人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植双荧光模型的建立重点
肿瘤动物模型“新宠“——PDTX篇
肿瘤动物模型“新宠“——PDTX篇导读近年来，随着“肿瘤精准医疗”概念的提出，一种新的肿瘤模型应运而生，并被称为“目前最接近人类临床实际情况的肿瘤模型”，它对肿瘤新药研发、靶点筛选及个性化治疗起着重大推动作用。
它就是我们本期主角：人源肿瘤组织异种移植模型（PDTX），本文就为大家详细介绍这种PDTX模型的应用和常见PDTX模型的建立。
什么是PDTX模型？PDTX（Patient-derived tumor xenograft）即人源性肿瘤组织异种移植模型，又名PDX。
指将肿瘤患者的新鲜肿瘤组织移植（异位或原位）到免疫缺陷鼠（NOD/SCID、NRG小鼠等）上，在小鼠上培育出人的肿瘤组织。
该模型保持了人源肿瘤的原始多样性，更好地模拟了肿瘤细胞在人体内的生长环境[1]。
PDTX模型与CDTX比较，优势在哪里？CDTX（肿瘤细胞系移植模型）一直是我们往期内容的主角，它因易构建、成瘤率高、周期短等优点而被广泛应用，然而却依然存在一些缺陷而无法接近临床病人肿瘤的实际情况。
最大的缺陷就是CDTX缺乏肿瘤异质性！CDTX也可称为传统的荷瘤模型，即使用传统的体外处理过的永生化肿瘤细胞系移植小鼠，由于这类细胞的同质性，缺少细胞外基质、非肿瘤细胞等肿瘤微环境，使得肿瘤移植后难以有临床组织病理特征。
因此所得出的药物剂量范围、疗效与实际临床会有较大出入[2]。
就在去年，美国国家癌症研究所（NCI）宣布被全世界使用了25年的NCI-60（在培养基中生长的60种人类癌细胞系）从其药物筛选程序中“退休”，并决定将启动一个得到更新的、来源于病人新鲜样本的癌症模型库。
如下表为PDTX与CDTX的比较：PDTX的应用1. 药物筛选：经过近几十年的研究，发现PDTX模型进行药物筛选的结果跟临床的相关性非常高，所以很多研究单位和制药企业都纷纷采用PDTX模型进行肿瘤药物的筛选和评估，得出更加合理有效的治疗方案[3]。
2. 肿瘤个性化治疗：同一肿瘤在不同患者上发展情况不同，加上同一肿瘤还有许多分型，因此选择的治疗方法也不相同。
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法
人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。
将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。
HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。
利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。
一、实验材料准备1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。
2. 肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)，5% CO237℃培养，常规传代。
3. 质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司)，携带Neomycin耐药基因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。
G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 ug/ml维持筛选。
二、细胞的转染1. 哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞，转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。
2. 后培养液内加G418筛选获得稳定转染。
3. 利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。
4. 1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加G418(200 ug/ml)维持筛选。
5. 测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。
6. 待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2x长x宽计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。
三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立1. 取转染后细胞，用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5x106/0.2 ml备用。
细胞系移植性肿瘤小鼠模型（CDX）构建
细胞系移植性肿瘤小鼠模型（CDX）构建
细胞系移植性肿瘤模型是最为常见和使用最广泛的小鼠模型，原理是将肿瘤细胞系注射到小鼠皮下或任意想要研究的发病部位，肿瘤细胞将在注射处增殖生长。
常用的移植小鼠品系是裸鼠BALB/c-nu。
（1）皮下移植瘤推荐指数：★★★★优点：成本低、周期短、易操作、重复性好，可进行基因敲除/过表达后的成瘤研究。
缺点：皮下移植难以展现肿瘤原位和转移情况，缺乏肿瘤异质性。
适用研究：几乎适用于所有肿瘤的增殖、发生、耐药研究。
获取方法：选取合适的肿瘤细胞系或敲减/过表达细胞，皮下接种出生4-8周的裸鼠。
（2）原位移植瘤推荐指数：★★★优点：成本低、周期短、重复性好，可进行肿瘤原位和转移观察，可进行基因敲除/过表达后的成瘤研究。
缺点：具有一定操作难度，缺乏肿瘤异质性。
