成硫化氢（琼脂变黑）。 三糖铁培养基变化表
沙门氏菌快速检测方法
沙门氏菌快速检测方法文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
沙门氏菌快速检测方法 1 试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3 所用试剂和培养基 1.3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15 min，冷至常温。1.3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1 配制BPW培养基（第一天） 2.2 培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟, 关灯60 min后使用。（第一天） 2.3 预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm 下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4 配制TTB增菌液（第一天） 2.5 增菌（第二天） 2.5.1 接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1mL，转种于9mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。
2.5.2 2.6 配制沙门氏菌显色培养基平板（第二天） 2.6.1 取瓶内干粉4.75g，用100mL蒸馏水溶解，可按比例扩大或者缩小。 2.6.2 混合加热至100℃，搅拌加热至完全溶解，冷却至50℃倒平板。 2.6.3 样品用画线或者涂布法接种，37℃培养24小时。 2.6.3 观察菌落颜色：（第三天）
沙门氏菌检测
沙门氏菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2℃～5℃。 1.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 1.3 均质器。 1.4 振荡器。 1.5 电子天平：感量0.1g。 1.6 无菌锥形瓶:容量500ml，250ml。 1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。 1.8 无菌培养皿：直径90mm。 1.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 1.10 无菌毛细管。 1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 1.12 全自动微生物生化鉴定系统。 2 培养基和试剂 2.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录中1。 2.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录中2。 2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录中3。 2.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录中4。 2.5 HE琼脂：见附录中5。 2.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录中6。 2.7 沙门氏菌属显色培养基。 2.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中7。 2.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。 2.10 尿素琼脂（pH7.2）：见附录中9。 2.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录中10。 2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11。
2.13 糖发酵管：见附录中12。 2.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录中13。 2.15 半固体琼脂：见附录中14。 2.16 丙二酸钠培养基：见附录中15。 2.17 沙门氏菌O和H诊断血清。 2.18 生化鉴定试剂盒。 3 操作方法 3.1 试验前准备 3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2 前增菌 称取25g（ml）样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8 h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。 3.3 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10ml TTB内，于42℃±1℃培养18 h～24h。同时，另取1ml，转种于10ml SC内，于36℃±1℃培养18h～24h。 3.4 分离 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h
沙门氏菌检验
沙门氏菌检验 范围1.本法适用于食品中沙门氏菌的检验。 2.设备和材料 处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。 2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 2.3均质器。 2.4振荡器。 2.5电子天平：感量0.1g。 2.6无菌锥形瓶：容量500mL，250mL。 2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌培养皿：直径90mm。 2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 2.10无菌毛细管。 2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.12全自动微生物生化鉴定系统。 3.培养基和试剂 3.1缓冲蛋白胨水（BPW）。 ）增菌液。TTB四硫磺酸钠煌绿（3.2．
