拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的构建及转化鉴定
拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的构建及转化鉴定蔡薇;支添添;任春梅【摘要】HGO基因编码的尿黑酸1,2双加氧酶催化酪氨酸降解途径中的倒数第三步.本研究构建了拟南芥HGO基因启动子与GUS的融合表达载体,采用农杆菌介导法转化拟南芥获得转基因株系.经GUS组织化学染色鉴定,证明拟南芥HGO基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建且能正常启动GUS基因的表达,为深入研究拟南芥HGO基因的表达特征创建了有价值的材料.%The HGO gene encodes the 1,2-homogentisate dioxygenase,which catalyzes the last third step in the Tyr degradation pathway.In this study,a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana HGO gene promoter and GUS gene was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium-mediated transformation.Results from histochemical GUS assay suggested that fusion expression vector of HGO gene promoter and GUS gene was successfully constructed and it drives the expression of GUS gene successfully.Our results create valuable materials for studying the expression characteristics of HGO gene in Arabidopsis thaliana.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2017(031)003【总页数】4页(P256-259)【关键词】拟南芥;HGO;启动子;同源重组;基因克隆【作者】蔡薇;支添添;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q784酪氨酸降解途径在动物体内是必不可少的一条代谢途径［1］，尿黑酸1，2双加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）是酪氨酸降解途径中倒数第三步，可将尿黑酸氧化分解成马来酰乙酰乙酸，再经马来酰乙酰乙酸异构酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸，最后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解［2］。
在动物中，HGO基因是不可缺少的，HGO的缺失会导致尿黑酸血症［3］。
在植物中，除发现HGO基因突变可以促进拟南芥幼苗的生长［4］外，无其他研究成果。
本试验以模式植物拟南芥为材料，构建了HGO基因启动子与GUS的融合表达载体，将其转入拟南芥中，抗性筛选获得了稳定遗传的转基因株系，利用GUS染色检测到拟南芥HGO基因启动子成功转入植株内且能正常启动GUS基因的表达。
1.1 实验材料拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col-0和载体pCAMBIA1301由作物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题组保存，ClonExpressⅡ重组试剂盒从Vazyme公司购买。
1.2 植物的培养和生长条件将拟南芥种子用消毒液（20%bleach＋0.1% Triton100）浸泡10 min后，在超净台上用无菌水清洗4～5次，直接播种在含1%蔗糖的MS固体培养基上。
4℃黑暗处理3 d后，转入培养室生长，培养温度（22±2）℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗［5］。
待其生长7 d后，移栽到营养土（东北黑土与蛭石的体积比为1∶1）中并盖上透明塑料盖培养1～2 d，生长条件同上。
1.3 表达载体的构建1.3.1 设计引物及目的片段的扩增在TAIR网站上找到已公布的拟南芥HGO基因启动子序列，经plantcare在线分析软件分析后选取ATG前2000 bp序列，运用引物设计软件Primer Premier5设计特异性引物PstⅠ-F/NcoⅠ-R。
因所选表达载体需含有GUS报告基因，而所有含GUS报告基因的载体在35S启动子下游都只含NcoⅠ和BglⅡ这两个可选限制性酶切位点，BglⅡ酶切位点包含在GUS基因内，而NcoⅠ与目的基因中存在同源序列。
针对这一问题采用同源重组法构建载体，先将载体线性化，选取两个限制性内切酶PstⅠ和NcoⅠ对载体进行双酶切。
因此需要在引物5′端引入线性化载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′最末端分别带有和线性化载体两末端对应的完全一致的序列［6］，引物为：下划线部分为酶切位点，5′端前端为入线性化载体末端同源序列。
根据引物合成时预测的退火温度，选用67℃为PstⅠ-F/NcoⅠ-R退火温度。
用SDS法［7］提取拟南芥Col-0野生型叶片基因组DNA，以此为模板用高保真酶进行PCR扩增。
扩增后的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收并纯化。
1.3.2 拟南芥HGO基因与GUS融合载体的重组及鉴定选用PstⅠ和NcoⅠ限制性内切酶将pCAMBIA1301载体线性化（载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增）。
利用ClonExpressⅡ试剂盒进行重组反应。
体系为5 ×CEⅡBuffer 4μL，线性化载体8μL，插入片段扩增产物1μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 5μL。
将配置好的体系置于37℃反应30 min，反应完后将反应管立即置于冰上冷却5 min。
将20μL冷却反应液，加入到200μL的感受态中，轻弹管壁混匀，在冰上放置30 min。
42℃热激60～90 s，冰水浴孵育2 min。
加入900μL LB液体培养基，37℃孵育10 min充分复苏。
37℃150 rmp摇菌45 min。
6000 g离心2 min，去部分上清液，将其充分混匀，取100μL混匀后的菌液涂布在含有50 mg/L kan的LB培养基上。
37℃倒置过夜培养［8～11］。
取阳性克隆送华大基因公司测序。
采用电击法将测序验证正确的重组载体质粒转化到根癌农杆菌GV3101中，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定。
1.3.3 拟南芥的遗传转化及筛选挑选菌落PCR验证正确的农杆菌单菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）、庆大霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的YEB液体培养基里进行活化处理，28℃、220 rpm振荡培养18～24 h。
6000 g离心大量活化菌液2 min，弃上清，用农杆菌悬浮液（5%蔗糖＋1/2 MS＋0.02%Silwet-L77＋0.01%6-BA）将菌体重悬至OD600在0.6～1.0之间。