适用研究：肿瘤增殖、转移研究。
获取方法：与皮下移植瘤相似，不同的是在器官原位接种肿瘤细胞，而非皮下。
裸鼠皮下移植瘤实验造模步骤
裸鼠皮下移植瘤实验造模步骤顾名思义，这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。
种植的点也有讲究，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。
可根据实验设计选择移植点，统一移植点的位置，除了遵守实验统一的条件外，待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。
裸鼠（Balb/c 鼠，无毛发， T 淋巴细胞缺陷）是比较常见和常用的实验用鼠，尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。
裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。
当然，这种肿瘤模型也有缺陷，即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。
☞肿瘤细胞移植时的简要步骤首先准备好要移植的肿瘤细胞（细胞量根据不同肿瘤略有不同，我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择1x106 左右；肿瘤细胞可与基质胶 1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取，基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境，有助于肿瘤细胞生长）。
戴无菌手套后，将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤，然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。
将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒3 次。
右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器，在腹股沟或腋窝的位置，45 度斜角进针，注意不要突破腹膜，将针头保持于皮下位置。
然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下（肿瘤细胞量约1x106），快速退针，左手食指轻压针孔约1 min 后将小鼠放回饲养笼中，注意将小鼠侧放于垫料上，放置其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。
2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。
如果是利用肿瘤组织（人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代）建立裸鼠皮下移植瘤模型，则需要首先将肿瘤组织用无菌PBS（或1640 培养基）洗涤3 次，然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3体积的小块（种植前可裹基质胶）备用。
将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上，四肢用胶带固定，将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次，然后用眼科剪剪开约 0.5 cm 小口，小镊子将皮下筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部，每个位置放置 2～3 块肿瘤组织，注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。
动物模型：裸鼠PC-9细胞肿瘤模型
动物模型：裸鼠PC-9细胞肿瘤模型一、嘉美实验裸鼠PC-9细胞肿瘤模型的构建方法采用腋窝皮下接种PC-9人肺癌细胞，建立PC-9人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型并给与药物进行干预，观察药物对肿瘤的作用。
二、裸鼠PC-9细胞肿瘤模型的构建及后续实验操作1、25只BALB c裸鼠，适应性饲养一周后，调整制备好的PC-9人肺腺癌细胞单细胞悬液浓度，用1m 1l无菌注射器吸取细胞悬液，于每裸鼠右侧腋下皮下注射0.2mL细胞悬液(接种细丹包量约为1×x102/ml)，细胞悬液接种于裸鼠的右侧腋下7-10d后，观察成瘤情况，肿瘤仁本积大于100m3后，选取肿瘤大小相近的小鼠按肿瘤体积随机分为4组:(1)对照组，5只；(2)高剂量组，7只:(3)中剂量组，7 )顺铂组，6只。
当天高剂量组、中剂量组、顺铂组开始给药其中，高剂量组连续21天每天灌胃给药，顺铂组每三天腹腔注射给药，齐量5m/e次。
每两天测量荷瘤裸鼠体重和冲瘤体积。
于第22天停止给药病禁食2h，第再次测量肿瘤体积，计算相对肿瘤体积(RTV)，绘制肿瘤生长曲线，毛材当天称量最后一次体重和瘤重计算肿瘤指数完整剥离瘤块，其中一半瘤块组织于 10%福尔马林中固定，备用；另半肿瘤组织存放于液氮中冻存。
血样用109 mmol/L枸櫞酸钠19抗凝，分离血浆。
2、小鼠接种PC-9人肺腺癌细胞后 9天左右，可观察到裸鼠右侧腋下均现黄豆大小瘤块，于当天开始测量肿瘤体积并称重。
于接种第11天时，测量肿瘤生长指数和体重时发现，各组荷瘤裸鼠肿瘤体积均值达到100mm3，于当天开始分组给药在给药过程中发现，顺铂组荷瘤裸鼠的体重下阳夆明显，与对照组相比具有极显著性差异루(P<0.01)高剂量组荷瘤裸鼠的体重于d7、dI 3、d19天时有显著性差异(P~0.05)，其他各组体重与对照组相比均无明显差异。
