分离纯化新技术亲和层析
第七章 亲和层析
亲和作用与pH、盐浓度等有关，多数仅靠改变这 些条件即可取得理想的效果。 3. 亲和力较强时： ①竞争性洗脱剂（专一性洗脱剂）：用相同的配体或 配体的类似物，能有效地与固定到基质上的配体竞争 目标蛋白，得到尖锐的洗脱峰。 ②蛋白质变性剂：洗脱液中添加盐酸胍、尿素等变性 剂使蛋白质洗脱，但注意需适当处理才能恢复活性。
4.保持基质多孔结的稳定：
耦联配体后，多孔性降低。尤其是聚丙烯酰胺凝胶， 而琼脂糖凝胶的孔稳定性好，所以亲和层析多用琼 脂糖为基质。
5. 样品浓度、pH、离子强度及加样速度等。
五、用途
可用于提纯蛋白质、核酸、激素，分离微 量、不稳定物质最为 理想。 六、不足 配基不易得到，亲和吸附剂制备复杂。
（四）特异性吸附
要求一定的pH和离子强度，以使吸附量最大。
（五）洗脱
先用大量的平衡液洗去无亲和力的杂蛋白，让柱子 上留下专一性吸附的大分子物质，再进行洗脱专一性大 分子物质。 依情况不同，采用不同的洗脱方法： 1. 亲和力较小时，可连续用大体积平衡液洗脱，而后 得到的洗脱峰为大分子物质。
2. 亲和力一般时：需改变缓冲溶液的性质，使复合物 之间的亲和力下降，以便分离。
（二）配体的选择
配体——是具有特异性识别能力的物质。选择时应 根据所分离物质来选。优良的配体应具备的两个条件： ①有较强的亲和性和特异性；②有与载体共价结合的 基团和稳定性 （三）亲和吸附剂的制备： ①基质的活化：通过化学反应使基质上的化学基团处 于活化状态，称为活化。较多的使用CNBr法，能活化 羟基。 ②偶联 ：活化的基质与配体在一定条件下结合形成固 相载体的过程。
（六）层析柱的清洗和再生： 用大量的洗脱液或高浓度的盐彻底洗柱子，再 用平衡缓冲液平衡柱子，即可再使用。 四、提高吸附剂的操作容量的方法： 1. 在配体和基质之间引入“手臂”：对于小 分子的配体，为了减少空间位阻，在基质 与配体之间可插入若干碳原子链称为“手 臂”。 2. 增加配体量。
生物产品分离纯化技术
生物产品分离纯化技术
生物产品分离纯化技术是指将从生物系统中提取或获得的混合物或复杂混合物中的生物分子分离和纯化的一系列技术和方法。
这些技术包括但不限于以下几种：
1.色谱技术：如凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等，可用于分离和纯化蛋白质、核酸、代谢产物等生物大分子。
2.超滤技术：可用于分离和纯化多糖、蛋白质、核酸等小分子。
3.亲和层析技术：利用配对结合剂将特定蛋白质、酶等生物大分子与树脂表面结合，实现富集和纯化。
4.透析技术：如透析膜、透析柱等，可用于分离和富集生物大分子。
5.离心技术：如高速离心机、超高速离心机等，可用于分离和纯化细胞、亚细胞组分等微小生物颗粒。
6.电泳技术：如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转移蛋白电泳等，可用于分离和纯化蛋白质、核酸等生物大分子。
这些技术的选用取决于具体的分离纯化目的和样品特性，以及实验条件和要求。
1/ 1。
亲和层析法
目
录
亲和层析的基本原理
制备方法
操作步骤
亲和层析的应用
亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非
常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门 用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。 相应的配体 底物、抑制剂、辅酶（辅因 子） 所要分离的目的产物 酶
抗体
凝集素 激素
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大
分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合
适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 脱氢酶和激酶 蛋白质 蛋白质 脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
辅酶和磷酸酰苷
过渡金属离子（Cu2+等） 组氨酸 肝素
抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结 合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是 以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 凝集素
5、洗脱
当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时， 可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失 去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否 复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无 亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱， 以备下次使用。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
列举5种分离纯化蛋白质的方法。
一、凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它利用蛋白质的电荷和大小差异，在电场作用下，将蛋白质分离成不同迁移速度的带状物。
常见的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺糖凝胶电泳（PAGE）等。
