拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的构建及转化鉴定
【实验】β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS) 组织化学染色检测转基因植物
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、 0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
一样，其检测结果不是定量的。
整理课件
用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的 特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花 和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和 马铃薯这些植物的茎和叶在染色前必须切成薄片。 有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有 所帮助。
整理课件
实验材料和试剂
实验材料：转GUS基因的烟草叶片 试剂：
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物
整理课件
实验目的
学习转GUS基因的植物组织化学染 色方法，掌握染色的原理。
整理课件
实验原理
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用 的一个报告基因。GUS基因是从大肠杆菌中分离出来的，在 GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融 合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检 测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用Xgluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进 行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割 葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧 基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。
3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μl的N，N-二甲基甲酰胺 （DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。
拟南芥实验报告
一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。
在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。
RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。
本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。
五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。
拟南芥浸花法转化流程
拟南芥浸花法转化流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!拟南芥浸花法转化流程一、准备工作阶段。
在进行拟南芥浸花法转化之前，需要做好充分的准备。
GUS 组织化学染色-拟南芥
幼苗GUS染色实验GUS洗液配方：0.1 M PBS, pH 7.010mM EDTA2mM 亚铁氰化钾potassium ferrocyanide2mM 六氰合铁酸钾potassium ferricyanide300mL中加0.254 g亚铁氰化钾，0.198 g六氰合铁酸钾，EDTA 6 mL（10 mM）GUS染色液(1mM)就是把5 mg X-Glus（5 mg加100µL DMSO助溶，X-Glus用前离心3min）加到5 mL洗液里即成染色液。
一次配5 mL染色液，1.5 mL离心管每管分装200 µL，锡纸包住-20℃保存。
步骤：一般5d幼苗可进行试验，早上做以方便白天随时观察幼苗着色情况。
1.90%丙酮固定20min；(丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好，因此可用于GUS染色前的固定，可防止GUS信号的扩散。
缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。
一般4℃下20分钟为宜)2. 加1 mL GUS洗液洗去丙酮，洗2遍；3. 加GUS染色液，冰上抽真空15-20 min；4. 37℃放置，隔一阵观察一下，染上色了就进行下面步骤；5. 吸出染色液，加入1 mL 70%乙醇，停止染色反应及脱色；6. 更换几次乙醇直到脱色完全；7. 解剖镜及显微镜拍照观察载玻片上加适量HCG透明液，用镊子取出幼苗在透明液中铺平，盖上盖玻片，解剖镜观察整株，显微镜观察细节并拍照。
实验原理：GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，相当稳定而不易降解。
根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）。
其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。
拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定
拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定作者：董万春樊婷婷阳立波等来源：《安徽农业科学》2015年第13期摘要 [目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因，构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株。
[方法]提取拟南芥mRNA，反转录成cDNA，并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长，通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接，将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上；然后转化至Trans1T1感受态细胞中，菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认。
将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株，通过浸花法侵染拟南芥野生型植株，通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株。
[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体；通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株。