顺铂组肿瘤体积于d13、d17、dl9、d21 d23时与对照组相比明显减小，并有显著性差 :(P<0.05)，在d15天时有极显著性差쿠(P<0.01)。
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法先用组织学完整的新鲜人肝癌组织接种于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型），并将其与直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型作比较。
一、间接肝原位移植瘤模型的制备1. 用新鲜的肝癌外科手术切除标本（来自长海医院，患者为1名47岁男性，病理诊断：肝左叶肝细胞癌，粗梁型，Ⅱ级），在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1～2 mm3小块。
2. 取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1 cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成1～2 mm3小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。
3. 取上述2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。
二、直接肝原位移植瘤模型的制备1. 同一例新鲜肝癌手术切除标本，处理方法同皮下移植，裸鼠处理同间接肝原位移植，取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头直接植入裸鼠肝右叶深部实质内。
2. 皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型的制备。
三、病理检查和相关指标检测1. 解剖和组织学检查（1）所有裸鼠接种后，分组分笼饲养，自由进食，每天观察1～2次。
（2）当裸鼠处于全身衰竭状态时处死并作大体解剖，对接种瘤和转移瘤分别进行观察、测量，记录肿瘤侵袭和转移情况，重要器官（主要为肝和肺）经10%中性甲醛固定后，常规石蜡制片，光学显微镜检查。
2. 周围血甲胎蛋白(AFP)检测处死前，均采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。
3. 瘤细胞DNA含量分析留取部分移植瘤标本采用流式细胞术进行DNA含量分析。
注意事项目前，肝癌的复发和转移仍然是其术后长期存活的主要障碍。
为了研究肿瘤的转移机制，建立接近于人体的肿瘤动物模型显得尤为重要。
人卵巢癌裸鼠卵巢原位移植瘤模型的构建
人卵巢癌裸鼠卵巢原位移植瘤模型的构建詹光熙;彭书敏;美丽古丽·莫合买提;郭晓青【摘要】To build a suitable animal ovarian cancer model in vivo,so as to study the mechanism of its progression.Lentivirus transfection technology was used to build a green fluorescent protein (GFP) marked EOC cells model:SKOV3 (human ovarian serous carcinoma cell lines) and ES-2 (human ovarian clear cell carcinoma cell lines).After isoflurane anesthesia,4-6 week old BALB / C (nu / nu) nude female,back into the abdominal cavity from the median longitudinal incision.Micro multipoint injection method was used to transplant suspension cell model in one side ovary;Night OWL vivo imaging system was used to dynamically observe the growth and metastasis of xenografts in nude mice.Nude mice were dissected at 4-6 weeks after transplantation,the ovarian and metastatic tissues were stained with HE.Both SKOV3 and ES-2 GFP positive cell model was successfully constructed with ovarian orthotopic xenograft.nude mice did not lead to surgical death,the success rate of orthotopic transplanted tumor model in nude mice was 100％.The in vivo imaging system can dynamically monitor the growth of a transplanted tumor in nude mice by detecting the fluorescence intensity and range of GFP.SKOV3 cell model was built-in ovarian canceer and metastatic tissues,HE staining