哺乳动物胚胎冷冻保存

摘 要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受从稀释液和冷冻保护剂、冷冻前处理、冷冻剂型、冷冻速率、解冻等方面的因素。,其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻;玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻法简化了操作过程,大大缩短了操作时间,不需昂贵的程序控制冷冻仪。

关键词:胚胎;冷冻保存;冷冻保护剂;冷冻;解冻,玻璃化 胚胎冷冻保存[1]是指通过特殊的保护措施和降温程序,使胚胎在-196℃条件下停止代谢,而升温后又恢复代谢能力的一种技术。一般指0～-80℃的温度下保存胚胎,而超低温冷冻保存则是在极低的温度(液氮-196℃、液氦-269℃)下保存动物胚胎.处于超低温下的胚胎,其新陈代谢几乎完全暂时停止,因而可以达到长期保存的目的[2]。1972年Whittingham[3，4，5]等首次在超低温条件下成功地冷冻保存了小鼠胚胎, 解冻后移植产下后代。由于这种方法的诞生引来了很多的人的注意，此后,许多学者对哺乳动物胚胎冷冻保存进行了大量的研究,取得了大量研究成果, 牛(Wilmut & Rowson,1973)、家兔(Whittingham & Adams,1976)、大鼠(Whittingham,1975)、山羊(Bilton et al.,1976)和绵羊(Willadsen et al.,1976)等动物的胚胎超低温保存也相继取得成功. 1977年Willadsen等[6]对上述方法进行了改良,发明了快速冷冻法,将冷冻降温时间缩短了1 h.1985年Rall等[7]首次发明了玻璃化冷冻法,对小鼠8细胞胚胎冷冻保存取得成功.随后经研究者的不断改进,使这项技术日趋成熟,部分动物胚胎经玻璃化冷冻后已在生产中示范应用,有望在生产实际中得到推广，本文对哺乳动物胚胎冷冻保存技术的最新研究进展加以综述。 1 冷冻保护剂的种类 抗冻保护剂(Cryoprotective agents,CAP)也就是冷冻保存剂是指可以保护细胞抵抗低温或超低温时对细胞产生的损害,如细胞结冰、脱水、溶质浓度提高和蛋白质变性及其骨架结构的损伤等的一类化合物。 1.1抗冻保护剂[8] 主要包括丙三醇(glycer-ol)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)、丙二醇(propyleneglycol)、乙二醇( ethylene glycol)、乙酰胺( acetamide)、甲醇(methyl alcohol)和丁二醇(butadiene)等。又称细胞内液抗冻保护剂,这类保护剂分子量小, 能够保证细胞内水分的及时脱出,而且还能降低溶液的凝固点,这样使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出,避免细胞内形成冰晶。并通过与胚胎的平衡,替换出细胞内的部分水分,这样降低细胞内形成冰晶。但是它们对胚胎有毒害作用,尤其在高浓度或高温下毒害作用更大。 各种渗透性抗冻保护剂对胚胎的保护作用机制基本是相同的,但它们的毒性和渗透性有很大差别,因此在玻璃化冷冻的胚胎存活率上效果不同。关于不同种类的抗冻保护剂的渗透性和毒性,Leibo用毒性相对较低的Gly和EG对牛胚作对比研究发现,EG对细胞的渗透性强。Kasai等用30% (v/v)浓度抗冻保护剂处理小鼠桑椹胚30 min,观察对生存率影响实验的结果表明,乙二醇的化学毒性最小,其次是丙三醇、DMSO、丙二醇,乙酰胺毒性最高。另外,对不同发育时期的胚胎来说,抗冻保护剂的毒性也不尽相同。

1. 2分子量非渗透性抗冻保护剂 低分子量非渗透性冷冻保护剂是胚胎冷冻液中 的另一个关键性成分。其主要指糖类,如单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)、二糖(蔗糖、海藻糖)和多糖(棉子糖),目前应用最广泛的是蔗糖。糖类除了能通过提高渗透压来促进细胞脱水外,还能保持细胞结构的完整。同时,糖类能减少达到玻璃化所需的渗透性冷冻保护剂的浓度,这两个特性均可降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。此外,糖类还可以作为渗透压缓冲物质,其通过减少解冻时细胞的膨胀速度和程度来减少渗透性损伤的发生。这类冷冻保护剂在低温下对胚胎无毒害作用,但是温度升高时却有毒害作用。 1.3 大分子物质 常用的大分子物质主要有聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、透明质酸钠、葡聚糖等聚合物。这类冷冻保护剂比渗透性冷冻保护剂毒性低,并且有促进玻璃化的作用,能部分替代渗透性冷冻保护剂,降低冷冻液的毒性。由于胚胎解冻时比冷冻时更易形成致死冰晶,因此克服解冻时形成致死冰晶也至关重要,据报道,许多大分子物质,如聚乙二醇、聚蔗糖、透明质酸钠等具有阻止解冻时形成冰晶的作用。