[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础。
关键词拟南芥；CDR6基因；过量表达载体；转基因植株中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-063-02Abstract [Objective] To build up the carrier of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and isolate corresponding transgenic lines. [Method] Total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings and reverse transcribed as PCR template. CDS fragments of CDR6 gene were amplified through RT PCR. Using the restriction endonuclease and T4 DNA ligase， CDS fragments were subsequently cloned into pXB094 vector， and then were transformed into TransT1 phage resistant competent cells. Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed to confirm that CDS of the Arabidopsis CDR6 gene was successfully cloned. The recombinant plasmids were transformed into Agrobacterium GV3101 cells. Wild type plants were transformed using floraldip method and screened to obtain the desired transgenic plants. [Result] Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed and recombinant plasmids were confirmed. Stably transgenic lines of CDR6 overexpression were obtained through antibiotic screening， and verified through genetic methods. [Conclusion] Construction of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and screening of transgenic plants laid the foundation for functional analysis of CDR6.Key words Arabidopsis thaliana； CDR6； Overexpression carrier； Transgenic plant拟南芥CDR6基因cDNA全长1 120 bp，编码一种含有NC结构域的功能未知蛋白[1-3]，目前对其生物学功能研究尚未见报道。
拟南芥锌指蛋白AtZFN1基因的克隆及遗传转化
Kyewords: dopsis thaliana;Zinc finger protein; Overexpression; RNAi; Promoter
Directed by： Prof. JIN Hong Prof. YANG QingChuan
Applicant for Master degree：ZHOU Guanghui ( master of Botany)
3.4.2 质粒提取及 PCR ................................................ 34 3.4.3 PCR 产物的目的片段回收........................................ 34 3.4.4 回收产物的连接和转化 ......................................... 34 3.4.5 单克隆的挑取及筛选 ........................................... 34 3.4.6 ihpRNA 表达载体的构建......................................... 34 3.4.7 制备农杆菌感受态 ............................................. 34 3.4.8 农杆菌转化及其鉴定 ........................................... 34 3.4.9 花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥 ................................. 35 3.5 结果与分析 ..................................................... 35 3.5.1 拟南芥 AtZFN1 基因的超表达载体构建和转化 ...................... 35 3.5.2 构建拟南芥 AtZFN1 基因启动子的表达载体并转化 .................. 36 3.5.3 拟南芥 AtZFN1 基因 RNAi 表达载体构建及转化 ..................... 37 3.6 讨论 ........................................................... 40 3.7 小结 ........................................................... 40 4 再生植株的转基因检测 ............................................... 40 4.1 材料 ........................................................... 40 4.1.1 植物材料 ..................................................... 40 4.1.2 生化试剂 ..................................................... 40 4.1.3 溶液的配制 ................................................... 41 4.2 方法 ........................................................... 41 4.2.1 基因组 DNA 提取 ............................................... 41 4.2.2 总 RNA 提取及反转录 ........................................... 41 4.2.3 转基因拟南芥 PCR 检测 ......................................... 