利用浸花法［12］转化拟南芥，收取T0代种子，在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培养基上筛选成功转入pHGO：：GUS表达载体的转基因植株，进一步采用PCR进行植株鉴定，用GUS组织化学法检测启动子活性。
2.1 拟南芥HGO基因启动子的克隆根据已知的序列信息，设计带特异酶切位点的引物，扩增引物分别含PstⅠ和NcoI的酶切位点，以拟南芥Col-0野生型基因组DNA为模板，采用高保真酶进行PCR扩增，PCR产物预期大小为2002 bp。
将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明扩增产物符合预期大小（图1）。
这表明PstⅠ-F和NcoⅠ-R能成功扩增出目的片段。
2.2 pHGO∶∶GUS融合表达载体的构建将PCR产物和线性化载体用ClonExpressⅡ试剂盒重组，构建重组后产物采用热激法转入大肠杆菌E.coli DH5α，随机挑选单菌落进行PCR检测（图2）。
菌落PCR扩增产物大小在2000 bp左右，与预期结果一致。
2号泳道加入的模板为水，此泳道没有出现条带，说明PCR体系没有DNA污染；3～6号泳道条带大小均在2000 bp左右，与预期大小相似。
选取条带最亮的6号大肠杆菌扩大培养后提取质粒送至上海博尚生物技术有限公司进行测序鉴定。
测序结果显示：6号菌种插入片段大小为2002 bp，经过DNAMAN软件序列比对分析，发现目的基因与GUS 之间的结合位点与预期一致，且没有移码乱码现象，这表明pHGO∶∶GUS融合表达载体（图3）成功构建。
2.3 pHGO∶∶GUS融合表达载体的遗传转化及鉴定将pHGO∶∶GUS重组表达载体通过电击法转入根癌农杆菌GV3101中，并通过农杆菌介导的浸花法转化模式植物拟南芥，进行融合基因的稳定表达实验。
融合表达载体具有潮霉素抗性，将浸染后当代成熟的种子铺种在MS培养基上春化后在长日照下生长，具有潮霉素抗性的植株正常生长。
将抗性苗移栽至人工土壤中，简易SDS法提取潮霉素抗性植株基因组DNA，以引物对pC1301-F/pC1301-R进行特异性扩增，引物为：结果表明，大部分潮霉素抗性植株能产生特异扩增带（图4），说明融合表达载体已成功整合到拟南芥基因组中。
2.4 转基因植株GUS检测为了检测转基因植株中的HGO启动子是否具有活性，随机挑选具潮霉素抗性和PCR阳性的T2代转基因拟南芥进行报告基因的检测。
将检测植株的种子铺种在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培养基上，置于长日照（16 h光照/8 h黑暗）下培养7～9 d，取无菌苗进行GUS组织化学法检测，通过实体显微镜观察染色结果。
结果表明：转入pCAMBIA1301质粒（含35S启动子）的阳性对照（图5A）幼苗中，GUS基因在根、下胚轴、叶中都高度表达；转入拟南芥HGO基因启动子与GUS融合表达载体的转基因植株幼苗（图5B），GUS基因在根、下胚轴及子叶中表达较强，在真叶中的表达较弱；而GUS基因未在阴性对照幼苗中表达（图5C）。
在构建表达载体时，需要精心选择酶切位点及标记基因。
当目的基因中含有较多的常用酶切位点时，不得不选择酶切效率低、价格昂贵的非常用限制性内切酶或构建中间载体，这样会大幅度降低实验成功率。
本研究中因目的基因内含较多常用酶切位点，所以选用了Vazyme公司ClonExpressⅡ重组试剂盒，此试剂盒采用同源重组的原理，不受酶切位点的限制，降低了载体的局限性。
本研究成功构建了拟南芥HGO基因启动子与GUS载体的融合表达载体，经过电泳及测序检测，证实目的片段与pCAMBIA1301在预测位点重组且插入片段无错配现象，大小正确。
【实验】β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS) 组织化学染色检测转基因植物
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、 0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
一样，其检测结果不是定量的。
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用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的 特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花 和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和 马铃薯这些植物的茎和叶在染色前必须切成薄片。 有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有 所帮助。
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实验材料和试剂
实验材料：转GUS基因的烟草叶片 试剂：
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物
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实验目的
学习转GUS基因的植物组织化学染 色方法，掌握染色的原理。
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实验原理
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用 的一个报告基因。GUS基因是从大肠杆菌中分离出来的，在 GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融 合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检 测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用Xgluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进 行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割 葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧 基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。
3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μl的N，N-二甲基甲酰胺 （DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。
拟南芥实验报告
一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。
在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。
RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。
本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。
五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。
拟南芥浸花法转化流程
拟南芥浸花法转化流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行拟南芥浸花法转化之前，需要做好充分的准备。
GUS 组织化学染色-拟南芥