2 冷冻方法 自从1972年Whittingham等首次采用慢速冷冻法成功地冷冻保存小鼠胚胎以来,许多学者开始了对胚胎冷冻保存方法的研究,研究的热点主要集中在提高冷冻保存胚胎的活力和简化冷冻程序上。到目前为止,胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法、玻璃化冷冻法和快速冷冻法。 2.1 分段慢速冷冻 这是最早建立起来的一种哺乳动物胚胎冷冻方法[9]，以低于1℃/min的速度降低到-40℃或-70℃(小鼠)、-60℃～-120℃(牛)、-80℃(卵母细胞)，再投入液氮，解冻速度也不超过25℃/min。该法的优点是脱水完全，细胞内不易形态冰晶，但比较费时，冷冻保护剂对胚胎作用时间较长[B]，尽管哺乳动物胚胎冷冻保存技术已经出现30多年,冷冻技术的研究也取得了很大的进步,但是到目前为止,常规慢速冷冻法仍然是哺乳动物胚胎冷冻保存的主要方法。此方法选择较低浓度的渗透性冷冻保护剂,采用缓慢降温和快速解冻的方法来冷冻保存胚胎。常规慢速冷冻法可分为以下几个步 骤:①室温下胚胎置于冷冻液中5 min~10 min,使胚胎和冷冻液间达到平衡;②在-5℃~-9℃之间植冰;③以0.3℃~0.6℃/分的速度缓慢降温;④降温到-30℃~-40℃之间,投入液氮中保存; ⑤以250℃/min的速度快速解冻;⑥在培养或移植前,室温下除去冷冻保护剂 分段慢速降温在哺乳动物胚胎的冷冻保存中常用,大都获得了成功。Zhang等(1989)在进行鲤鱼胚胎的冷冻保存时也采用了这种降温模式,获得了液氮中保存的鲤鱼胚(陈松林2002)。胎有25%复活并孵出鱼苗的成功实例。张克俭等(1997)对泥鳅等3种淡水鱼胚胎进行的冷冻保存实验表明,分段快速降温好于分段慢速降温。Guo等(1994)在研究牡蛎胚胎的冷冻保存时,认为1.5℃/min的降温速率效果最好。 2.2 分段快速冷冻法 为目前最成熟的方法。与一步法相比，虽然操作比较繁杂，需要专门的冷冻仪，但胚胎解冻后存活率及移植成功率较高，为目前生产中最常用的方法，其具体操作步骤如下： (1)胚胎的采集及洗涤 用手术法或非手术法采集胚胎后，选择形态正常的桑椹胚或囊胚在含20％犊牛血清的PBS中洗涤两次。 (2)加入冷冻液 洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4M甘油的冷冻液中平衡20分钟。 (3)装管和标记 按图10-8类似的装管方法将胚胎和冷冻液装入0.25ml细管中，封口，并在细管外标记供体号，胚胎数量，等级，冷冻日期等。 (4)冷冻和诱发结晶(植冰) 将装入细管的胚胎放人冷冻仪中，在0℃平衡10分钟，以1℃／分的速度降至-6～-7℃，在此温度下诱发结晶，并平衡10分钟。然后以0.3℃／分的速度降温至-35～-38℃，投入液氮保存。 (5)解冻和脱除保护剂从液氮中取出装胚胎的细管，立即投入37℃水浴中，并轻轻摆动，1分钟后取出即完成解冻过程。然后用0.2～0.5M蔗糖PBS液分两步或一步法脱除冷冻保护剂使胚胎复水，最后移入PBS培养液中准备移植。 此外，目前研究的细管内一步解冻方法，选用乙二醇等对胚胎无毒害作用的保护液，装管时含有胚胎的保护液占1份，两端的PBS液共占3份。按快速法冷冻解冻后，在细管内直接脱除或不脱除保护剂即可直接移植。该方法简化了程序，便于胚胎移植推广，但有待改进提高妊娠率。其与分段慢速降温的主要差别就是从0℃~-60℃,采用2~5℃/min的降温速率 2.3 玻璃化冷冻 玻璃化(vitrification)是指利用物理学原理将高浓度的抗冻保护剂急速降温后,由液态转化为外形类似玻璃状的稳定而透明的非晶体化固体状态的过程。[10]它的主要特点是使用冷冻和解冻速率均较快的高浓度的低温保护剂、操作简单、不需要昂贵的设备。玻璃化冷冻不要求严格的降温速度,就方法而言,最不利的因素就是高浓度的冷冻液对胚胎造成的毒害作用,所以胚胎暴露在冷冻液的时间应严格控制在一定范围之内。这种方法采用快速降温和高浓度的冷冻保护剂,使冷冻过程中溶液变得十分黏稠和坚固,不形成冰晶伤害。从而在这到冷冻保存。从1985年Rally和Fahy首次用玻璃化法冷冻小鼠胚胎获得成功,玻璃化冷冻技术就成为学者们的研究热点。之后玻璃化冷冻保存不断改进。目前,玻璃化冷冻技术不仅能成功地冷冻保存多种哺乳动物的胚胎,而且还能冷冻保存对低温敏感性高的卵母细胞。