3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。 3.4亚硫酸铋（BS）琼脂。 3.5HE琼脂。 3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。 3.7沙门氏菌属显色培养基。 3.8三糖铁（TSI）琼脂。 3.9蛋白胨水、靛基质试剂。 3.10尿素琼脂（pH7.2）。 3.11氰化钾（KCN）培养基。 3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。 3.13糖发酵管。 3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。 3.15半固体琼脂。 3.16丙二酸钠培养基。 3.17沙门氏菌O和H诊断血清。 3.18生化鉴定试剂盒。 4.检验程序 沙门氏菌检验程序见图1。
检样36℃±1℃，18h～ 24h 25g（mL）样品36℃±1～℃，℃±42118h24h ℃，18h～24h 1mL+SC10mL 1mL+TTB10mL 36℃±1℃，40h～48h 36℃±1℃，18h～24h 1沙门氏菌检验程序图操作步骤5. 前增菌5.1称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min 均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。
沙门氏菌检测的基准方法
国际标准 ISO 6579 食品和动物饲料的微生物学 ——沙门氏菌检测的基准方法 内容 1 范围 2 参考标准 3 定义 4 原理 4.1 概要 4.2前增菌——非选择性液体培养基 4.3 增菌——选择性液体培养基 4.4 划平板和鉴定 4.5 确认 5 培养基、试剂和血清 5.1 概要 5.2 培养基和试剂 5.3 血清 6 设备和玻璃器皿 7 采样 8 检验样品的制备 9 程序 9.1 试验样品和原始悬浮液 9.2 非选择性前增菌 9.3 选择性增菌 9.4 划平板和鉴定 9.5 确认 10 结果表示 11 检验报告 12 质量保证 附录A （标准化）程序图表 附录B （标准化）培养基和试剂的成份及准备 附录C （非标准化）实验室间试验结果 参考书目
ISO（国际标准化组织）是国际标准化团体的全世界同盟。通常由ISO技术委员会来执行国际标准的制订工作（ISO成员体）。通常由ISO技术委员会来完成国际标准的准备工作。在委员会中，若对建立的技术委员会有兴趣的话，每个成员体有权作为代表。国际组织、政府或非政府组织，通过ISO联系，也可以参加这项工作。在所有电工标准方面，ISO与国际电工委员会（IEC）紧密合作。 国际标准按照ISO/IEC指南第三章所列的规则草拟。 技术委员会的主要任务是准备国际标准。被技术委员会采用的国际标准草案以投票方式在成员体内运行。至少要75%成员体的投票赞成，才能作为一个国际标准发布。 要引起注意的可能性是:本国际标准的一些要素可能是专利权主体。ISO不应承担鉴定部分或全部的这种专利权。 ISO6579是由食品ISO/TC34技术委员会、微生物SC9分委员会所准备的。 第四版删除或更换了第三版（ISO6579：1993），并已作了技术性修订。 附录A和附录B形成了本国际标准的标准化部分。附录C仅为资料。
沙门氏菌基本知识及检测方法
沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有2000多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属Salmonella 。本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。 根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。第一类群： 专门对人致病。 如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(甲型、乙型、丙型)。第二类群： 能引起人类食物中毒——食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。第三类群： 专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。 一、xx属的生物学特征： 1.形态染色特性： G-无芽孢杆菌。大小通常为 0.7～ 1.5μm × 2.0～ 5.0μm，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。需氧或兼性厌氧菌，生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃，适宜pH为
6.8～ 7.8，对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛，胆盐可促进其生长。 2.培养特性： 需氧或兼性厌氧菌；生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃；适宜pH为 6.8～ 7.8；对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛；胆盐可促进其生长。 §普通xx： 圆形、光滑、无色半透明、边缘整齐或不太整齐的中等大小(2～4mm)菌落。鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒、甲型副伤寒沙门氏菌等只能长成细小菌落。 §xxxx和伊红xxxx(EMB)： 菌落无色半透明 §SSxx和DHLxx： 无色半透明、中心黑色或几乎全部黑色(多数菌株)的菌落 §HExx： 形成蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌株菌落中心带黑色。 3.生化特性： 发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇产气；不发酵乳糖、蔗糖、水杨苷和侧金盏花醇；产生硫化氢；原硝酸盐；不水解尿素；不液化明胶；V-P反应阴性;不产吲哚(靛基质试验阴性)；能利用枸橼酸盐(个别菌株不利用)。 表xx属细菌一般生化特性
沙门氏菌检测方法