pathological features consistent with human ovarian serous adenocarcinoma;ES-2 cell model was built-in ovarian cancer and metastatic tissues,HE staining pathological features consistent with humanovarian clear cell carcinoma.it can be concluded that inhalation of isoflurane anesthesia,middle of the back vertical incision into the abdominal cavity,micro multipoint injection of GFP-carrying EOC cell model,can be successfully constructed dynamic observation of ovarian orthotopic transplantation tumor in nude mice animal models.This animal model is similar to the biological characteristics of human ovarian cancer and is suitable as an in vivo model to study the development of human ovarian cancer.%为探讨人卵巢癌进展机制的相关研究,构建适宜的体内动物模型.采用慢病毒转染技术,构建稳定过表达绿色荧光报告基因(GFP)的人EOC细胞模型:SKOV3(人卵巢浆液性腺癌细胞株)和ES-2(人卵巢透明细胞癌细胞株);异氟烷吸入麻醉4-6周龄BALB/C(nu/nu)雌性裸鼠,从裸鼠背部正中纵切口进入腹腔,显微多点注射法分别将细胞模型悬液,移植于裸鼠的单侧卵巢,每组6只裸鼠;NightOWL 活体成像系统动态观察裸鼠移植瘤生长和转移情况;移植术后4-6周解剖裸鼠,取卵巢和转移瘤组织行HE染色.结果显示,携带GFP的EOC细胞模型SKOV3和ES-2,均可成功构建裸鼠卵巢原位移植瘤模型,裸鼠未发生手术原因死亡,成功率均100％;活体成像系统通过检测GFP的荧光强度和范围,能够动态监测裸鼠移植瘤生长情况;SKOV3细胞模型构建的卵巢癌和转移瘤组织,HE染色观察病理特征符合人卵巢浆液性腺癌;ES-2细胞模型构建的卵巢癌和转移瘤组织,HE染色观察病理特征符合人卵巢透明细胞癌.由此可知,异氟烷吸人麻醉、从背部正中纵切口进入腹腔、显微多点注射法移植携带GFP的EOC细胞模型,能成功构建可动态监测的裸鼠卵巢原位移植瘤动物模型;该动物模型与人卵巢癌生物学特征类似,适宜作为研究人卵巢癌演变进展的体内模型.【期刊名称】《石河子大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(035)005【总页数】6页(P574-579)【关键词】卵巢癌;裸鼠;卵巢原位移植瘤模型;显微多点注射法【作者】詹光熙;彭书敏;美丽古丽·莫合买提;郭晓青【作者单位】石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;同济大学附属第一妇婴保健院,上海200040【正文语种】中文【中图分类】R711.75卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤 [1]，早期往往缺乏典型临床症状，且没有灵敏的标志物和筛选手段，约超过70%的病人在被确诊时已是疾病晚期，其5年生存率不到30%，极易发生侵袭、转移等生物学特性是导致其预后差、死亡率高的主要因素之一[2]。
裸鼠移植瘤方法建立
裸鼠移植瘤方法建立1.细胞准备：1.1用PBS 清洗细胞两遍，加入胰酶消化，吹打离心，无血清培养基清洗两次，然后用无血清培养基将细胞重悬，进行细胞计数，使得200μL 悬浮液里面含有1×107个细胞。
总共需要细胞: 18（只）*200ul*1.2=4.32ml×107个，将混合好的细胞放于4°C冰盒运至动物房。
2.裸鼠准备：2.1 3周龄小鼠饲养一周后，每只于右侧腋腹壁皮下接种MDA-MB-231和MCF-7细胞1×107/200μ L。
每日观察肿瘤生长情况, 待出瘤后使用游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积=(D×d 2)/2(D表示肿瘤的长径, d表示肿瘤的短径)。
（注射器型号BD一次性使用无菌胰岛素注射器规格：1ml 25G）2.2 当肿瘤体积约为80 mm 3 时(100至150左右)，将裸鼠进行随机分成3 组（肿瘤大小，体重尽量接近），每组3只。
对照组，TO901317组，DADS组。
每天（每天给药？会不会太频繁？可以查阅相关类似成药的半衰期或综合国外文献的数据）将实验组灌胃TO901317，剂量为25mg/kg/d，将粉末状的TO901317 溶解到蓖麻油（或芝麻油以及生理盐水）里，每只裸鼠注射含有TO901317 的蓖麻油200μL；对照组注射等体积的蓖麻油。
连续注射两周。
（12号灌胃针头，每次用后一定要煮沸消毒）（灌胃进针时针头偏右，一般就不会进肺了）腹腔注射DADS，剂量为50mg/kg (含10%小牛血清的D ME M 培养液（最好使用生理盐水）)每次注射200 μL , 隔日注射, 连续7次给药。
2.3每2～3d观察测量1次, 计算肿瘤相对体积(RTV)。
以每组动物移植瘤体积的平均值, 绘制移植瘤生长曲线。
实验结束时在超净工作台上对裸鼠进行拍照，完整剥离肿瘤，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，用电子天平称量移植瘤重量，用手术剪取出肿瘤，拍照。