41 4.2.4 RT-PCR 检测获取的转基因植株................................... 41 4.2.5 转基因拟南芥 GUS 检测 ......................................... 41 4.3 结果与分析 ..................................................... 42 4.3.1 PCR 检测拟南芥的抗性苗........................................ 42 4.3.2 拟南芥抗性植株 RT-PCR 检测 .................................... 43 4.3.3 GUS 组织化学染色检测 .......................................... 44 4.4 讨论 ........................................................... 44 4.5 小结 ........................................................... 45 5 AtZFN1 基因的表达分析 ............................................... 45 5.1 材料 ........................................................... 45 5.2 方法 ........................................................... 45 5.2.1 引物设计 ..................................................... 45
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，广泛用于研究植物的生长发育和胁迫响应机制。
拟南芥rd29A启动子是一个重要的胁迫响应启动子，在胁迫条件下可以激活rd29A基因的转录，进而产生rd29A蛋白来应对植物的胁迫。
为了研究rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况，我们进行了GUS活性分析。
GUS活性分析是通过测量GUS基因编码的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性来反映启动子的转录水平。
本文将详细介绍我们的实验设计和结果分析。
我们构建了一个含有rd29A启动子和GUS基因的表达载体。
然后，将该载体转化到拟南芥中，得到转基因植株。
接下来，我们将转基因植株经过不同的胁迫处理，包括高盐、干旱、低温和激素处理。
在高盐胁迫下，我们观察到rd29A启动子的GUS活性显著增加。
这表明rd29A启动子在高盐条件下能够被激活，从而产生更多的rd29A蛋白来应对盐胁迫。
我们进行了激素处理实验，包括ABA（脱落酸）和SA（水杨酸）。
结果显示，rd29A 启动子在ABA和SA处理下的GUS活性均显著增加，说明rd29A在激素信号通路中的调控作用。
我们通过GUS活性分析研究了拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况。
实验结果表明，rd29A启动子在高盐、干旱、低温和激素处理下均能被激活，从而进一步证实了该启动子在植物胁迫响应中的重要性。
这为进一步探究rd29A启动子的调控机制和应对胁迫的分子机制提供了重要线索。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的构建及转化鉴定蔡薇;支添添;任春梅【摘要】HGO基因编码的尿黑酸1,2双加氧酶催化酪氨酸降解途径中的倒数第三步.本研究构建了拟南芥HGO基因启动子与GUS的融合表达载体,采用农杆菌介导法转化拟南芥获得转基因株系.经GUS组织化学染色鉴定,证明拟南芥HGO基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建且能正常启动GUS基因的表达,为深入研究拟南芥HGO基因的表达特征创建了有价值的材料.%The HGO gene encodes the 1,2-homogentisate dioxygenase,which catalyzes the last third step in the Tyr degradation pathway.In this study,a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana HGO gene promoter and GUS gene was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium-mediated transformation.Results from histochemical GUS assay suggested that fusion expression vector of HGO gene promoter and GUS gene was successfully constructed and it drives the expression of GUS gene successfully.Our results create valuable materials for studying the expression characteristics of HGO gene in Arabidopsis thaliana.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2017(031)003【总页数】4页(P256-259)【关键词】拟南芥;HGO;启动子;同源重组;基因克隆【作者】蔡薇;支添添;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q784酪氨酸降解途径在动物体内是必不可少的一条代谢途径［1］，尿黑酸1，2双加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）是酪氨酸降解途径中倒数第三步，可将尿黑酸氧化分解成马来酰乙酰乙酸，再经马来酰乙酰乙酸异构酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸，最后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解［2］。
在动物中，HGO基因是不可缺少的，HGO的缺失会导致尿黑酸血症［3］。
在植物中，除发现HGO基因突变可以促进拟南芥幼苗的生长［4］外，无其他研究成果。
本试验以模式植物拟南芥为材料，构建了HGO基因启动子与GUS的融合表达载体，将其转入拟南芥中，抗性筛选获得了稳定遗传的转基因株系，利用GUS染色检测到拟南芥HGO基因启动子成功转入植株内且能正常启动GUS基因的表达。
1.1 实验材料拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col-0和载体pCAMBIA1301由作物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题组保存，ClonExpressⅡ重组试剂盒从Vazyme公司购买。
1.2 植物的培养和生长条件将拟南芥种子用消毒液（20%bleach＋0.1% Triton100）浸泡10 min后，在超净台上用无菌水清洗4～5次，直接播种在含1%蔗糖的MS固体培养基上。