幼苗GUS染色实验GUS洗液配方：0.1 M PBS, pH 7.010mM EDTA2mM 亚铁氰化钾potassium ferrocyanide2mM 六氰合铁酸钾potassium ferricyanide300mL中加0.254 g亚铁氰化钾，0.198 g六氰合铁酸钾，EDTA 6 mL（10 mM）GUS染色液(1mM)就是把5 mg X-Glus（5 mg加100µL DMSO助溶，X-Glus用前离心3min）加到5 mL洗液里即成染色液。
一次配5 mL染色液，1.5 mL离心管每管分装200 µL，锡纸包住-20℃保存。
步骤：一般5d幼苗可进行试验，早上做以方便白天随时观察幼苗着色情况。
1.90%丙酮固定20min；(丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好，因此可用于GUS染色前的固定，可防止GUS信号的扩散。
缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。
一般4℃下20分钟为宜)2. 加1 mL GUS洗液洗去丙酮，洗2遍；3. 加GUS染色液，冰上抽真空15-20 min；4. 37℃放置，隔一阵观察一下，染上色了就进行下面步骤；5. 吸出染色液，加入1 mL 70%乙醇，停止染色反应及脱色；6. 更换几次乙醇直到脱色完全；7. 解剖镜及显微镜拍照观察载玻片上加适量HCG透明液，用镊子取出幼苗在透明液中铺平，盖上盖玻片，解剖镜观察整株，显微镜观察细节并拍照。
实验原理：GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，相当稳定而不易降解。
根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）。
其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。
拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定
拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定作者：董万春樊婷婷阳立波等来源：《安徽农业科学》2015年第13期摘要 [目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因，构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株。
[方法]提取拟南芥mRNA，反转录成cDNA，并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长，通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接，将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上；然后转化至Trans1T1感受态细胞中，菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认。
将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株，通过浸花法侵染拟南芥野生型植株，通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株。
[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体；通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株。
[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础。
关键词拟南芥；CDR6基因；过量表达载体；转基因植株中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-063-02Abstract [Objective] To build up the carrier of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and isolate corresponding transgenic lines. [Method] Total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings and reverse transcribed as PCR template. CDS fragments of CDR6 gene were amplified through RT PCR. Using the restriction endonuclease and T4 DNA ligase， CDS fragments were subsequently cloned into pXB094 vector， and then were transformed into TransT1 phage resistant competent cells. Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed to confirm that CDS of the Arabidopsis CDR6 gene was successfully cloned. The recombinant plasmids were transformed into Agrobacterium GV3101 cells. Wild type plants were transformed using floraldip method and screened to obtain the desired transgenic plants. [Result] Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed and recombinant plasmids were confirmed. Stably transgenic lines of CDR6 overexpression were obtained through antibiotic screening， and verified through genetic methods. [Conclusion] Construction of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and screening of transgenic plants laid the foundation for functional analysis of CDR6.Key words Arabidopsis thaliana； CDR6； Overexpression carrier； Transgenic plant拟南芥CDR6基因cDNA全长1 120 bp，编码一种含有NC结构域的功能未知蛋白[1-3]，目前对其生物学功能研究尚未见报道。
拟南芥锌指蛋白AtZFN1基因的克隆及遗传转化
Kyewords: dopsis thaliana;Zinc finger protein; Overexpression; RNAi; Promoter
Directed by： Prof. JIN Hong Prof. YANG QingChuan
Applicant for Master degree：ZHOU Guanghui ( master of Botany)
