质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒dna的鉴定实验报告
质粒dna的鉴定实验报告质粒DNA的鉴定实验报告引言：质粒DNA是一种环状的DNA分子，常见于细菌等原核生物中，并广泛应用于基因工程、遗传学研究以及生物技术领域。
本实验旨在通过一系列实验操作，对质粒DNA进行鉴定，以确保其纯度和完整性。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 质粒DNA样本- 纯化试剂盒（如酚/氯仿）- 乙醇（绝对醇）- 离心管- PCR仪2. 实验方法：1) DNA纯化：将质粒DNA样本加入纯化试剂盒中，按照盒内说明进行离心分离，以去除杂质和蛋白质。
2) 乙醇沉淀：将离心分离后的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的绝对醇，轻轻颠倒离心管，使DNA沉淀于管底。
3) 洗涤与干燥：用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，然后将离心管倒置于洁净的工作台上，待DNA沉淀干燥。
4) 溶解与保存：用适量的无菌纯水或缓冲液溶解DNA沉淀，保存于-20摄氏度。
实验结果与讨论：通过本实验，我们成功获得了质粒DNA样本，并对其进行了鉴定。
以下是我们的实验结果与相应的讨论。
1. DNA纯化效果：通过酚/氯仿法进行DNA纯化后，我们观察到离心分离后的上清液呈现明显的透明状，而底部的沉淀则呈现白色或乳白色。
这说明纯化试剂盒能够有效去除杂质和蛋白质，使得质粒DNA得以分离和纯化。
2. DNA沉淀效果：在乙醇沉淀过程中，我们观察到DNA沉淀于离心管底部，形成白色或乳白色的沉淀物。
这表明DNA能够与乙醇发生相互作用，并沉淀于管底。
3. DNA溶解效果：在用无菌纯水或缓冲液溶解DNA沉淀后，我们观察到沉淀物完全溶解，并呈现透明的溶液。
这说明DNA能够充分溶解于溶剂中，并保持其完整性。
4. DNA保存效果：将溶解后的DNA样本保存于-20摄氏度，可以有效地保护DNA的完整性和稳定性。
这是因为低温能够减缓DNA降解的速度，延长其保存时间。
结论：通过本实验，我们成功地鉴定了质粒DNA样本，并确认其纯度和完整性。
实验结果表明，我们的实验操作能够有效地纯化、沉淀、溶解和保存质粒DNA。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
质粒DNA的提取定量PCR鉴定
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定量PCR：使用定量PCR仪进行定量PCR反应，获取质粒DN的拷贝数
提取质粒DN：使用碱裂解法或柱层析法等方法提取质粒DN
数据分析：使用定量PCR软件分析定量PCR结果，获取质粒DN的拷贝数
结果验证：使用电泳法或荧光定量PCR等方法验证定量结果
定量注意事项
确保样品的纯度和完整性
PCR反应需要四种主要成分：模板DN、引物、DN聚合酶和dNTP
PCR反应可以快速复制特定的DN片段，用于基因克隆、突变检测、基因表达分析等领域
PCR反应体系
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模板DN：提供待扩增的DN序列
DN聚合酶：催化DN复制
Mg2+：稳定DN聚合酶活性
酶抑制剂：防止非特异性扩增
电泳试剂：用于电泳分析的试剂，如溴化乙锭、琼脂糖等
荧光定量PCR仪：用于定量PCR分析的仪器
实验步骤和实验操作
质粒DN提取：选择合适的菌株，培养至对数生长期，然后进行质粒DN的提取。
PCR鉴定：设计特异性引物，进行PCR反应，然后进行电泳分析。
实验操作：按照实验步骤进行实验操作，注意操作规范和实验安全。
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因功能研究
PCR鉴定：用于基因突变、基因表达和基因功能研究
质粒DN提取和PCR鉴定：用于药物开发和生物制药
在基因工程中的应用
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因编辑等实验
PCR鉴定：用于检测基因突变、基因表达和基因拷贝数等实验
基因工程：通过改变生物的基因来改变其性状，如抗病、抗虫、抗除草剂等
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒dna的制备实验报告
质粒dna的制备实验报告质粒DNA的制备实验报告引言：DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的重要分子。
质粒DNA是一种环状的双链DNA分子，广泛存在于细菌和其他一些原核生物中。
质粒DNA具有自主复制的能力，并携带了一些对细菌有益的基因信息。
因此，质粒DNA的制备对于基因工程研究和生物技术应用具有重要意义。
实验目的：本实验旨在通过离心、溶解、酶切及纯化等步骤，制备出高纯度的质粒DNA样品。
实验材料与方法：1. 细菌培养液：含有目标质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心沉淀细菌。
3. 离心机：用于离心沉淀细菌和质粒DNA。
4. 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解所需的缓冲盐和酶切酶。
5. 酶切酶：用于切割质粒DNA。
6. 蛋白酶K：用于降解细胞中的蛋白质。
7. 酚/氯仿：用于提取DNA。
8. 异丙醇：用于沉淀DNA。
9. 纯化缓冲液：用于纯化DNA样品。
实验步骤：1. 收获细菌：将培养液离心10分钟，将菌体沉淀收集至离心管中。
2. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使菌体充分裂解，并加入蛋白酶K降解蛋白质。
3. DNA提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇动离心管使两相混合，离心分离上下两相。
4. DNA沉淀：将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇动离心管使DNA沉淀。
5. DNA纯化：将DNA沉淀洗涤至纯化缓冲液中，离心沉淀DNA，去除上清液。
6. 测定DNA浓度：使用比色法或荧光法等方法测定DNA的浓度。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功制备出了高纯度的质粒DNA样品。
通过测定DNA浓度，我们可以得到质粒DNA的含量。
实验中使用的细菌培养物中含有目标质粒DNA，经过细胞裂解和酶切等步骤，我们成功地将质粒DNA从其他细胞组分中分离出来。
酚/氯仿提取和异丙醇沉淀的操作使得DNA得以纯化和浓缩。
最后，使用纯化缓冲液洗涤和离心沉淀，去除上清液，进一步提高了DNA的纯度。
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告引言DNA的提取是生物学实验中非常重要的一步，它可以用于后续的分子生物学研究，比如克隆、PCR、基因测序等。
而本次实验的目的是从细菌中提取质粒DNA，并对提取的结果进行分析，评估提取效果。
材料与方法1. 实验材料- 大肠杆菌菌液- 细胞裂解液- RNase A- 莱文斯坦缓冲液- 高盐裂解液- 乙酰盐- 氯仿- 异丙醇- TE液- 离心管等实验仪器和耗材。
2. 实验步骤- 调制莱文斯坦缓冲液，用于细胞裂解和质粒DNA的稳定。
- 预处理大肠杆菌菌液，用高盐裂解液处理使其细胞壁破裂，释放出质粒DNA。
- 添加异丙醇与氯仿，用于分离DNA和其他细胞组分。
- 加入乙酸盐处理DNA上的蛋白质，使其沉淀。
- 用异丙醇洗涤DNA沉淀，去除杂质。
- 用TE液溶解提取得到的DNA。
结果与讨论经实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA。
通过紫外光照射，我们观察到了明亮的DNA带，证明提取得到的DNA具有较高的纯度。
另外，我们还使用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行了分析。
从琼脂糖凝胶电泳的结果中，我们观察到细长而连续的DNA 条带，说明提取得到的质粒DNA具有较好的完整性。
此外，我们还注意到，在琼脂糖凝胶中，质粒DNA的迁移速率要快于细菌染色体DNA，这是因为质粒DNA的分子量较小。
在实验的过程中，我们注意到了一些实验技巧和注意事项。
首先，在进行细胞裂解和DNA提取过程中，必须保持材料的无菌状态，以免外源性DNA的污染。
其次，避免在提取过程中显著提高DNA样本的温度，以防止DNA的降解。
最后，注意避免DNA溶液与金属物质接触，因为金属离子可能对DNA具有毒性。