凝胶电泳具有分离速度快、样品适用范围广、易于操作等特点。
二、离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography）：离子交换层析是根据蛋白质表面带电性的差异来分离纯化蛋白质的方法。
通过将样品加入装有离子交换树脂的层析柱中，通过控制洗脱缓冲液的离子浓度和pH，实现带正电荷或负电荷的蛋白质与树脂之间的相互作用，从而实现分离纯化。
三、亲和层析法（Affinity Chromatography）：亲和层析是利用蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来分离纯化蛋白质的方法。
常见的亲和层析方法包括亲和纸层析、亲和树脂层析等。
该方法具有选择性强、纯化效果好的优点，广泛应用于蛋白质纯化领域。
四、凝胶渗透层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶渗透层析也被称为分子筛层析，是一种以分子大小差异作为分离依据的方法。
通过在层析柱中加入一种孔隙较小的凝胶，利用蛋白质分子大小的差异，在经过柱体后，较小的蛋白质分子进入凝胶孔隙中，分离出来，而较大的蛋白质则能够直接流出。
五、逆流层析法（Reverse Phase Chromatography）：逆流层析是基于蛋白质与固定相之间的亲疏水性相互作用进行纯化的方法。
固定相常为亲疏水性的碳链，样品在不同的流动相条件下，通过调节流动相的成分和性质，来实现对蛋白质的分离纯化。
此外，还有疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography）、互补杂交法（Complementary Hybridization）等方法。
生物发酵工程中分离和纯化的技术
生物发酵工程中分离和纯化的技术生物发酵工程是指利用微生物、细胞及其代谢产物进行某些化学过程的工程学科。
在生物发酵工程中，分离和纯化技术是至关重要的步骤，通过这些技术可以分离出所需的微生物、细胞或产物，并对其进行纯化和结构分析，以实现其在工业上的广泛应用。
一、分离技术生物发酵过程中，细胞或微生物的生长和代谢过程会产生大量的代谢产物，其中包括目标产物和非目标产物。
在分离技术中，目标产物的选择和富集是至关重要的。
常用的分离技术包括离心、过滤、超滤和萃取等。
离心是利用离心力将混合物中不同密度的组分分开的一种分离技术。
在生物发酵工程中，利用离心技术可以将微生物和细胞分离出来，以进行后续的培养和富集。
此外，离心技术还可以用于大分子物质的分离和纯化，如蛋白质、DNA等。
过滤是将混合物通过不同的过滤器进行分离的一种分离技术。
根据过滤器的孔径大小不同，可以将不同大小的分子筛选出来。
在生物发酵工程中，利用过滤技术可以将微生物和其代谢产物从培养基中分离出来，达到富集目的。
超滤是利用膜过滤的方式进行分离的一种技术。
在超滤过程中，通过选择合适的膜孔径和压力，可以将不同分子量的目标产物分离出来，并进行纯化。
超滤技术在生物发酵工程中的应用非常广泛，可以富集蛋白质、酶、激素等大分子物质。
萃取是利用溶剂的不同亲水性或亲油性，将混合物中的目标组分分离出来的一种技术。
在生物发酵工程中，萃取技术可以用于分离微生物培养液中的小分子化合物和产物。
二、纯化技术在生物发酵工程中，分离是实现目标产物富集的重要手段，但是分离出来的产物并不一定是纯品。
通过纯化技术，可以将目标产物从杂质中进一步纯化和提纯，以达到最终的纯度要求。
常用的纯化技术包括电泳、层析、析出和结晶等。
电泳是将混合物中的分子在电场的作用下按照大小和电性进行分离的一种技术。
在生物发酵工程中，电泳技术可以用于蛋白质、核酸和酶等大分子物质的纯化。
层析是利用分离材料将混合物中的组分分离的一种技术。
亲和层析技术
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
操作流程
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响； 4 ．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。
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亲和层析的原理
层析分离过程： 样品过柱时， 样品中对配体有亲和力的物质 S就可借助静电引力、 范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载 体上; 无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出 来，并形成了第一个层析峰； 然后，恰当地改变起始缓冲液的 pH 值、或增加离子强 度、 或加入抑制剂等因子，
即可把物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
亲和层析流穿峰的意义
亲和层析流穿峰的意义一、前言亲和层析流穿峰（Affinity chromatography peak elution）是分离纯化生物大分子的一种方法，常用于分离蛋白质。
本文将详细介绍亲和层析流穿峰的意义。
二、亲和层析流穿峰的基本原理1. 亲和层析亲和层析是利用生物大分子与其特异性配体之间的特异性相互作用，使目标生物大分子在混合物中被选择性地结合到固定在某种固相材料上的配体上，然后再通过洗脱等方法将结合的目标生物大分子从固相材料上分离出来。
2. 流穿峰流穿峰是指通过改变洗脱缓冲液pH值或浓度等因素，使得不同组分在不同时间从柱床中洗脱出来。
这种方法可以有效地将杂质去除并且保证目标组分纯度高。
3. 亲和层析流穿峰亲和层析流穿峰是将亲和层析与流穿峰相结合的一种方法。
它可以根据不同生物大分子之间的特异性相互作用，选择性地从混合物中提取出目标生物大分子，并且通过流穿峰的方法将目标生物大分子纯化出来。