3.4.2 质粒提取及 PCR ................................................ 34 3.4.3 PCR 产物的目的片段回收........................................ 34 3.4.4 回收产物的连接和转化 ......................................... 34 3.4.5 单克隆的挑取及筛选 ........................................... 34 3.4.6 ihpRNA 表达载体的构建......................................... 34 3.4.7 制备农杆菌感受态 ............................................. 34 3.4.8 农杆菌转化及其鉴定 ........................................... 34 3.4.9 花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥 ................................. 35 3.5 结果与分析 ..................................................... 35 3.5.1 拟南芥 AtZFN1 基因的超表达载体构建和转化 ...................... 35 3.5.2 构建拟南芥 AtZFN1 基因启动子的表达载体并转化 .................. 36 3.5.3 拟南芥 AtZFN1 基因 RNAi 表达载体构建及转化 ..................... 37 3.6 讨论 ........................................................... 40 3.7 小结 ........................................................... 40 4 再生植株的转基因检测 ............................................... 40 4.1 材料 ........................................................... 40 4.1.1 植物材料 ..................................................... 40 4.1.2 生化试剂 ..................................................... 40 4.1.3 溶液的配制 ................................................... 41 4.2 方法 ........................................................... 41 4.2.1 基因组 DNA 提取 ............................................... 41 4.2.2 总 RNA 提取及反转录 ........................................... 41 4.2.3 转基因拟南芥 PCR 检测 ......................................... 41 4.2.4 RT-PCR 检测获取的转基因植株................................... 41 4.2.5 转基因拟南芥 GUS 检测 ......................................... 41 4.3 结果与分析 ..................................................... 42 4.3.1 PCR 检测拟南芥的抗性苗........................................ 42 4.3.2 拟南芥抗性植株 RT-PCR 检测 .................................... 43 4.3.3 GUS 组织化学染色检测 .......................................... 44 4.4 讨论 ........................................................... 44 4.5 小结 ........................................................... 45 5 AtZFN1 基因的表达分析 ............................................... 45 5.1 材料 ........................................................... 45 5.2 方法 ........................................................... 45 5.2.1 引物设计 ..................................................... 45
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，广泛用于研究植物的生长发育和胁迫响应机制。
拟南芥rd29A启动子是一个重要的胁迫响应启动子，在胁迫条件下可以激活rd29A基因的转录，进而产生rd29A蛋白来应对植物的胁迫。
为了研究rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况，我们进行了GUS活性分析。
GUS活性分析是通过测量GUS基因编码的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性来反映启动子的转录水平。
本文将详细介绍我们的实验设计和结果分析。
我们构建了一个含有rd29A启动子和GUS基因的表达载体。
然后，将该载体转化到拟南芥中，得到转基因植株。
接下来，我们将转基因植株经过不同的胁迫处理，包括高盐、干旱、低温和激素处理。
在高盐胁迫下，我们观察到rd29A启动子的GUS活性显著增加。
这表明rd29A启动子在高盐条件下能够被激活，从而产生更多的rd29A蛋白来应对盐胁迫。
我们进行了激素处理实验，包括ABA（脱落酸）和SA（水杨酸）。
结果显示，rd29A 启动子在ABA和SA处理下的GUS活性均显著增加，说明rd29A在激素信号通路中的调控作用。
我们通过GUS活性分析研究了拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况。
实验结果表明，rd29A启动子在高盐、干旱、低温和激素处理下均能被激活，从而进一步证实了该启动子在植物胁迫响应中的重要性。
这为进一步探究rd29A启动子的调控机制和应对胁迫的分子机制提供了重要线索。
AtCS25基因过表达载体的构建和拟南芥的遗传转化
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ａｔ Ｓ ５ｉ ｎ ｔ ｎ ｕ ｋ ｏ ｅ ｅ ｉ ｒ ｂ ｄ ｐ ｉ ｔ ａ ｉ ｎ ｓ ｒ ｃ ： Ｃ ２ ｓａ ｆ ｃ ｉ ｎ ｎ ｗｎ ｇ ｎ ｎＡ ａ ｉ ｏ ｓｓ ｈ ｌ ａ．Ａｃ ｏ ｄ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ ｅ ｕ ｔ ｆｂｏ ｎｏ ｍａ ｉｓ ｕ ｏ ａ ｃ ｒ ｉ ｇ ｔ ｔ ｎ ｌ ｓｓｒ ｓ ｌ ｏ ｉｉ ｆｒ ｔ ， ｏｈ ｃ
越 多 的基 因 的功能 被 人 们 所 了解 ， 是 仍 然 有 大 量 但 的功能 未 知 的基 因等待 人们 去探 究 。随着 生物 信 息
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
学、 反向遗传学和现代分子生物学技术 的不断进步 ， 这些 功 能未 知基 因 的 定 位 ， 以及 对 于 它们 的表 达 与 调控 的研 究 ， 引起 了人们极 大 的兴 趣 。