结论通过本次实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了高质量的质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上观察到清晰的DNA带。
实验过程中，我们掌握了DNA提取的基本操作技巧和注意事项，这对我们今后的分子生物学研究将产生积极的影响。
然而，本次实验还有一些改进的空间。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
质粒dna的鉴定实验报告
质粒dna的鉴定实验报告质粒鉴定实验报告d na 质粒dna酶切实验报告质粒dna提取实验报告篇一：质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（Solution Ⅰ）：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDT A）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。
③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。
TBE比TAE有相对高的缓冲能力。
（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。
（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。
②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。
③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。
④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。
（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。
pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。
而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。
这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。
可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。
但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。
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质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 (多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒DNA的定量分析： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰 /A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度； A260/A280= DNA纯净 A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。 4.质粒DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工 具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、材料与方法： 实验材料： 仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒DNA的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管 材料：溶液 P1、溶液P2 (S2）、溶液P3、去蛋白液PE漂洗液WB、洗脱液EB 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4. 质粒DNA的酶切鉴定 仪器：的EP管、微量加样枪 材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 实验方法 准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液 2. 质粒DNA的提取与制备 将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中 将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作： ①94℃预变性5分钟后开始以下循环 ②循环为94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃ ——1 分钟。循环为30次 ③72℃ 5 分钟 ④4 ℃ 保温 将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心 取 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水μl、2*Premix μl、引物1 (10 mol/L) 1μl、引物2 (10 mol/L) 1μl、菌液5μl 13000rpm x 1min，弃上清 取培养物加入Eppendorf管中 加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬 浮 加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀，直到溶液变得清亮 加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液 向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液；重复一遍 加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液 3. 质粒DNA的定量 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用 空柱13000rpm离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发 再向比色皿加入2ul的质粒DNA，于紫外分光空白对照比色测定 向比色皿加入98ul蒸馏水，进行Blank调零 清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馏水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净 光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据 质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方 法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 (多聚酶链式反应) 在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶 液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒DNA的定量分析： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰 /A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度； A260/A280= DNA纯净 A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。 4.质粒DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 三、材料与方法： 实验材料： 仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒DNA的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管 材料：溶液 P1、溶液P2 (S2）、溶液P3、去蛋白液PE漂洗液WB、洗脱液EB 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.质粒DNA的酶切鉴定 仪器：的EP管、微量加样枪 材料：无菌水、10×M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 实验方法