三、亲和层析流穿峰的意义1. 提高纯度亲和层析流穿峰可以根据不同生物大分子之间的特异性相互作用，选择性地从混合物中提取出目标生物大分子。
这种方法可以有效地去除杂质，提高目标组分的纯度。
2. 节省时间和成本与其他纯化方法相比，亲和层析流穿峰具有操作简便、高效快速、自动化程度高等优点。
因此，它可以节省时间和成本，并且可以在较短的时间内得到高质量的目标组分。
3. 适用范围广亲和层析流穿峰可以根据不同生物大分子之间的特异性相互作用进行选择性纯化。
因此，它适用于各种类型的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
4. 可以与其他技术相结合亲和层析流穿峰可以与其他技术相结合使用。
例如，在蛋白质纯化中，可以将亲和层析与凝胶过滤、离子交换层析等技术相结合，以达到更好的分离纯化效果。
四、亲和层析流穿峰的应用亲和层析流穿峰广泛应用于生物医学领域。
例如，在药物研发中，可以使用亲和层析流穿峰来纯化药物靶点蛋白质；在生物制药领域，可以使用亲和层析流穿峰来纯化重组蛋白质等。
亲和层析
葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号:G-100,150,200 型号含义:每克干凝胶吸水量X10 特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小
四、配基的选择
应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团
以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物 物质的亲和性:
2.豌豆素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照 生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收 集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置 37℃保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔 轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结 果。
亲 和 层 析 Affinity Chromatography
一、概述
亲和层析：是利用生物大分子之间有 专一的亲和力而达到分离纯化的层析 方法
优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
二、基本原理 生物专一吸附
(bioselective adsorption )
1.具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
2.基本过程： 固相化 (Immobilise)
配基Ligand:亲和层析中能被某一生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基 共价结合,使其固相化的物质。
五、配基的固相化
固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂
过程：活化、接臂
"插入剂"或"手臂"使小分子配基适当的离开载 体骨架,克服载体空间位阻的影响
第五节 亲和层析
2、基质的活化
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白
亲和层析纯化蛋白是一种广泛被应用于蛋白纯化的技术，在这种技术中，通过利用靶蛋白与某一亲和剂相互结合的特异性，达到将蛋白从混合
物中分离出来的目的。
具体流程如下：
1.选择适当的亲和剂：根据目标蛋白表面的属性，选择合适的亲和剂，例如特定抗体、金属离子（例如Ni2+）、亲和配体等。
2.制备亲和树脂：将亲和剂固定在树脂上，以制备亲和树脂。
3.样品制备：将含有目标蛋白的混合物制备好，例如细胞裂解物、过
滤液等。
4.样品沉积：将样品与亲和树脂混合，使亲和树脂中的亲和剂与目标
蛋白结合。
5.洗脱：将非特异性结合物和杂质用缓冲液进行洗脱。
6.蛋白洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH、离子浓度等，使
目标蛋白与亲和剂解离。
7.蛋白纯化：收集目标蛋白溶液，以得到纯化的蛋白。
需要注意的是，在亲和层析过程中，亲和剂选择、树脂选择以及缓冲
液的配比等，均会对纯化效果产生影响。
因此，需要根据各种参数进行优化，以得到更好的纯化效果。
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分离纯化新技术亲和层析陈 涛 刘 耘 潘进权(华南理工大学食品与生物工程学院 广州 510641)
摘 要 本文介绍了亲和层析的一般问题,综述了固定化金属亲和层析、免疫亲和层析和其它一些类型的亲和层析的原理和应用。关键词 亲和层析;原理;应用
Anewtechnologyofisolationandpurification:affinitychromatography
ChenTao,LiuYun,PanJinquan(collegeoffood&biologicalengineering,Southchinauniversityoftechnology,Guangzhou,510640)
Abstract
Thispaperintroducethesimpleprincinpleofaffinitychromatography.SummarizethemechanismandapplicationofImmobilized