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・５５４・主堡塑经匡兰苤查至Ｑ！鱼生鱼旦箜！！鲞箜鱼塑堡塾也！盟！坠翌里！鱼：！塑１２Ｑ！亟ｙＱ！：！！：堕Ｑ：鱼・神经胶质瘤・
人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植双荧光模型的建立
于宁李张昱高鑫郭剑锋陈四方朱宏伟叶永造谭国伟３６１００３厦门，厦门大学附属第一医院神经外科通信作者：谭国伟，Ｅｍａｉｌ：ｇｗｔａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—８９２５．２０１６．０６．００３
【摘要】目的建立裸鼠的人脑胶质瘤细胞原位移植双色荧光模型。方法体外培养转染有增强型红色荧光蛋白（ＥＲＦＰ）的人Ｕ８７细胞（ＥＲＦＰ—Ｕ８７），制成细胞悬液后接种于表达增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）Ｉ拘裸小鼠脑部右侧尾状核区域，活体成像系统上动态观察肿瘤的生长，４周后ＨＥ染色移植瘤组织切片，荧光显微镜下观察肿瘤细胞与宿主基质细胞的关系。结果表达ＥＧＦＰ
的裸鼠在活体成像系统下可见全身组织器官均带有绿色荧光。接种ＥＲＦＰ．Ｕ８７细胞后ｌ周于移植部位可见红色荧光，且随时间的增加而增强。ＨＥ染色移植瘤组织显示肿瘤细胞较正常细胞深染，核大，可见分裂相及多核：荧光显微镜下观察可见肿瘤组织与宿主基质分别呈现红、绿色荧光，肿瘤组织与鼠脑组织界限不清，可见肿瘤发生血管，正常内皮细胞形成血管，部分管壁有肿瘤细胞包绕，肿瘤组织中呈现绿色荧光。结论双色荧光胶质瘤动物模型可作为胶质瘤基础研究的理想模型。【关键词】神经胶质瘤；原位移植模型；活体成像；绿色荧光蛋白；红色荧光蛋白基金项目：厦门市科技惠民计划项目（２０１３Ｓ０００１）【中图分类号１Ｒ７３０．２６４【文献标志码】Ａ【文章编号】１６７１—８９２５（２０１６）０６—０５５４—０４
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｄｏｕｂｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｂｙｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｔｏｎｕｄｅｍｉｃｅＹｕＭ够ＬｉＺｈａｎｇｙｕ，ＧａｏＸｉｎ，ＧｕｏＪｉａｎｆｅｎｇ，ＣｈｅｎＳｉｆａｎｇ，Ｚｈｕ
Ｈｏｎｇｗｅｉ，ＹｅＹｏｎｇｚａｏ，ＴａｎＧｕｏｗｅｉ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００３，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅａｕｔｈｏｒ：ＴａｎＧｕｏｗｅｉ，Ｅｍａｉｌ：ｇｗｔａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｄｏｕｂｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆ
ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ
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ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｄｅｅｐｄｙｅｄｗｉｔｈｂｉｇｎｕｃｌｅｕｓ；ｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒｗｅｒｅａｔｄｉｖｉｓｉｏｎｐｈａｓｅ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｈｏｓｔｍａｔｒｉｘｃｅｌｌｓｅｎｊｏｙｅｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｕｎｄａｒｙｂｅｔｗｅｅｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｍｉｃｅｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｎｏｔ
ｃｌｅａｒ，ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｖｅｓｓｅｌｓｃｏｕｌｄｂｅｓｅｅｎ；ｎｏｒｍａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｏｒｍｅｄｔｈｅｖｅｓｓｅｌｓａｎｄｓｏｍｅｔｕｂｅ
ｗａｌｌｓｈａｄｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｎｔｈｅｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓ，ｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｃａｎｂｅｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ
ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｔｈｕｓ，ｔｈｅｙｍａｙ
ｓｅｒｖｅ
