从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
α-淀粉酶的生产工艺设计
α-淀粉酶的生产工艺设计α-淀粉酶的发酵生产工艺摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1.菌种的选育1. 1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
1．2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
1.3 诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量(μg/ml)，在一定pH值的缓冲液中30℃恒温振荡处理1~4 h。
③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成小菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30℃培养36 h。
⑥用2#定性滤纸制成5 mm disc(小圆纸片)，并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素(抑菌)。
倒入200 mm×300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。
然后把5 mm disc 纸顺序放在培养基表面。
⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc 培养皿经37℃，24h分别培养。
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选实验项目性质：设计性涉及的知识点：无菌技术、浓缩培养、纯种子分离、淀粉酶特性和酶活性测定。
计划学时：8学时一、实验目的1.掌握从环境中采集样本并从中分离纯化某些微生物的完整操作步骤。
2.巩固之前所学的微生物学实验技术。
3.掌握产酶微生物的筛选方法。
二、实验原理α-淀粉酶是一种液化淀粉酶。
其产生菌芽孢杆菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉的土壤样品中。
从自然界筛选菌株的具体方法大致可分为以下四个步骤：取样、增殖培养、纯种子分离和性能测定。
1、采样：即采集含菌的样品在收集含有细菌的样本之前，你应该调查和研究你打算筛选的微生物分布在哪里，然后你可以开始做各种具体的工作。
几乎所有种类的微生物都可以在土壤中找到，因此土壤可以说是微生物的基础。
在土壤中，细菌数量最多，其次是放线菌、第三种霉菌和酵母。
除土壤外，各种物体上都有相应的优势微生物。
例如，枯枝、腐叶、腐土和腐木中的纤维素分解细菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中的淀粉分解细菌较多，水果和蜜饯表面的酵母较多；植物奶中含有较多的乳酸菌，油田和炼油厂附近的土壤中含有较多的石油分解菌。
2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养是在采集的土壤和其他含有细菌的样本中添加一些物质，并创造一些其他有利于待分离微生物生长的条件，以便能够分解和利用这些物质的微生物能够大量繁殖，以便我们从中分离出这些微生物。
因此，增殖培养实际上是选择性培养基的实际应用。
3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。
通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
4.业绩衡量分离得到纯种这只是选种工作的第一步。
所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定王磊;陈宇飞;杨柳【摘要】从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定.结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4U/mL~10.4 U/mL之间.经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌.%The amylase-producing strains were isolated from soil. After initially screening by starch culture medium, the DNS method was used to determine the total enzyme activity andα-amylase activity of the crude enzyme solution by fermentation extraction. The screened strains were identified through morphological observa-tion and physiological and biochemical reactions. Results showed that:four strains of amylase-producing Bacil-lus were isolated. The ratio of hydrolysis