ｔ ｓ ｇ ｎ ａ ｓ ｏ ｉｔ ｔ ｌｅ ｇ ｒ ｉａ ｉｎ ａ ｄ ｕｂ ｒ ｗｔ ． Ｉ ｒ ｒ ｔ ｃ ｖ ｒ ｔ ｅ ｆ ｎｃｉｎ ｏ ｈｓ ｇｅ ｅ， ｔｅ ｆ ｌ ｈｉ ｅ ｅ ｍ ｙ ａ ｓ ｃ ａｅ ｗｉｈ ｐｏｌｎ ｅ ｍ ｎ ｔｏ ｎ ｔ ｅ ｇ ｏ ｈ ｎ ｏ ｄｅ ｏ ｕｎ ｏ ｅ ｈ ｕ ｔｏ ｆｔ ｉ ｎ ｈ ｕｌ
ｌ ｎ ｔ ＤＳ ｏ Ｃ ２ ａ ｃ ｏ ｅ ｉｔ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｂ ｎ ｒ ｖ ｃｏ Ｂ １ １ ｎ ｓ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｎ ｏ ｅ ｇｈ Ｃ ｆＡＴ ５ ５ ｗ ｓ ｌｎ ｄ ｎ ｏ ｖ ｒｘ ｒ ｓ ｉｎ ｉ ａ ｙ ｅ ｔ ｒ ｐ Ｉ ２ ａ ｄ ｗａ ｔ ｓｏｍｅ ｉｔ ｗｉ — ｔｐ ａ ｌ ｄ ｙｅ
拟南芥rbs1基因rnai载体构建及遗传转化子的筛选
㊀收稿日期:２０１９－０９－１０基金项目:河南省自然科学基金项目(１６２３００４１０００８)作者简介:孟飒飒(１９８９－)ꎬ女ꎬ河南开封人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:植物逆境生理学.㊀∗通讯作者:刘凌云(１９７３－)ꎬ副教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉｎｇｙｕｎｌ＠ｈｅｎｕ.ｅｄｕ.ｃｎ.㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀㊀自然科学版第４７卷㊀第１期㊀２０２０年ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＡＯＮＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎＶｏｌ.４７㊀Ｎｏ.１㊀２０２０拟南芥ＲＢＳ１基因ＲＮＡｉ载体构建及遗传转化子的筛选孟飒飒ꎬ王胜楠ꎬ刘凌云∗(河南大学生命科学学院植物逆境生物学重点实验室ꎬ河南开封４７５００４)摘㊀要:植物通过多个基因协同作用响应活性氧的氧化胁迫.鸟苷酸解离抑制因子ＲＢＳ１作为小Ｇ蛋白活性调节分子ꎬ参与了活性氧响应的生理过程ꎬ但其详细机制尚不清楚.利用ＲＮＡｉ技术ꎬ分别构建了以ＲＢＳ１基因的特异区和保守区为靶序列的ＲＮＡｉ双元载体ꎬ并进行了拟南芥的遗传转化ꎬ通过除草剂抗性筛选分别获得１２５株及９０株遗传转化株系ꎬ为运用反向遗传学的方法深入研究ＲＢＳ１基因的生物学功能提供基础.关键词:活性氧ꎻＲＮＡｉꎻＲＢＳ１中图分类号:Ｑ７８２㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１０００￣５８４６(２０２０)０１￣００２０￣０６ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＲＢＳ１ＧｅｎｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＭＥＮＧＳａ￣ｓａꎬＷＡＮＧＳｈｅｎｇ￣ｎａｎꎬＬＩＵＬｉｎｇ￣ｙｕｎ∗(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅꎬＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＳｔｒｅｓｓＢｉｏｌｏｇｙꎬＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫａｉｆｅｎｇ４７５００４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｐｌａｎｔｓｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｒｅｑｕｉｒｅｔｈｅｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍａｎｙｇｅｎｅｓ.ＡｓａｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｓｍａｌｌＧｐｒｏｔｅｉｎꎬＧｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒＲＢＳ１ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ(ＲＯＳ)ｓｔｒｅｓｓｉｎｐｌａｎｔｓ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｍａｉｎｅｄｕｎｃｌｅａｒ.ＴｈｅＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＲＢＳ１ｇｅｎｅｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.１２５ａｎｄ９０ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＢａｓｔａｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ.ＴｈｅｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗｉｌｌｂｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲＢＳ１ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｂｙｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｍｅｔｈｏｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓꎻＲＮＡｉꎻＲＢＳ１０㊀引言高等植物中ꎬ活性氧(ＲＯＳ)作为重要的信号分子参与调节多种生物和非生物胁迫引起的防御性㊀㊀反应ꎬ包括干旱㊁高温㊁高盐㊁高光㊁重金属毒害及病菌入侵等[１].由这些胁迫诱导产生的活性氧包括超氧阴离子Ｏ－２ꎬ羟基自由基ＨＯ－㊁过氧化氢Ｈ２Ｏ２及单线态氧Ｏ∗２等[２].产生的活性氧通过脂质和蛋白质氧化及核酸的降解造成细胞损伤.但植物细胞是怎样感知活性氧?特定的活性氧受体还没有得到鉴定.与传统方法如反义核酸(ａｎｔｉｓｅｎｓｅＤＮＡ/ＲＮＡ)相比ꎬＲＮＡｉ技术在特异地沉默目的基因的表达上ꎬ更为高效和可靠.在最近发展的生物技术中ꎬＲＮＡｉ技术在植物辅助育种中作为遗传材料创建的精确而有力的工具被广泛使用[３].科学家们已经将ＲＮＡｉ技术应用于植物营养品质及特定性状的改良ꎬ包括高产㊁抗病㊁抗虫及花形㊁花色等方面的研究[４ꎬ５].孟加拉红(ＲｏｓｅＢｅｎｇａｌꎬＲＢ)能够与蛋白质结合产生单线态氧Ｏ∗２[６ꎬ７]ꎬ本研究在前期研究基础上筛选到一株ＲＢ敏感突变体ꎬ命名为ｒｂｓ１.ＲＢＳ１编码一个鸟苷酸解离抑制因子ꎬ为更好地研究ＲＢＳ１基因功能ꎬ本文拟通过ＲＮＡｉ技术ꎬ利用双元载体ｐＦＧＣ５９４１形成目的基因片段的反向重复结构ꎬ通过农杆菌介导的拟南芥转化ꎬ产生拟南芥ＲＢＳ１基因沉默突变体ꎬ从而为研究ＲＢＳ１基因功能及相关信号转导途径提供遗传材料.１㊀材料和方法１.１㊀实验材料拟南芥(ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＬ.)野生型(Ｃｏｌ－０生态型).菌株及质粒载体:Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αꎬ农杆菌菌株ＧＶ３１０１ꎬ双元质粒载体ｐＦＧＣ５９４１由美国Ａｒｉｚｏｎａ大学ＴｈｅＰｌａｎｔＣｈｒｏｍａｔｉｎＤａｔａｂａｓｅ构建并提供.主要试剂:利福平㊁卡那霉素㊁除草剂Ｂａｓｔａ购自Ｓｉｇｍａ公司ꎬ限制性内切酶ＸｍａＩ㊁ＸｂａＩ㊁ＸｈｏＩ㊁ＮｃｏＩ购自ＮＥＢ公司ꎬＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒㊁ＤＮＡ连接试剂盒购自ＴＡＫＡＲＡ公司ꎬＫＯＤ高保真酶购自ＴＯＹＯＢＯ公司ꎬ其他生化试剂盒药品使用国产分析纯或进口分装.