MetalLonAffinityChromatography(IMAC),Immuno-affinityChromatographyandotherkindsaffinitychromatographty.Keywords
affinitychromatography;mechanism;application
亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。近几十年来,亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说,亲相层析枝术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最重要的方法之一。1 亲和层析的一般问题1.1 配基的选择将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶性载体相偶联制成亲和吸附剂,这样一对生物分子中,被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中,究竟选择哪一种物质作配基,要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质,选择与其收稿日期:2003-01-14专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白,选择相应的激素做配基,纯化核酸可以根据核酸与蛋白质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、DNA和RNA之间杂合作用的关系选择合适的配基。1.2 载体的选择将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(孔内)
即可制备亲和吸附介质,该固体粒子通常称为配基的载体。因此,亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求:(1)
具有亲水性多孔结
构,无非特异性吸附,比表面积大;(2)
物理和化学稳
定性高,有较高的机械强度,使用寿命长;(3)含有可活化的反应基团,用于亲和配基的固定化;(4)粒径均
一的球行粒子。[1]常用的亲和层析载体有:琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶(ACA)、纤维素、多孔玻璃
等。其它用于载体的物质还有:聚苯乙烯[2]、淀粉珠[3]、魔芋葡甘聚糖[4]、壳聚糖[5]、硅胶[6]等。1.3 洗脱问题洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法,通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低,以至解开生物高分子和亲和吸89
《广州食品工业科技》 GuangzhouFoodScienceandTechnology Vol.19No.2(总75)附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不强,当连续通过大体积的平衡缓冲液时,便可在紧随杂蛋白洗出峰后,得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子,必须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法,利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂,通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合,脱附目标产物。另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点,当吸附生物大分子以后,可以用还原剂断裂重氮键或用羟胺断裂硫脂键,从而得到生物大分子和配基的络合物,然后将络合物解离,再分出欲纯化的生物大分子。2 固定化金属离子亲和层析2.1 基本原理组氨酸的咪唑基团,半胱氨酸巯基,色氨酸的吲哚基团可提供电子,与金属离子结合。当这些氨基酸残基与金属离子结合后,含这些残基的蛋白质在亲和层析柱中受到阻滞。用螯合剂将金属离子固定在固体表面会减少蛋白质-金属相互反应的自由度,蛋白质也因此不容易失活,在后继的分离纯化过程中仍然保持较高活性。2.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+)缓冲液中,直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体,通常是多聚物(如交联化的琼脂糖,葡聚糖),配位体(亚氨基二乙酸,IDA)共价连接.当在缓冲液中浸泡平衡后,经洗涤,可将含有生物活性物质的样品上柱,与固定化金属-配基有亲和力的分子都将被滞留,其余则流出柱外。2.3 固定化金属离子亲和层析的优点和传统的亲和层析相比,固定化金属离子亲和层析具有以下优点:(1)配基稳定性高,不易脱落;(2)金属离子配基价格低廉,再生成本低;(3)可在高盐浓度下操作,从而省去了脱盐的预处理步骤,而且可以减少非特异性吸附;(4)蛋白质洗脱比较容易,采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑或EDTA便可将吸附蛋白解吸下来。由于IMAC的这些优点,已广泛用于酶和干扰素的分离纯化中。[7]2.4 应用举例YiLi[8]等研究了一种利用金属螯合亲和层析使绿色荧光蛋白质(GFP)复性的方法。研究中发现,GFP对Cu2+和Ni2+有较强的亲和能力,而与Zn2+、Co2+结合能力较差。研究结果表明,在Ni(Ⅱ)-IMAC系统中,流动相中NaCl的浓度变化能引起GFP纯度和产量的较大变化,在高浓度NaCl条件下分离效果较好。王雪蜂、陈美[5]等从虾壳制备所得壳聚糖为基质合成金属螯合亲和吸附剂,用于纯化猪血铜锌超氧化物歧化酶(Cu・Zn-SOD),得到比活为4756U・mg-1的酶蛋白,收率为67%,纯化倍数为61。聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色定位表明,经螯合层析纯化后的酶纯度基本均一。LinaGelunaite[9]等用亚氨基双乙酰酯琼脂糖凝胶螯合Hg离子制成亲和层析柱,通过改变洗脱系统的组成来研究该系统对蛋白质的亲和能力。用此柱分离混有菠萝蛋白酶的重组人体粒细胞克隆刺激因子,效果良好。LarryRiggs[10]等设计了一种利用多级层析分离蛋白质的方案。其中所用的亲和层析柱为Ca(Ⅲ)-IMAC系统。利用磷酸化肽与Ca