zone diameter to colony diameter was 1.7-3.5. Two strains of them had high amylase-producing activity, which the total enzyme activity reached 19.760 U/mL and 15.432 U/mL. Theα-amylase activity of four strains of Bacillus was 6.4 U/mL~10.4 U/mL. The four strains of Bacillus were authen-ticated that one was Bacillus subtilis, the other three were Bacillus cereus. The ability to produce amylase of Bacillus subtilis was superior to Bacillus cereus.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】4页(P175-178)【关键词】芽孢杆菌;淀粉酶;分离;鉴定【作者】王磊;陈宇飞;杨柳【作者单位】吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507【正文语种】中文淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，是最早实现工业化生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
医学产淀粉酶芽孢杆菌的筛选专题课件
※菌种保藏
• 5、菌种保藏 • 将初步鉴定好的菌种接种在sday斜面培养
基上，在37℃的恒温培养箱中培养，待其 长满菌丝后。放在4℃冰箱中进行菌种保藏。
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※培养基配方
• 培养基的配方： • 筛选培养基: 淀粉 20.0g，酵母膏5.0g，蛋
白胨 10g，Na2HPO4 5.0g， MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.1g，琼脂 20.0g，水 1000mL，pH7.0 － 7.4。 • Sday培养基配方：葡萄糖、酵母浸膏、琼 脂
离筛选与诱变选育［J］． 畜牧与饲料科学，2010， ( 9) ． • ［4］ 徐 琛． 产淀粉酶芽孢杆菌的筛选和分离［J］． 齐 鲁师范学院学报，2011，26(5) : 144-146． • ［5］ 来航线，杨保伟，邱学礼，薛泉宏． 9株芽孢杆菌 的初步分离鉴定与拮抗性试验［J］． 西北农林科技大学 学报，2004，32(7) : 93-96．
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※实验步骤
• 3、产淀粉酶菌株的复筛 • 将初筛得到的8个菌株在筛选培养基上划线分离，
37℃培养24~48h，长出单菌落后，选择直径为 1mm的单菌落，滴加卢戈氏碘液，观察是否有透 明水解圈，选取HC值较大的菌种作为复筛菌株即 实验菌株，进行菌种鉴定。 • 4、菌种的鉴定 • 对所筛选的菌种进行革兰氏染色、芽孢染色，通 过显微观察及菌落形态进行鉴定，得到最终的目 的菌种。具体实验方法参考微生物实验课本。
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2
※实验材料
• 1、实验仪器：磁力搅拌器、水浴锅、移液 枪、恒温箱、超净工作台、摇床、涂布棒、 接种环、枪头200μL 、显微镜、牙签（需 灭菌）
• 2、实验试剂：无菌水、淀粉、酵母膏、蛋 白胨、MgSO4·7H2O、Na2HPO4、琼脂、 卢戈氏碘液、NaCl、碘、碘化钾
产淀粉酶芽孢杆菌的筛选
酶学特性分析
总结词
通过测定产淀粉酶活性、酶学性质等指 标，对产淀粉酶芽孢杆菌进行深入分析 。
VS
详细描述
通过淀粉平板透明圈法等方法测定产淀粉 酶活性，了解其在不同条件下的酶活性能 表现。同时，通过酶学性质分析，了解产 淀粉酶芽孢杆菌所产淀粉酶的酶学性质， 如最适温度、最适pH值、热稳定性等指 标，为后续的应用提供理论依据。
生化特性分析
总结词
通过测定产淀粉酶芽孢杆菌对各类糖类的利用情况、酸碱指示剂的变色反应等指标，进一步鉴定其生 化特性。
详细描述
通过微量生化管实验，测定产淀粉酶芽孢杆菌对葡萄糖、蔗糖、乳糖等糖类的利用情况，观察其在不 同糖培养基上的生长情况。同时，通过酸碱指示剂的变色反应，观察产淀粉酶芽孢杆菌的代谢产物， 进一步鉴定其生化特性。
有机肥料
产淀粉酶芽孢杆菌可以与有机废弃物一起发酵，制成有机肥料，提供植物所需的营养元 素，同时改善土壤结构和肥力。
生物农药
产淀粉酶芽孢杆菌可以产生抗菌、抗病毒物质，抑制病原菌的生长和繁殖，减少植物病 害的发生和传播。
在环境保护中的应用
废水处理
产淀粉酶芽孢杆菌可以用于废水处理，通过 生物降解作用将废水中的有机物转化为无害 物质，降低废水对环境的污染。
菌种资源保护与利
用
加强产淀粉酶芽孢杆菌菌种资源 的保护和利用，建立菌种库和基 因库，为未来的研究和应用提供 丰富的资源保障。
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THANKS