实验所用引物由北京金维智公司合成.１.２㊀试验方法１.２.１㊀拟南芥的种植取适量干燥饱满的拟南芥种子ꎬ加入０.１％升汞ꎬ表面消毒５ｍｉｎꎬ用无菌水反复洗涤５~６次ꎬ将种子点播于０.６％ＭＳ培养基中ꎬ４ħ处理２~３ｄꎬ将种子置于培养间培养(光/暗周期为８/１６ｈꎬ温度１８~２２ħꎬ光照强度１２０μｍｏｌ/(ｍ２ ｓ)ꎬ相对湿度８０％)ꎬ生长约２周后ꎬ移植至土中(营养土ʒ蛭石＝１ʒ１)进行培养ꎬ１０~１２周即可收获种子.１.２.２㊀拟南芥总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成拟南芥幼苗总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成参考文献[８]的方法进行.１.２.３㊀ＰＣＲ产物的检测和载体的构建按照标准的分子生物学方法[９]进行ꎬ以野生型拟南芥ｃＤＮＡ为模板ꎬ分别利用引物ＳＦ:５ᶄ￣ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＣＡ￣３ᶄ(方框和划线部分分别为限制性内切酶ＸｈｏＩ㊁ＸｍａＩ的识别位点)ꎬＳＲ:５ᶄ￣ＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴ￣３ᶄ(方框和划线部分分别为限制性内切酶ＮｃｏＩ㊁ＸｂａＩ的识别位点)及引物ＣＦ:５ᶄ￣ＣＣＣＣＴＣＧＡＧ１２㊀第１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀孟飒飒ꎬ等:拟南芥ＲＢＳ１基因ＲＮＡｉ载体构建及遗传转化子的筛选㊀㊀ＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡ￣３ᶄ(方框和划线部分表示同上)和ＣＲ:５ᶄ￣ＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡ￣３ᶄ(方框和划线部分表示同上)通过ＰＣＲ克隆ＡｔＲＢＳ１基因编码特异序列(３６７ｂｐ)及保守序列(４１１ｂｐ).其中特异序列片段ＰＣＲ产物经凝胶回收后ꎬ用ＸｍａＩ和ＸｂａＩ双酶切ꎬ酶切产物纯化后与ＸｍａＩ和ＸｂａＩ双酶切的载体ｐＦＧＣ５９４１连接ꎬ连接产物转化Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞ꎬ通过菌落ＰＣＲ挑选阳性克隆ꎬ测序验证所获得的载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１ꎬ此重组载体中ＲＢＳ１的特异片段Ｓ反向连入载体中ꎻ再用上述ＳＦ及ＳＲ引物重新扩增特异片段Ｓꎬ此次经凝胶回收后的Ｓ片段用ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ双酶切ꎬ酶切产物纯化后与ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ双酶切的重组载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１连接ꎬ连接产物转化Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞ꎬ通过ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ双酶切获取阳性克隆ꎬ测序验证所获得的重组载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓꎬ此重组载体中ＲＢＳ１基因的特异片段Ｓ分别以正向和反向重复连入ｐＦＧＣ５９４１载体中.以同样方法构建ＲＢＳ１基因的保守片段Ｃ分别以正向和反向重复连入重组载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｃ.１.２.４㊀农杆菌介导的拟南芥遗传转化及转基因苗的筛选采用热激法将重组质粒ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ及ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｃ分别导入农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎬ涂板筛选ꎬ挑选单菌落摇菌ꎬ用菌液ＰＣＲ检测目的基因的存在.拟南芥农杆菌转化采用花序侵染法[１０].将农杆菌侵染后收获的种子通过Ｂａｓｔａ除草剂抗性筛选获取转基因阳性苗.２㊀结果与分析２.１㊀ＲＢＳ１蛋白质氨基酸序列保守性分析为了构建ＲＢＳ１基因的敲除突变体ꎬ首先利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件对ＲＢＳ１蛋白的氨基酸序列保守性进行分析.发现ＲＢＳ１蛋白具有非常保守的基序ＧＥＸＸＱＧＦＸＲＸＸＡＸＸＧ(图１)ꎬ同时ＲＢＳ１与同家族ＲＢＳ２及ＲＢＳ３蛋白的同源性比较近ꎬ分别达到７６.８５％和７７.７５％ꎬ而和ＲＢＳ４的同源关系比较远ꎬ同源性仅为１９.１８％.根据生物信息学分析的结果ꎬ确定ＲＢＳ１特异序列为一段从５９~２００的氨基酸的序列ꎬ所对应的基因编码序列长度为３６７ｂｐꎻ同时发现ＲＢＳ１保守序列为从２１０~３７０的氨基酸序列ꎬ且该保守序列中包含高度保守的ＧＥＸＸＱＧＦＸＲＸＸＡＸＸＧ基序ꎬ其对应的基因编码序列长度为４１１ｂｐ.分析得到的特异序列及保守序列分别作为构建ＲＢＳ１基因敲除突变体的参考序列.图１㊀ＲＢＳ１蛋白质氨基酸序列保守性分析２.２㊀ＲＢＳ１基因序列特异区ＲＮＡｉ载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ的构建为获得ＲＢＳ１基因敲除同时又不影响同家族其他基因表达的ＲＮＡｉ转基因植株ꎬ本实验首先以野生型拟南芥ｃＤＮＡ为模板ꎬ以引物ＳＦ和ＳＲ扩增ＲＢＳ１特异片段ＳꎬＰＣＲ产物用１.０％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ在接近３６７ｂｐ处有明显亮带ꎬ其大小与预期的ＲＢＳ１特异区片段一致(图２Ａ)ꎬ切胶回收.将回收的目的片段和ｐＦＧＣ５９４１空载体分别用ＸｍａＩ和ＸｂａＩ限制性内切酶双酶切ꎬ双酶切产物跑胶㊁回收ꎬＴ４ＤＮＡ连接酶１６ħ过夜连接ꎬ热激转化Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５αꎬ涂卡那抗生素平板ꎬ３７ħ过夜培２２㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２０年㊀㊀㊀㊀Ａ.ＲＢＳ１基因特异序列(Ｓ)片段的克隆ꎬ１代表克隆的Ｓ片段ꎻＢ.ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１载体的双酶切验证ꎬ泳道１代表重组载体的质粒ＰＣＲꎬ泳道２代表重组载体的双酶切ꎻＣ.ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ载体的双酶切验证ꎻＤ.构建成功ＲＮＡｉ载体转入农杆菌的鉴定ꎬ１代表菌落ＰＣＲ结果.Ｍ代表Ｍａｒｋｅｒ２０００.下同.图２㊀ＲＢＳ１基因特异序列ＲＮＡｉ载体的构建养ꎬ取边缘整齐透亮的菌落ꎬ扩菌落ＰＣＲꎬ取阳性菌落摇菌ꎬ提取重组质粒ꎬ质粒ＰＣＲꎬ双酶切验证ꎬ发现插入基因片段Ｓ与重组质粒ＰＣＲ扩增片段大小一致(图２Ｂ)ꎬ此时Ｓ片段反向连入ｐＦＧＣ５９４１载体ꎬ命名为ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１.