沙门氏菌快速检测方法 1 试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3 所用试剂和培养基 1.3.1缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15 min，冷至常温。 1.3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1 配制BPW培养基（第一天） 2.2培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟, 关灯60 min后使用。（第一天） 2.3 预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4配制TTB增菌液（第一天） 2.5增菌（第二天） 2.5.1接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于9mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。 2.5.2
2.6配制沙门氏菌显色培养基平板（第二天） 2.6.1 取瓶内干粉4.75g，用100mL蒸馏水溶解，可按比例扩大或者缩小。 2.6.2 混合加热至100℃，搅拌加热至完全溶解，冷却至50℃倒平板。2.6.3 样品用画线或者涂布法接种，37℃培养24小时。
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验 食品学院 14食品质量与安全1班 刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君 201430520115 201430520116 201430520121 201430520122 摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。 关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定 前言 沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1仪器设备 均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃ 吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头
电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂 1.1.2试剂药品 鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡 1.1.3培养基 蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基 1.2 实验方法 1.2.1培养基的制备 1.2.1.1培养基的配制步骤 蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。分装10瓶，每瓶90ml 四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌 121 ℃，15 min灭菌冷却后至30℃，每100ml 基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml 1.2.1.2配制培养基的注意事项 （1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末； （2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量； （3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。 1.2.2 沙门氏菌群检测 1.2.2.1沙门氏菌检测程序
疾控中心沙门氏菌检验原始记录
检验原始记录（沙门氏菌） 样品编号：疾控检[201 ] 号 _______________________________________________ 检验依据：《年国家食品污染和有害因素风险工作手册》___________ 检验项目：沙门氏菌_________ 一、培养基及试剂： 1、缓冲蛋白胨水（BPVV：生产厂家____________________ 批号 _________________ 2、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）:生产厂家 ___________ 批号 _________________ 3、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）:生产厂家_____________ 批号 _________________ 4、沙门氏菌显色平板：生产厂家_________________ 配置日期 __________________ 5、BS平板：生产厂家 ___________________________ 配置日期 __________________ 6、三糖铁琼脂（TSI）:生产厂家 _________________ 配置日期 _________________ 7、革兰氏染液：生产厂家___________________________ 批号 __________________ &沙门氏菌属诊断血清：生产厂家______________________ 批号 __________________ 二、样品处理：无菌操作取检样g （mL加入盛有—BPW的无菌均质袋内，固体样品用拍击式均质器拍打1 mins 2min，制成1：10均匀稀释液备用。液体样品不需均质，振荡混匀。如需要，测定pH 值，用1mol/L无菌氢氧化钠或盐酸调pH至±。冷冻产品，应在45C以下不超过15min或2Cs 5C不超过18h解冻。 三、实验记录： 25g 检样+BPW225mL ------------- BS 显色培养基 °C放入时间: 取出时间: C放入时间: 取出时间: C放入时间：取出时间: C放入时间：取出时间：C放入时间：取出时间:
沙门氏菌检验(现用)
沙门氏菌得检验 1.目得 规范沙门氏菌检测方法,使产品检验有据可依。 2.消毒灭菌要求 微生物检测用得玻璃仪器、金属用具及培养基、被污染与接种得培养物等,必须经灭菌后方能使用、 注:本实验采用湿热灭菌法,吸管、培养皿、培养基等盖好塞子并包好瓶口在高压灭菌锅中按要求得温度与压力灭菌,一般就是１2１℃(１。5MＰa)下灭菌2０min。 ３.原理 沙门氏菌得检验分四个连续阶段: ４.操作步骤 4。1 准备工作 配制实验所需得缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸培养基(无需灭菌)、HＥ培养基、三糖铁培养基等,并将准备好得均质杯、吸管、培养皿、大试管等一起灭菌。 4、2 前增菌