对初筛得到的菌株进行发酵条件优化和酶活检测，进一步筛选出具 有更高酶活力的菌株。
分子生物学方法
利用分子生物学方法对筛选出的菌株进行基因序列分析，了解其淀粉 酶基因的类型和结构，为后续的工业化应用提供理论依据。
产淀粉酶芽孢杆菌的筛选和分离
碘 原 液 ： １ ｇ 碘 化 钾 ２ ｇ 加 水 定 容 至 碘 ｌ， ２，
５ ＯｒＬ。 ０ ａ
（ ａｉｕ） Ｂ ｃｌｓ 中能 产 生淀粉 酶 的菌 种较 多 ； 次 ， 孢 ｌ 其 芽
杆菌 属产 的 淀 粉 酶 有 较 好 的应 用 价 值 ， 凝 结 芽 如
孢杆 菌 、 草 芽 孢 杆 菌 、 热 芽 孢 杆 菌 、 衣 芽 孢 枯 嗜 地
成 菌悬液 ， 菌悬 液 置 于 ８ ％ 水浴 ２ ｉ ， 度 稀 将 ０ ０ｍｎ 梯
作 者简 介 ： 琛 （ ９４ ） 男 ， 苏 启 东 人 ， 教 徐 １８一 ， 江 助
总第 １７ ４ 期
释 至 １ ～。 ０
齐鲁师范学 院学报
终点 ， 录时 间 即为液 化 时间 。 记
取 ２０． １ 菌 悬 液 涂 布 于 筛 选 培 养 基 上 ， ０１ ０ ￣ Ｌ ３ ℃培 养 ２ ｈ ７ ４ 。在 菌落 周 围滴加 卢 戈 氏 碘液 ， 察 观 菌 落 周 围是 否 出现 透 明水 解 圈 ， 测 定 菌 落 及 水 并
第２ ６卷
第 ５期
齐 鲁 师 范 学 院 学 报
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｉ Ｎ ｒ ｌ ｎｖｒｔ ｏ ｒａ ｏ Ｑｌ ｕ ｏ Ｕ ｉｅｓｙ ｍａ ｉ
Ｖｏ ． ６ １ ２ Ｎｏ． ５
０ｃ ． ｔ２０１ １
２１ ０ １年 １ ０月
产 淀 粉 酶 芽 孢 杆 菌 的筛 选 和分 离
徐 琛
关键词 ： 芽孢 杆 菌 ； 粉 酶 ； 选 淀 筛
落 形 态观 察 、 兰 氏染 色和 芽孢 染 色初 步 鉴 定 这 ２株 菌株 为 芽孢 杆 菌属 。 革
中图分 类号 ：９ ９ ９ Ｑ ３ ．
第四组微生物大实验实验报告
微生物大实验——土壤中芽孢杆菌的分离及鉴定实验报告学院：生命科学学院专业：生物技术班级：组数:学号:姓名:前言芽孢杆菌是能形成芽孢(内生孢子)的杆菌。
芽孢是休眠体，不是繁殖体。
绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。
核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。
芽孢杆菌属是大的(4–10um), 革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。
该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。
芽孢杆菌属可分为以下亚群：多粘芽孢杆菌、枯草杆菌（包括蜡样杆菌和地衣芽孢杆菌）、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。
芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低PH值的有益微生物，本实验从土壤中分离出15株芽孢杆菌，从中挑选出一株芽孢杆菌进行生理生化鉴定，以及分子鉴定。
通过进一步的实验，了解到其生理生化特点。
一、实验目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。
将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二、实验原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。
，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三、实验仪器材料：1、仪器：显微镜、培养皿、试管、三角瓶、烧杯、移液管、涂布棒、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱、电泳仪、PCR仪、提取DNA 试剂盒2、材料：培养基：LB培养基、淀粉培养基、孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH 溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇、硝酸盐、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖四、实验步骤：（一）、菌种的分离和纯化1、取样2、LB培养基的配制：1L水、10g蛋白胨、5g牛肉膏、10g Nacl、15g琼脂、120℃灭菌30分钟待用3、平板及斜面的制备4、制备土壤菌悬液：称取土样约1g土壤放入盛有9ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上150r/min,振荡10min。
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从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、概述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研【】究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。