之后再次用ＳＦ及ＳＲ引物重新扩增ＲＢＳ１特异片段Ｓꎬ将ＰＣＲ产物跑胶回收后ꎬ和以上构建的重组质粒ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１分别用ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ限制性内切酶双酶切ꎬ跑胶ꎬ切胶回收ꎬＴ４ＤＮＡ连接酶１６ħ过夜酶连ꎬ涂平板培养ꎬ挑选单菌落摇菌提质粒ꎬ质粒双酶切验证证实Ｓ片段正向Ｓ片段正向连入载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１中(图２Ｃ)ꎬ此重组载体命名为ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ(由于是第二次酶切ꎬ该重组载体本身含有目的片段ꎬ质粒ＰＣＲ检测不能说明问题ꎬ因此仅用双酶切检验).经两次双酶切及连接将ＲＢＳ１特异片段Ｓꎬ正反向重复连进载体ｐＦＧＣ５９４１.将测序正确的ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ－ＲＮＡｉ重组载体转化农杆菌ꎬ农杆菌菌落ＰＣＲ(图２Ｄ)ꎬ选阳性菌落摇菌按照１.２.２的方法转化野生型拟南芥植株.图３㊀ＲＢＳ１基因保守序列ＲＮＡｉ载体的构建２.３㊀ＲＢＳ１氨基酸序列保守区ＲＮＡｉ载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｃ的构建虽然前期生物信息学分析结果显示ＲＢＳ１与该家族其他基因同源性比较高ꎬ且保守区域可能为ＲＢＳ１的功能区ꎬ为尽可能获取ＲＢＳ１功能缺失突变体ꎬ本实验又构建了以ＲＢＳ１保守区为靶序列的ＲＮＡｉ重组载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｃ.构建具体过程与以ＲＢＳ１特异区为靶序列的ＲＮＡｉ重组载体ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ的构建过程类似(图３).同样将双酶切验证及测序均正确㊁确认ＲＢＳ１保守区序列正反向重复插入的ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｃ－ＲＮＡｉ重组载体转化农杆菌ꎬ农杆菌菌落ＰＣＲꎬ选阳性菌落摇菌按照１.２.２的方法转化野生型拟南芥植株.Ａ.ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ－ＲＮＡｉ转基因植株的筛选ꎻＢ.筛选出转基因阳性植株的特写图４㊀ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１Ｓ－ＲＮＡｉ转基因植株的筛选２.４㊀ｐＦＧＣ５９４１－ＲＢＳ１－ＲＮＡｉ转基因植株的筛选将上述农杆菌介导的ＲＮＡｉ转基因植株Ｔ１代种子收获ꎬ干燥后撒播于营养土中ꎬ春化３天后ꎬ移至培养间培养.待幼苗长出两片子叶后即用３５ｍｇ/Ｌ的Ｂａｓｔａ进行喷洒筛选ꎬ非抗性苗经Ｂａｓｔａ喷洒后叶子变黄枯死ꎬ而筛选出的转基因阳性植株依然能够正常生长(图４).经过多次筛选初步得到以ＲＢＳ１保守区为沉默靶序列的转基因植株１２５个株系ꎬ以ＲＢＳ１特异区为沉默靶序列３２㊀第１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀孟飒飒ꎬ等:拟南芥ＲＢＳ１基因ＲＮＡｉ载体构建及遗传转化子的筛选㊀㊀的转基因植株９０个株系.将阳性转基因株系移植ꎬ单株收种子繁殖ꎬ为随后的ＲＢＳ１基因功能检测打下基础.３㊀讨论基因过表达已经被用于分析基因功能ꎬ但这种方法不是对所有蛋白质都可行ꎬ而且结果难以解释.Ｔ－ＤＮＡ插入或者ＥＭＳ诱变导致的基因缺失可以阐释蛋白质的功能ꎬ但这些方法耗时㊁昂贵ꎬ而且可能导致胚胎致死表型ꎬ所以相比其他方法ꎬＲＮＡｉ技术提供了一种非常高效并且能阻止某个特异性基因表达的方法ꎬ具有更大的优势与潜力[１１ꎬ１２].ＲＮＡｉ技术在研究植物基因功能时应用广泛[１３－１６].一般在基因沉默实验中ꎬ为了能特异沉默目的基因ꎬ往往选择蛋白特异序列作为沉默的靶序列.但很多时候ꎬ蛋白保守序列也往往是蛋白的功能域结构ꎬ因此试验中仅仅沉默基因特异序列未必能达到基因沉默的目的.本实验中ꎬ在拟南芥网站中未能查到ＲＢＳ１基因的Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ꎬ生物信息学分析显示该基因主要在花药中表达[１７]ꎬ这些结果暗示ꎬ该基因与植物育性有关ꎬ并且其功能缺失突变体可能致死ꎬ因此构建ＲＮＡｉ转基因株系以获取低水平表达突变体就成为研究该基因功能的理想工具.本实验中分别成功构建了旨在敲除ＲＢＳ１特异序列和敲除ＲＢＳ１保守序列的两个ＲＮＡｉ双元载体ꎬ确保达到敲低ＲＢＳ１基因的目的.活性氧不仅调节植物生长和发育过程ꎬ而且也介导生物与非生物胁迫响应过程[１８－２０].本研究前期筛到ｒｂｓ１是活性氧敏感突变体ꎬ因此ꎬ获得ＲＮＡｉ转基因植株后的下一步工作是评估所筛选阳性ＲＮＡｉ转基因植株的沉默效率ꎬ选择基因敲除植株检测活性氧相关表型ꎬ为以后深入研究ＲＢＳ１的生物学功能和作用机制奠定基础.参考文献:[１]㊀ＰｅｒｅｚＩꎬＢｒｏｗｎＰＪ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＲＯＳｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃｒｏｓｓ￣ｔｏｌｅｒａｎｃｅ:ｆｒｏｍｍｏｄｅｌｔｏｃｒｏｐ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＰｌａｎｔＳｃｉꎬ２０１４ꎬ５(７５４):１－６.[２]㊀ＡｐｅｌＫꎬＨｉｒｔＨ.Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ:ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍꎬｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ａｎｎｕ.ＲｅｖＰｌａｎｔＢｉｏｌꎬ２００４ꎬ５５:３７３－３９９.[３]㊀ＭａｔＪａｌａｌｕｄｄｉｎＮＳꎬＯｔｈｍａｎＲＹꎬＨａｒｉｋｒｉｓｈｎａＪＡ.ＧｌｏｂａｌｔｒｅｎｄｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓａｎｄｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＲＮＡｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｆｏｒｃｒｏｐｓ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１９ꎬ３９(１):６７－７８.[４]㊀ＧｕｏＱꎬＬｉｕＱꎬＳｍｉｔｈＮＡꎬｅｔａｌ.ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ:ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓꎬｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｒｏｐｓ[Ｊ].ＣｕｒｒＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１６ꎬ１７:４７６－４８９.[５]㊀ＳａｕｒａｂｈＳꎬＶｉｄｙａｒｔｈｉＡꎬＰｒａｓａｄＤ.ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ:ｃｏｎｃｅｐｔｔｏｒｅａｌｉｔｙｉｎｃｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ[Ｊ].Ｐｌａｎｔａꎬ２０１４ꎬ２３９:５４３－５６４.[６]㊀ＰｏｓｐíšｉｌＰꎬＰｒａｓａｄＡ.ＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｉｔｓｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎＰｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩＩｕｎｄｅｒａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＪＰｈｏｔｏｃｈｅｍＰｈｏｔｏｂｉｏｌＢꎬ２０１４ꎬ１３７:３９－４８.