在无菌环境下,称取25ｇ待检样品放入盛有2２5ml灭菌好得缓冲蛋白胨水中,然后放到36±1℃得恒温培养箱内进行前增菌４—6h; 4、3 增菌 在无菌环境下,用灭菌好得吸管吸取1０mｌ前增菌液接种与100ｍl亚硒酸盐胱氨酸培养基中进行二次增菌,恒温培养箱３6±1℃,培养18-2４h; 4、4 分离培养 将增菌培养液摇匀,以无菌操作,用直径3mm得接种环挑取一环,划线于表面无凝结水得ＢS与SS琼脂平板各一个,于３6±1℃培养１8－24h。观察各个平板上有无典型或可疑沙门氏菌属得菌落、如无典型或可疑菌落,应再继续培养2４±２ｈ。然后观察培养得平板(黄色得菌落就是大肠杆菌;蓝绿色或蓝色,产硫化氢,菌落中心黑色或几乎全黑色为可疑沙门氏菌)。 沙门氏菌属各亚属在其她选择性琼脂平板得菌落特征 4。5 生化实验 用灭菌好得接种针在培养平板上挑取可疑得沙门氏菌单菌落,接种到三糖铁培养基上,恒温培养箱3６±１℃,培养１８-２4h; 典型沙门氏菌培养物斜面显红色(碱性),底端显黄色(酸性),有气体产生,形成硫化氢(琼脂变黑)。 三糖铁培养基变化表 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内得反应结果
沙门氏菌检验
沙门氏菌检验中血清学试验常见问题 发布日期：2012-09-24 来源：北京陆桥技术有限责任公司浏览次数：135 核心提示：沙门氏菌检验中血清学试验常见问题 血清学鉴定是沙门氏菌检验中的重要鉴定方法，包括菌体抗原（O）鉴定、鞭毛抗原（H）鉴定和Vi抗原鉴定。由于血清学试验涉及的内容很多，所以我们在此给大家列出几个常见问题，以供大家在日常工作中参考。 1、沙门氏菌判定时以生化试验结果为主还是血清学试验结果为主？ 我们在判定时应该以生化试验结果为主，在生化试验的基础上进行血清学判定。有的试验人员会直接用多价血清进行试验，不进行生化试验，这是绝对不可取的。因为血清学的原理是抗原抗体结合，非沙门氏菌的微生物也有可能带有沙门的类似抗原的。所以我们做鉴定的时候，必须先进行生化试验，在生化试验的基础上进行血清学鉴定。 2、血清学试验要做到什么程度？ 如果我们只需要鉴定某个菌株是否属于沙门氏菌，那只需要做O多价和H多价血清就可以了。如果需要鉴定某个菌株具体是什么沙门氏菌，比如是否为鼠伤寒沙门氏菌或是否为肠炎沙门氏菌，那就需要进行血清学分型试验，从多价血清一直做到O抗原和H抗原的单因子，然后参照GB 4789.4-2010沙门氏菌检验标准中附录B的表格查找对应的沙门菌名。 3、O多价血清不凝集，就一定是O抗原阴性么？ 我们在做O多价血清时，如果没有凝集并不能直接判定为阴性，因为我们还要考虑Vi抗原的影响。Vi抗原属于K抗原群，是会阻隔O抗原和相应抗体的结合，所以有Vi抗原存在时，O多价血清是不会凝集的。GB 4789.4-2010沙门氏菌检验标准中提到已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌。因此，我们必须去除Vi抗原的影响。具体方法是将待检菌做成浓菌液，放入100℃沸水中煮沸15-60分钟，目的是破坏Vi抗原，然后再挑取菌液做O多价血清。如果还是不凝集，才能判定为阴性。
沙门氏菌检验
沙门氏菌检验1.范围 本法适用于食品中沙门氏菌的检验。 2.设备和材料 处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。 2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 2.3均质器。 2.4振荡器。 2.5电子天平：感量0.1g。 2.6无菌锥形瓶：容量500mL，250mL。 2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌培养皿：直径90mm。 2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 2.10无菌毛细管。 2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.12全自动微生物生化鉴定系统。 3.培养基和试剂 3.1缓冲蛋白胨水（BPW）。 3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。
3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。 3.4亚硫酸铋（BS）琼脂。 3.5HE琼脂。 3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。 3.7沙门氏菌属显色培养基。 3.8三糖铁（TSI）琼脂。 3.9蛋白胨水、靛基质试剂。 3.10尿素琼脂（pH7.2）。 3.11氰化钾（KCN）培养基。 3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。 3.13糖发酵管。 3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。 3.15半固体琼脂。 3.16丙二酸钠培养基。 3.17沙门氏菌O和H诊断血清。 3.18生化鉴定试剂盒。 4.检验程序 沙门氏菌检验程序见图1。 42℃±1℃，18h～24h
36℃±1℃，40h～48h 36℃±1℃，18h～24h 图1沙门氏菌检验程序 5.操作步骤 5.1前增菌 称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。 如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。 5.2增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。 5.3分离 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。与36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD平板、HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。