ａｓｉｄｅａｌｍｏｄｅｌｓｉｎｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｇｌｉｏｍａｓ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｇｌｉｏｍａ；Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；／ｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇ；Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；
Ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ
Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｌａｎＰｒｏｊｅｃｔｓ
ｏｆＸｉａｍｅｎ（２０１３Ｓ０００１）
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脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的、预后较差的原发性恶性肿瘤，占颅内肿瘤的５０％～６０％，即使给予传统的手术联合放、化疗的综合治疗，低级别胶质瘤患者的平均存活时间仅为３～５年，而高级别胶质瘤为１～２年【”。因此，成熟可靠的动物模型，对研究胶质瘤的发生发展以及有效的治疗，具有十分重要的意义。目前国内外学者已经建立了多种胶质瘤的动物模型［２－４］。其中裸鼠胶质瘤模型是发展较早、技术较成熟、可靠的一种。但是传统的裸鼠胶质瘤模型无论是在研究胶质瘤的发生发展，或者观察药物的治疗作用的过程中，都需要处死荷瘤小鼠，耗费了大量的人力物力。另外，由于裸鼠的个体差异，很难准确地反映肿瘤的生长情况。而一般的磁共振（ＭＲｊ）显像研究也无法将实体瘤中的细胞、间质和血管在活体中显现出来。近年来，随着动物荧光成像技术的发展，动态观察胶质瘤生长情况的设想成为了可能。因此，本研究在培育全身带有增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）的裸鼠的基础上，把转染增强型红色荧光蛋白ｆＥＲＦＰ）的人Ｕ８７细胞原位注射到裸小鼠脑内，建立双荧光的胶质瘤裸鼠模型；并且通过荧光成像技术，动态地观察胶质瘤在活体内的发生发展，并在细胞水平上进一步分析肿瘤细胞与宿主基质细胞间的关系，以期为探讨胶质瘤在体内侵袭性生长的机制研究提供新的思路。材料与方法一、实验细胞和动物表达ＥＲＦＰ的人Ｕ８７胶质瘤细胞（ＥＲＦＰ．Ｕ８７）由厦门大学生命科学学院提供。雄性ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ裸小鼠和雌性Ｃ５７／１７６一ＧＦＰ转基因小鼠均由厦门大学实验动物中心提供，均按照ＳＰＦ级管理。按照文献［５－６］的方法，在雄性ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ裸小鼠和雌性Ｃ５７／１７６．ＧＦＰ转基因小鼠交配后，在其子代中选择表达ＥＧＦＰ的有毛雌鼠和无毛雄鼠继续交配，并且以兄妹交配或回交的近交系模式育种。肿瘤移植实验所用的裸鼠为体质量（２０±２）ｇ、５～６周龄的ＥＧＦＰ裸／Ｊ、鼠。二、主要仪器和试剂裸小鼠头颅立体定向仪（安徽淮北振华公司），自制牙科钻，１０¨Ｌ微量注射器（上海高鸽公司），电子天平（上海精天电子仪器有限公司），生物发光成像系统ｆＬｕｍｉｎａｌｌ型，美国ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ公司），倒置相差显微镜（ＧＸ７１型，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），胎牛血清（德国ＰＡＮ公司），１００ｇ／Ｌ多聚甲醛固定液５Ｌ。三、细胞培养ＥＲＦＰ．Ｕ８７细胞复苏后分装于底面直径为１０ｃｍ的培养皿中，加入适量含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，置于３７ｏＣ、５％ＣＯ：的恒温恒湿培养箱中培养。在细胞处于对数生长期大约８０％时，以２．５∥Ｌ的胰酶消化，收集消化液后离心并除去上清液．以不含血清的ＤＭＥＭ液吹打后以ＤＭＥＭ液制成浓度为１０ｓ个／ｍＬ的细胞悬液。置于碎冰上备用。四、动物模型的制作用１００ｇ／Ｌ的水合氯醛腹腔注射（０．０４ｍＬ／ｌＯｇ）
麻醉小鼠后，将其固定于立体定向头架上，７５％乙醇消毒后．在头顶双侧眼裂连线处横向切开头皮，暴露前囟颅骨标志．前囟中点前１ｎｌｍ、矢状缝旁开２ｍｌＴｌ处用牙科钻钻一骨孔，以１０斗Ｌ的微量注射器抽取细胞悬液５¨Ｌ后固定于立体定向仪，经骨孑Ｌ垂直进针至颅骨下３．７ｍｉ／１．回退２ＩＴＩＩＴＩ，于２０ｍｉｎ内将细胞悬液注射完，注射完毕后留针５ｍｉｎ，缓慢退针，用骨蜡封闭骨孔，１号丝线缝合皮肤切口，观察至麻醉苏醒。五、活体荧光成像动态观察肿瘤的生长情况将移植术后的裸鼠饲养４周，自由饮食。成像时用异氟烷持续吸入麻醉裸鼠。俯卧位放于活体成像仪配备的黑色胶垫上，在ＬｕｍｉｎａｌＩ成像系统下行活体荧光成像。图像以ＩＶＩＳ软件（美国ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ公司）分析，在Ｒａｄｉａｎｃｅ模式下测量荧光强度。连续照射２周，观察瘤体的变化及转移情况。六、大体观察和荧光显微镜观察４周后处死裸鼠，用生理盐水经心脏行器官灌注后断头取脑。观察肿瘤的大体生长情况和转移情况。将瘤组织置于１００ｇ／Ｌ的多聚甲醛固定液中固定２４ｈ后，石蜡包埋、切片，行ＨＥ染色，在显微镜下观察肿瘤的组织病理学特征。置荧光显微镜下观察肿瘤细胞与宿主基质细胞的关系。
结果
一、稳定表达ＥＲＦＰ细胞株的建立ＥＲＦＰ—Ｕ８７细胞生长良好。在荧光显微镜下能够观察到较强且均匀分布的荧光信号，传代培养后ＥＲＦＰ—Ｕ８７细胞的荧光强度并不衰减（图１）。二、ＥＧＦＰ裸鼠的产生和鉴定带有ＥＧＦＰ的裸鼠全身组织器官均带有肉眼可见的绿色荧光．在活体成像系统和荧光显微镜下也可看到绿色荧光。三、活体成像结果