(Ⅲ)的亲和能力,研究人员用该柱选择性的结合被胰蛋白酶消化的牛奶中的磷酸化肽,效果良好。
3 免疫亲和层析抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上,便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。3.1 抗体的纯化抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要,所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得。尽管直接使用上述未纯化的抗体溶液也可进行一些免疫学实验,但要获得满意的结果最好使用纯化的抗体,特别是亲和层析所用的抗体。利用细菌胞壁蛋白的特性提供了一个快速、简捷、高效的抗体纯化方法。这里细菌胞壁蛋白主要是指蛋白A和蛋白G,它们分别从金黄色化脓性葡萄球菌和G组链球菌分离纯化。它们能特异结合到免疫球蛋白的Fc部分(Y字IgG分子的主干部分)。因为两种蛋白对不同的免疫球蛋白的亲和力不同,所以应根据免疫球蛋白的种类选择蛋白A或蛋白G。天然的蛋白A或蛋白G具有白蛋白结合部位,使用时会导致白蛋白的污染,市售的已除去白蛋白结合部位的工程产品避免了上述缺陷。蛋白A不与抗体(IgG)的抗原结合部位结合,而且任何抗体的Fc片段都非常类似,因此蛋白A可以作为各种抗体的配基,但与不同抗体的结合常数有所不同,此外,蛋白A与抗体结合99
《广州食品工业科技》 GuangzhouFoodScienceandTechnology Vol.19No.2(总75)并不影响抗体与抗原的结合能力,因此蛋白A也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。Walker[11]等和Coligan[12]等介绍了使用抗抗体免疫亲和柱,它由抗目的抗体Fc片段的特异抗体组成。其纯化效果与蛋白A或蛋白G一样好。值得注意的是在纯化过程中要检测抗体的活性,以便确定目的抗体是否仍保留其活性。3.2 抗原的纯化在蛋白质纯化中用抗体亲和纯化抗原是非常有效的方法。一般纯化倍数可达到1000～10000。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明,并且经过洗脱的目的蛋白没有受到可逆的损伤,那么抗体亲和纯化将是理想的蛋白质纯化方法。制备免疫亲和柱一种方法是抗体首先结合到介质上。另一方法[13]是将抗体结合到蛋白A或蛋白G小珠上,再用交联剂固相化。后一方法由于蛋白A或蛋白G结合在抗体的Fc区,所以结合抗原的部位获得充分暴露,从而易于接近。亲和柱制备完成后,抗原溶液即可上样,接着洗去污染物,然后洗脱抗原,如果不能利用特异的配基破坏抗原抗体间的相互作用来洗脱,只能采用非特异性洗脱。但非特异性洗脱一定要小心,以免目的蛋白失活。抗体亲和纯化的质量很大程度上取决于抗体溶液的纯度,制备亲和柱的抗体既要良好的特异性和活性,又要尽可能的纯。抗体亲和柱的制备是相当昂贵的,其结合容量却相对较低。因此为了节省和提高效率,经常制备的是小而粗的柱子,同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样,以便纯化更多的抗原蛋白。此外,较小的柱子也可以减少和限制柱污染和抗体丢失。赵益明、何杨[14]等用单克隆抗体亲和层析从人血小板破碎液中纯化血小板第4因子(PF4)。将单克隆抗体SZ-95-LgG与溴化氰活化的Sepharose4B凝胶连接成亲和层析柱SZ-95-LgG-Sepharose4B,人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后,经洗脱获得PF4,采用15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度,用点印迹鉴定其免疫活性。结果表明,SZ-95-Sepharose4B亲和层析柱的偶联率为72%,每1ml血小板破碎液中可以纯化到PF418ug,其相对分子量约为12kD,经点印迹显示与单抗SZ-95反应显带。该层析柱纯化PF4效果较好。4 其它类型亲和层析以普通凝胶、多孔玻璃珠等物质作为载体,直接与亲和配基相偶联,用来分离纯化与亲和吸附介质具较强亲和力的酶,结合蛋白,激素,基因表达产物等物质,不需要利用金属离子或抗体抗原性质,这样的亲和层析种类繁多、应用广泛,已取得不少进展。4.1 染料亲和层析一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的结构,因此一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶,对这些染料有一定的亲和力,如果这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上,就能制得染料亲和层析柱。亲和染料层析已经成功的分离纯化了许多酶,如分离纯化需以NAD+、NADP+、ATP为辅酶的酶类及激酶、水解酶、转移酶、