4℃黑暗处理3 d后，转入培养室生长，培养温度（22±2）℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗［5］。
待其生长7 d后，移栽到营养土（东北黑土与蛭石的体积比为1∶1）中并盖上透明塑料盖培养1～2 d，生长条件同上。
1.3 表达载体的构建1.3.1 设计引物及目的片段的扩增在TAIR网站上找到已公布的拟南芥HGO基因启动子序列，经plantcare在线分析软件分析后选取ATG前2000 bp序列，运用引物设计软件Primer Premier5设计特异性引物PstⅠ-F/NcoⅠ-R。
因所选表达载体需含有GUS报告基因，而所有含GUS报告基因的载体在35S启动子下游都只含NcoⅠ和BglⅡ这两个可选限制性酶切位点，BglⅡ酶切位点包含在GUS基因内，而NcoⅠ与目的基因中存在同源序列。
针对这一问题采用同源重组法构建载体，先将载体线性化，选取两个限制性内切酶PstⅠ和NcoⅠ对载体进行双酶切。
因此需要在引物5′端引入线性化载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′最末端分别带有和线性化载体两末端对应的完全一致的序列［6］，引物为：下划线部分为酶切位点，5′端前端为入线性化载体末端同源序列。
根据引物合成时预测的退火温度，选用67℃为PstⅠ-F/NcoⅠ-R退火温度。
用SDS法［7］提取拟南芥Col-0野生型叶片基因组DNA，以此为模板用高保真酶进行PCR扩增。
扩增后的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收并纯化。
1.3.2 拟南芥HGO基因与GUS融合载体的重组及鉴定选用PstⅠ和NcoⅠ限制性内切酶将pCAMBIA1301载体线性化（载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增）。
利用ClonExpressⅡ试剂盒进行重组反应。
体系为5 ×CEⅡBuffer 4μL，线性化载体8μL，插入片段扩增产物1μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 5μL。
将配置好的体系置于37℃反应30 min，反应完后将反应管立即置于冰上冷却5 min。
将20μL冷却反应液，加入到200μL的感受态中，轻弹管壁混匀，在冰上放置30 min。
42℃热激60～90 s，冰水浴孵育2 min。
加入900μL LB液体培养基，37℃孵育10 min充分复苏。
37℃150 rmp摇菌45 min。
6000 g离心2 min，去部分上清液，将其充分混匀，取100μL混匀后的菌液涂布在含有50 mg/L kan的LB培养基上。
37℃倒置过夜培养［8～11］。
取阳性克隆送华大基因公司测序。
采用电击法将测序验证正确的重组载体质粒转化到根癌农杆菌GV3101中，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定。
1.3.3 拟南芥的遗传转化及筛选挑选菌落PCR验证正确的农杆菌单菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）、庆大霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的YEB液体培养基里进行活化处理，28℃、220 rpm振荡培养18～24 h。
6000 g离心大量活化菌液2 min，弃上清，用农杆菌悬浮液（5%蔗糖＋1/2 MS＋0.02%Silwet-L77＋0.01%6-BA）将菌体重悬至OD600在0.6～1.0之间。
利用浸花法［12］转化拟南芥，收取T0代种子，在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培养基上筛选成功转入pHGO：：GUS表达载体的转基因植株，进一步采用PCR进行植株鉴定，用GUS组织化学法检测启动子活性。
2.1 拟南芥HGO基因启动子的克隆根据已知的序列信息，设计带特异酶切位点的引物，扩增引物分别含PstⅠ和NcoI的酶切位点，以拟南芥Col-0野生型基因组DNA为模板，采用高保真酶进行PCR扩增，PCR产物预期大小为2002 bp。
将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明扩增产物符合预期大小（图1）。
这表明PstⅠ-F和NcoⅠ-R能成功扩增出目的片段。
2.2 pHGO∶∶GUS融合表达载体的构建将PCR产物和线性化载体用ClonExpressⅡ试剂盒重组，构建重组后产物采用热激法转入大肠杆菌E.coli DH5α，随机挑选单菌落进行PCR检测（图2）。
菌落PCR扩增产物大小在2000 bp左右，与预期结果一致。
2号泳道加入的模板为水，此泳道没有出现条带，说明PCR体系没有DNA污染；3～6号泳道条带大小均在2000 bp左右，与预期大小相似。
选取条带最亮的6号大肠杆菌扩大培养后提取质粒送至上海博尚生物技术有限公司进行测序鉴定。
测序结果显示：6号菌种插入片段大小为2002 bp，经过DNAMAN软件序列比对分析，发现目的基因与GUS 之间的结合位点与预期一致，且没有移码乱码现象，这表明pHGO∶∶GUS融合表达载体（图3）成功构建。
2.3 pHGO∶∶GUS融合表达载体的遗传转化及鉴定将pHGO∶∶GUS重组表达载体通过电击法转入根癌农杆菌GV3101中，并通过农杆菌介导的浸花法转化模式植物拟南芥，进行融合基因的稳定表达实验。
融合表达载体具有潮霉素抗性，将浸染后当代成熟的种子铺种在MS培养基上春化后在长日照下生长，具有潮霉素抗性的植株正常生长。
将抗性苗移栽至人工土壤中，简易SDS法提取潮霉素抗性植株基因组DNA，以引物对pC1301-F/pC1301-R进行特异性扩增，引物为：结果表明，大部分潮霉素抗性植株能产生特异扩增带（图4），说明融合表达载体已成功整合到拟南芥基因组中。
2.4 转基因植株GUS检测为了检测转基因植株中的HGO启动子是否具有活性，随机挑选具潮霉素抗性和PCR阳性的T2代转基因拟南芥进行报告基因的检测。
将检测植株的种子铺种在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培养基上，置于长日照（16 h光照/8 h黑暗）下培养7～9 d，取无菌苗进行GUS组织化学法检测，通过实体显微镜观察染色结果。
结果表明：转入pCAMBIA1301质粒（含35S启动子）的阳性对照（图5A）幼苗中，GUS基因在根、下胚轴、叶中都高度表达；转入拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的转基因植株幼苗（图5B），GUS基因在根、下胚轴及子叶中表达较强，在真叶中的表达较弱；而GUS基因未在阴性对照幼苗中表达（图5C）。
在构建表达载体时，需要精心选择酶切位点及标记基因。
当目的基因中含有较多的常用酶切位点时，不得不选择酶切效率低、价格昂贵的非常用限制性内切酶或构建中间载体，这样会大幅度降低实验成功率。
本研究中因目的基因内含较多常用酶切位点，所以选用了Vazyme公司ClonExpressⅡ重组试剂盒，此试剂盒采用同源重组的原理，不受酶切位点的限制，降低了载体的局限性。
本研究成功构建了拟南芥HGO基因启动子与GUS载体的融合表达载体，经过电泳及测序检测，证实目的片段与pCAMBIA1301在预测位点重组且插入片段无错配现象，大小正确。