生物化学实验复习要点 (1)

《生物化学实验》复习要点

一、对于凯氏定氮法测定生物组织总氮量实验，1试述样品消化的基本原理，2解析如何获得实验反应依据从而判断有机物被彻底消化的终点。3试述田氏指示剂在消化液被蒸馏、滴定时被使用的原理，4仪器使用时要注意控制好哪些会直接影响实验结果精确量化的实验要素。

1.生化原理：含氮有机物与浓硫酸共热时，其中碳和氢两个元素被氧化为二氧化碳和水，其中氮转化成氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵，称“消化”。

NH2CH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3

化学原理：2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4 硫酸铜作催化剂

物理原理：硫酸钾提高反应液的沸点；

2.消化液呈透明淡绿色时即消化完全，约需要2~3h

3.田氏试剂酸性时为紫色，碱性是为绿色，变色范围很窄且灵敏。

1.4.10ml移液管：取液时要精确量取，纸槽，橡皮管：连接蒸馏烧瓶与反应管的橡皮管尽量保持水平，使蒸汽顺利通过，保证实验结果的准确性

，皮管夹，棒状玻璃塞：在水封玻璃杯时要注意，表面皿，酸式滴定管：要耐心滴定避免出现误差

二、1蛋白质盐析和盐溶的关系，2卵清蛋白中的球蛋白和清蛋白盐析的原理与步骤。3简要写出测定牛奶酪蛋白的方法和步骤。4简述提取动植物体蛋白质的基本方法和步骤，5举例说明牛乳酪蛋白质含量测定的实验原理。

1.盐析一般是指在蛋白质溶液中加入一定量的高浓度中性盐，使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。盐溶在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。

2.原理：高浓度的盐能破坏水化层并中和电荷，从而使蛋白质聚集。使不同蛋白析出的盐的浓度不同，球蛋白的可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸溶液中才能析出。

步骤：

5%卵清蛋白5mL于试管→等量饱和硫酸铵溶液→混匀静置→

①→过滤→滤液中加硫酸铵粉末→观察记录→取出沉淀后加水→观察记录（球）

②→倒出浑浊沉淀→加少量水→观察记录（清）

3.（一）酪蛋白的粗提

100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化

1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。

2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液30 mL 洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

3、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

4.根据样品重量，准备提取液放在冰上。把样品放在研钵中用研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。用离心机离心10分钟，提取上清液，样品制备完成。

5.利用酪蛋白的等电点为4.7，所以调节牛奶的pH4.7使酪蛋白沉淀洗出。等电点是调节溶液的pH, 使

蛋白质所带的正电荷和负电荷恰好相等，总净电荷为零，以两性离子存在，不想阳极移动也不想阴极移动，此溶液的pH称为蛋白质的等电点。酪蛋白不溶于乙醇、乙醚等试剂。因而加入乙醇乙醚洗涤沉淀物除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、1简述电泳的原理，2缓冲溶液pH值对血清蛋白电泳的影响作用；3分析在你实验中有可能导致血清电泳色带分离模糊不清晰的原因。

1.电泳：是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

2.血清蛋白质的等电点均低于pH7.0 ，电泳时常采用pH8.6 的缓冲液，因此，各种蛋白质皆带负电荷，在电场中向正极移动，因泳动速度不同而被分离。醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白质分离为清蛋白 A 、α1 、α2 、β和γ- 球蛋白，将蛋白质染色后，可按染色区带位置进行定性观察，也可对各条色带进行定量测定

3.点样的量太少，并且没有平行；在进行电泳时与其他有交叠，使其他薄膜上的蛋白跑到自己的薄膜上；电泳不完全，致使蛋白质没有分离开,一种蛋白有分离出去，其他的没有；漂洗过头。（次题答案有灵活性很大）

四、1简述利用分光光度计测定豆芽菜中蛋白质的含量的流程？2使用分光光度计时，要注意哪些操作要领。3分光光度计测定前预热的目的是什么？4连续测试读数时操作要注意什么？5简述分光光度计测定转氨酶活力的生化反应原理。