2.3.1冷冻保存原理[11] 胚胎低温冷冻保存实际上是一个脱水过程,冷冻保存最关键的是设法减少细胞内冰晶所致的损伤。所以冷冻速度和冷冻保护剂是影响玻璃化冷冻保存的两个关键因素。要在一定的冷冻速度下形成玻璃化状态,就需要高浓度的冷冻保护剂,但是浓度过高的冷冻保护剂又会对胚胎产生毒害。不同种冷冻保护剂形成玻璃化的能力和对胚胎的毒性也不一样。因此寻找毒性低、形成玻璃化能力强的玻璃化冷冻液成为胚胎玻璃化冷冻研究的热点之一。大量研究表明提高冷冻速度能有效的降低冷冻剂对胚胎的毒性作用，同时把不同种类的冷冻保护剂组合成玻璃化冷冻液,也能达到降低冷冻保护剂对胚胎毒害作用,提高玻璃化冷冻效果的目的。冷冻过和中标本降到一定温度时,首先在细胞外溶液形成冰晶,而细胞尚未结冰,处于超冷状态。随着细胞外液冰晶逐渐增大,细胞外液的渗透压升高,具有较高的化学能。如果冷冻速度很慢,细胞膜两侧的渗透压差和化学能差导致细胞质水分跨膜向细胞外渗透引起细胞内进行性脱水,因此细胞内不能形成冰晶。相反,如果冷冻速度过快,细胞内水分不能及时渗出,而在细胞内形成冰晶,胞浆内结冰过多会破坏细胞器,刺破细胞膜,导致细胞死亡。通过冻前在稀释液中加入一定浓度的低温保护剂,让细胞在保护剂中平衡并适当脱水,可将损伤降到最低限度。胚胎在冷冻过程中,大约在-10℃以上细胞内不结冰,但处于过冷状态的胞质产生溶液效应和细胞内外化学势差异,导致胞质水分在胞内和胞外冻结,这两情况谁占优势对细胞存活尤为重要。在温度降到-10℃以下,过冷胞质就形成冰晶,胚胎在冷冻过程和解冻过程中两通过易形成冰晶的危险温区(-15~-50℃),所以采用适当的冷冻方法和低温保护剂,使胚胎安全通过危险区很重要。将胚胎在冷冻前进行处理,向保存液中加入保护剂如甘油和蔗糖,可以改变细胞膜渗透性和溶液渗透性,防止溶液效应和渗透压差异,减少降温和复温过程中冰晶的形成。玻璃化冷冻保存胚胎时,其高浓度的渗透性保护剂组成的玻璃化液是一种黏稠的玻璃态物质,低温时它不结晶就可固化。胚胎在这种溶液中脱水一定程度,可引起内源性大分子和已渗入的保护剂浓缩,从而使细胞在急剧降温过程中得以保护。但无论怎么样的方法只有在最大冷冻速度和最大冷冻保存浓度上达到一个平衡才能达达理想的冷冻保存目的。 2.3.2玻璃化溶液中的处理过程 2.3.2.1 一步法 玻璃化冷冻胚胎最简单的方法是将胚胎从生理溶液中直接移入玻璃化溶液中去,然后将其投入液氮保存。一步法具备时间短的优势,但为了防止胚胎细胞内冰晶的形成,抗冻保护剂必须充分渗透于胚胎细胞内部。而且,抗冻保护剂的渗透和它的毒性很大程度上受温度的影响,最适的处理时间和温度是相关的。在较低温度下处理时间可延长,较高温度下可缩短。例如,小