[７]㊀ＴｕｒｂａｙＭＢꎬＲｅｙＶꎬＡｒｇａñａｒａｚＮＭꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｙｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｓｅｌｆ￣ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ４２㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２０年㊀㊀㊀㊀ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎｂｙｒｏｓｅｂｅｎｇａｌｂｏｕｎｄｔｏｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ[Ｊ].ＪＰｈｏｔｏｃｈｅｍＰｈｏｔｏｂｉｏｌＢꎬ２０１４ꎬ１４１:２７５－２８２.[８]㊀刘凌云ꎬ孟飒飒.拟南芥活性氧响应基因ＧＤＩ功能初步分析[Ｊ].河南大学学报(自然科学版)ꎬ２０１３ꎬ４３:６７２－６７６.[９]㊀ＪｏｓｅｐｈＳꎬＤａｖｉｄＷＲ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ:ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ[Ｍ].ＮｅｗＹｏｒｋ:ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓꎬ２００１.[１０]㊀ＣｌｏｕｇｈＳＪꎬＢｅｎｔＡＦ.Ｆｌｏｒａｌｄｉｐ:ＡｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ１９９８ꎬ１６:７３５－７４３.[１１]㊀ＣｏｖｅｙＳꎬＡｌ￣ＫａｆｆＮꎬＬａｎｇａｒａＡꎬｅｔａｌ.Ｐｌａｎｔｃｏｍｂａｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ１９９７ꎬ３８５(６６１９):７８１－７８２.[１２]㊀ＲａｔｃｌｉｆｆＦꎬＨａｒｒｉｓｏｎＢꎬＢａｕｌｃｏｍｂｅＤ.Ａｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｖｉｒａｌｄｅｆｅｎｓｅａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ１９９７ꎬ２７６(５３１８):１５５８－１５６０.[１３]㊀ＣｈｅｎｇＨꎬＬｉＨꎬＤｅｎｇＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＷＲＫＹ４５￣２￣ＷＲＫＹ１３￣ＷＲＫＹ４２ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＣａｓｃａｄｅＩｓＲｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＲｉｃｅＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＦｕｎｇａｌＰａｔｈｏｇｅｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ１６７(３):１０８７－１０９９.[１４]㊀ＷｅｉｂｅｒｇＡꎬＢｅｌｌｉｎｇｅｒＭꎬＪｉｎＨ.Ｃｏｎｖｅｒｓａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｋｉｎｇｄｏｍｓ:ｓｍａｌｌＲＮＡｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ３２:２０７－２１５.[１５]㊀ＷｕＪＸꎬＬｉＪꎬＬｉｕＺꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃｅｒａｍｉｄａｓｅＡｔＡＣＥＲｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ２０１５ꎬ８１(５):７６７－７８０.[１６]㊀ＹｏｕｎｉｓＡꎬＳｉｄｄｉｑｕｅＭＩꎬＫｉｍＣＫꎬｅｔａｌ.ＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ(ＲＮＡｉ)ＩｎｄｕｃｅｄＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ:ＡＰｒｏｍｉｓｉｎｇＡｐｐｒｏａｃｈｏｆＨｉ￣ＴｅｃｈＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ[Ｊ].ＩｎｔＪＢｉｏｌＳｃｉꎬ２０１４ꎬ１０(１０):１１５０－１１５８.[１７]㊀ＷｉｎｔｅｒＤꎬＶｉｎｅｇａｒＢꎬＮａｈａｌＨꎬｅｔａｌ.Ａｎ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｉｃｔｏｇｒａｐｈ ｂｒｏｗｓｅｒｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｚｉｎｇｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄａｔａｓｅｔｓ[Ｊ].ＰＬＯＳＯｎｅꎬ２００７ꎬ２(８):ｅ７１８.[１８]㊀ＬｉｕＹꎬＨｅＣ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ(ＲＯＳ)ｉｎｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓ:ｌｅａｒｎｉｎｇｆｒｏｍＡｔＲＢＯＨＤ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ３５(５):９９５－１００７.[１９]㊀ＣｈａｐｍａｎＪＭꎬＭｕｈｌｅｍａｎｎＪＫꎬＧａｙｏｍｂａＳＲꎬｅｔａｌ.ＲＢＯＨ￣ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＲＯＳＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＲＯＳＳｃａｖｅｎｇｉｎｇｂｙＰｌａｎｔＳｐｅｃｉａｌｉｚｅｄＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓＴｏＭｏｄｕｌａｔｅＰｌａｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＳｔｒｅｓｓＲｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０１９ꎬ３２(３):３７０－３９６.[２０]㊀ＷａｎｇＪꎬＺｈａｎｇＬꎬＷａｎｇＸꎬｅｔａｌ.ＰｖＮＡＣ１ｉｎｃｒｅａｓｅｓｂｉｏｍａｓｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｂｙｄｅｃｒｅａｓｉｎｇＮａ＋ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｉｎｇＲＯＳｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｉｎｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ(ＰａｎｉｃｕｍｖｉｒｇａｔｕｍＬ.)[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｃｉꎬ２０１９ꎬ２８０:６６－７６.(责任编辑㊀李㊀超)５２㊀第１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀孟飒飒ꎬ等:拟南芥ＲＢＳ１基因ＲＮＡｉ载体构建及遗传转化子的筛选。