1、（1）准确称取约1g绿豆芽下胚轴→放入研钵中→加入5ml蒸馏水研成匀浆→放入离心仪中离心（4000r ／min，10min）→将上清液倒入50ml容量瓶，再向残渣中加入5ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定容至刻度。

（2）另取2支具塞试管→准确加入1.0ml样品提取液→加入5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合→放置2min后→以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。

2. *若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正“0”和“100%”点。然后再测量。*指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。

*比色皿使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。

3、测量的时候数值会比较稳定

4、

5、生物酶具有活性，在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和a-酮戊二酸作用下生成丙酮酸和谷氨酸。本实验以丙氨酸和a-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛坐辅酶，在一定条件以及时间的作用下，测定所生成的丙酮酸的量来确定酶的活力。丙酮酸能与２，４－二硝基苯肼结合，生成丙酮酸－２，４二硝基苯腙，后者可以在碱性溶液中呈现棕色，其吸光谱在４３９－５３０nm。可用于测定丙酮酸的含量。

五、1什么是酸价？2为什么可以用酸价作为评价地沟油的指标？3测定酸价添加中性醇醚混合液的目的是什么？4如何排除中性醇醚混合液的干扰？5如果酚酞指示剂用量不足，NaOH溶液中和滴定反应产物时会导致什么结果？

1、油脂中游离脂肪酸用NaOH标准溶液进行滴定，中和1g 油脂中所含游离脂肪酸所需NaOH的毫克数称为酸价

2.因为酸价可以确定油脂中游离脂肪酸的量，可以根据地沟油的酸价来判断其游离脂肪酸的量，所以酸价可以作为评定地沟油的指标。

3.使油脂溶解在中性醇醚混合液中，分离出油脂中不饱和脂肪酸，易于NaOH与游离脂肪酸反应。

4.（个人发挥）导致反映中需加入的氢氧化钠过多照成实验误差，照成反映现象不明显。

六、1举例说明影响生物酶活性的最适温度指标；2简要说明制备肝匀浆时如何防止转氨酶活性的降低操作要领；3分析2, 4—二硝基苯肼溶液测定转氨酶活力所起到作用。4试以唾液淀粉酶为例设计验证温度对酶活力影响的实验方案，并说明原理。5、pH对唾液酶实验设计，为什么要设计时间变量测定唾液酶对淀粉的反应程度？6使用唾液酶有可有结导致实验不满意或失败的原因有哪些？1.在酶促反应中，随温度的升高，酶会因热变性而失活，从而减慢反应速率。因此在较低的温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而增大。超过一定的温度后，反应速率降低。高温能够使酶失去活性。低温能

够降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活，大多数动物酶的最适温度在３７度到４０度，植物酶的最适温

度在５０度到６０度。唾液淀粉酶是动物唾液中一种具有催化活性的蛋白质。

2. 1、肝匀浆要研磨充分2、要加入ph为4.7的磷酸缓冲液3、配置完后要低温保存。

3.丙酮酸能与２，４－二硝基苯肼结合，生成丙酮酸－２，４二硝基苯腙，后者可以在碱性溶液中呈现棕色，其吸光谱在４３９－５３０nm。可用于测定丙酮酸的含量。

4.取三支试管－－编号－－按下表添加试剂（用移液管量取）

内取出一般的液体，加到一个干净的试管中－－编号为４号管－－用碘化钾－碘溶液检验１、２、３管内的淀粉－－记录结果－－将４号管放到３７度的恒温水浴中保温１０min－－用碘化钾－碘溶液检验－－记录现象

实验原理

生物原理：在酶促反应中，随温度的升高，酶会因热变性而失活，从而减慢反应速率。因此在较低的温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而增大。超过一定的温度后，反应速率降低。高温能够使酶失去活性。低温能够降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活，大多数动物酶的最适温度在３７度到４０度，植物酶的最适温度在５０度到６０度。唾液淀粉酶是动物唾液中一种具有催化活性的蛋白质。

化学原理：淀粉遇碘变蓝色，不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

5.因为这样才能保证控制变量，保证反应变量相同，避免照成实验误差。

6.（个人发挥）1、唾液酶的活性太低或已经失洉。