最常见的淀粉酶产生菌是芽孢杆菌。
其中，最常见的产淀粉酶芽孢杆菌是地衣芽【】【】枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2，凝结孢子3。
由于芽孢杆菌是一种需氧或兼性厌氧的杆状细菌，能产生抗胁迫的胚乳，其中许多是腐生细菌，主要分布在土壤中【】植物表面和水体4。
因此，本实验从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1.了解生物分离纯化的原理和方法。
2.掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生设计实验过程、综合分析和解决问题、判断实验结果的能力。
三、实验原理在自然界中，土壤是最适合微生物生长的环境。
土壤具有微生物生长、繁殖和生命活动所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。
从混合微生物群中仅获得一种或一株微生物的过程称为微生物分离和纯化。
平板分离法广泛应用于微生物的分离纯化。
基本原则是选择适合待分离微生物的生长条件，如营养素、pH、温度和氧气的要求，或添加一些抑制剂，以创造一个只利于微生物生长并抑制其他微生物生长的环境，从而消除一些不必要的微生物。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
芽孢杆菌的共同特征是：革兰氏阳性；阳性接触酶；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲酸不脱氨；分解酪蛋白；不分解酪氨酸；不产生二羟基丙酮；营养体的最高生长温度约为25℃～75℃以上；最低生长温度为5～45℃；生长的最低pH值为7.5-8至2左右；耐盐性范围为低于2%NaCl至25%NaCl；营养明胶（22℃）在7天内液化1cm或以上。
在糖发酵试验中，用阿拉伯糖、木糖和甘露糖代替枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌1它能为葡萄糖产生酸；作为营养生长的最低培养基，它不含维生素，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和维生素【】。
氨盐作为唯一的碳氮源6细菌特性1.繁殖快速:代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。
2.生命力强：能耐受-60℃低温和+280℃高温，无水分、强酸、强碱、抗菌消毒、高氧（有氧繁殖）和低氧（厌氧繁殖）。
3.体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。
四、实验材料和仪器4.1土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤4.2营养琼脂（%）。
加入琼脂，加热并煮沸以溶解琼脂。
4.3淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀粉0.2牛肉0.3蛋白1.0氯化钠0.5琼脂1.5～2.0校正ph至7.2～7.44.4发酵培养基（%）：玉米粉2豆饼粉1.5calcl0 02mgso40。
02nacl0。
25k2hpo40。
2柠檬酸钠0.2硫酸铵0.075（溶解后添加）na2hpo40 2。
正确的pH值7.04.5葡萄糖蛋白胨培养基（v.p试验用）（%）：葡萄糖0.5蛋白胨0.5k2hpo40.2校正ph7.2～7.44.6蛋白胨水培养基（用于吲哚试验）（%）：蛋白胨1%氯化钠0.5%校正pH 7 2～7.44.7西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5硫酸镁(mgso47h2o)0.02磷酸二氢铵0.1磷酸氢二钾0.1柠檬酸0.5琼脂2溴麝香草酚蓝溶液4酚红试剂校正ph6.8先将盐溶解在水中，校正pH值，然后加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，搅拌均匀，分成试管，在121℃下灭菌15分钟。
4.8配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调ph6.8~7.04.9耐盐培养基（%）：① 蛋白胨1牛肉提取物0.3氯化钠2琼脂1.5~2.0蒸馏水② 蛋白胨1牛肉提取物0.3氯化钠10琼脂1.5~2.0蒸馏水③ 蛋白胨1牛肉提取物0.3氯化钠20琼脂1.5~2.0蒸馏水④ 蛋白胨1牛肉提取物0.3氯化钠25琼脂1.5~2.0蒸馏水加入15%氢氧化钠溶液约2ml，校正ph至7.2～7.4。
加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。
4.10溶液或试剂染料革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀绿溶液,石炭酸复红液;香柏油、二甲苯吲哚试验：乙醚、吲哚试剂v、 P.试验：40%氢氧化钠溶液α-纳米苯酚，淀粉酶活力测定：1%3,5-二硝基水杨酸试剂4.11仪器或其他器具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯洗瓶玻棒试管酒精灯擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。
二恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌箱超净工作台水浴箱紫外灯照射箱磁力搅拌器玻璃珠移液管涂布器显微镜五、实验方法和步骤1。
初步筛选方法①制菌悬液：两个土样分别取5g，放入各自装有45ml无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。
每个环境的土样装1个锥形瓶，共2个，同时将其分为4组，编号ab。
② 加热和筛选孢子菌：将两个锥形瓶（无菌室内）塞住、包裹并摇匀，用恒温水浴装置在100℃左右进行水浴，并保持水浴锅温度15分钟（制作悬浮液时应先加热），以制备10-1g/ml土壤悬浮液③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9ml无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。
取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1ml土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。
同法从10-2的试管中吸取1ml稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。
在土壤稀释过程中，使用相同的吸管头从浓到稀进行稀释。
④涂布平板用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。
每个浓度做3个平板（重复）。
37℃下恒温培养24h。
2.重新筛选方法【1】划线接种（带状划线法）：从上述培养基中选择不同稀释度的不同形式的单菌落进行带状划线。
首先在平板培养基的一侧进行3~4的第一次平行划线，然后将培养皿旋转约60°，并在接种环上燃烧残留物。
冷却后，通过第一条划线部分做第二条平行线，然后用同样的方法通过第二条平行线部分做第三条平行线，通过第三条平行线部分做第四条平行线（如右图所示）。
划线后，盖上盘子，并在温室中以28~29°C的温度翻转大约20小时。
继续划线2-3次，以获得更多纯品系。
将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。
3.获得了产淀粉酶芽孢杆菌的纯菌株：上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37℃培养箱中培养24h。
从上述培养皿中取出一组带四个分区的淀粉牛肉酱培养基培养皿，放在实验室中，其余放在无菌室中。
在实验室中，将碘溶液加入到四个平板中，立即观察并记录阳性和阴性菌落的位置，同时记录透明圈的大小。
根据记录的阳性菌数，使用另一组营养琼脂平板上的相应菌落继续划线和接种。
培养后，对形态特征不一致的菌落进行计数，然后挑选一些进行革兰氏染色显微镜检查。
如果在视野中发现形状、大小和颜色一致的细菌，则将相应的菌株接种在新的营养琼脂平板上，标记并在37℃下培养24小时。
否则，继续划线分离，培养后进行革兰氏染色和镜检，直至获得纯芽孢杆菌，然后进行孢子染色。
在斜面上筛选并接种纯孢子种子。
3革兰氏染色步骤：涂片、干燥和固定初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。
复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。
镜检：油镜观察染色结果。
芽孢染色染色镜检：取枯草杆菌涂片，37℃培养18~24小时，干燥固定。
在涂片上滴3~5滴5%孔雀绿水溶液。
用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。
加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
用石炭酸复红液复染lmin，水洗。
薄膜干燥后，用油显微镜观察。
孢子是绿色的，细菌是红色的。
（注：观察孢子的形状和位置，参见伯杰细菌手册）4.斜面保存菌种标签：取几根无菌斜面试管，在试管上贴上带有菌种名称和接种日期的标签斜面的正上方，距试管口2～3cm处。
（每种菌接3管，标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应）。
进行斜面接种，堵塞并包裹，在37℃培养箱中培养24小时。
5、菌种的鉴定5.1将获得的倾斜菌接种在新平板上进行培养，观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿条件、形态、高度、透明度、边缘、易激发性、气味等。
然后进行一系列显微镜检查——革兰氏染色和孢子染色（具体步骤同上），观察其是否符合附表中的指标5.2芽孢杆菌生理生化试验温度对菌种培养的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验(v.p试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。
温度对微生物生长的影响将牛肉提取物蛋白胨融化，倒入盘中。
（培养基的厚度是普通培养基的1.5至2倍）取30套牛肉提取物蛋白胨板，分别贴上标签。
将不同菌株分别接种于上述培养皿中，每个菌株重复接种6个培养皿。
每株取两套平板，在4℃（冰箱）、37℃（室温）中倒置，在60℃下培养24小时，观察细菌生长情况。