“江苏省生物农药产业技术创新战略联盟”筹备会南京召开
2022-2023学年江苏省南通市如皋市高一下学期3月月考化学(必修)试题
2022-2023学年江苏省南通市如皋市高一下学期3月月考化学（必修）试题1.我国提出二氧化碳排放力争于2030年前达到峰值。
下列措施、行为有利于减少二氧化碳排放的是A．大力发展火力发电B．出行使用燃油汽车C．大力发展钢铁工业D．研发二氧化碳转化工艺2.为保护空气质量，需抑制污染空气气体的排放。
下列气体大量排放到空气中会导致酸雨形成的是A．B．C．D．3.氮是各种生物体生命活动不可缺少的重要元素，氮的循环为生物体提供氮元素。
下列过程属于氮的固定的是A．工业利用氮气和氢气合成氨气B．氨气和硫酸反应制取铵态氮肥C．氨基酸合成人体所需的蛋白质D．硝酸盐在细菌作用下生成氮气4.突破纯碱制造技术，发明连续生产纯碱与氯化铵的联合制碱新工艺的中国化学家是A．钱学森B．侯德榜C．屠呦呦D．袁隆平5.俗名往往反映了物质的组成、性质或用途。
下列对物质俗名的理解不正确．．．的是A．烧碱：NaOH具有可燃性B．食盐：NaCl可用作食品调味剂C．铁红：Fe 2 O 3可用作红色颜料D．水银：常温下银白色的汞为液态6.于谦的《石灰吟》，赞颂了石灰石(碳酸钙)“粉骨碎身浑不怕，要留清白在人间”的品格。
石灰(CaO)可用于治病在我国早已有之。
《本草经注》中记载有“今近山生石，青白色，作灶烧竟，以水沃之，即热蒸而解末矣”，该记载描述了碳酸钙煅烧成石灰，石灰再遇水时的现象。
碳酸钙属于A．单质B．氧化物C．酸D．盐7.于谦的《石灰吟》，赞颂了石灰石(碳酸钙)“粉骨碎身浑不怕，要留清白在人间”的品格。
石灰(CaO)可用于治病在我国早已有之。
《本草经注》中记载有“今近山生石，青白色，作灶烧竟，以水沃之，即热蒸而解末矣”，该记载描述了碳酸钙煅烧成石灰，石灰再遇水时的现象。
石灰石煅烧成石灰的反应属于A．化合反应B．分解反应C．置换反应D．复分解反应8.于谦的《石灰吟》，赞颂了石灰石(碳酸钙)“粉骨碎身浑不怕，要留清白在人间”的品格。
石灰(CaO)可用于治病在我国早已有之。
精品解析：江苏省苏州市2021年初中结业考试生物试题(解析版)
2021年苏州市初中结业考试生物一、单项选择题（每小题给出的四个选项中，仅有一个选项最符合题意。
每小题选对者得2分，共70分）1. 在制作人口腔上皮细胞临时装片时，应先在载玻片中央滴加的液体是（）A. 蒸馏水B. 自来水C. 生理盐水D. 澄清石灰水【答案】C【解析】【分析】制作植物细胞和动物细胞的临时装片，在载玻片上滴加的液体是不同的，但目的都会为了维持细胞的正常形态。
【详解】实验步骤包括：擦、滴、刮、涂、盖、染。
在制作人的口腔上皮细胞临时装片时，由于人的细胞液的浓度与生理盐水的浓度一致，为了维持细胞的正常形态，不至于因吸水而膨胀，或失水而皱缩，应向载玻片上滴生理盐水。
故选C。
【点睛】回答此题的关键是明确口腔上皮临时装片的制作过程。
2. 某同学利用显微镜观察洋葱表皮细胞、蚕豆叶上的保卫细胞、人口腔上皮细胞时，发现某结构仅在蚕豆叶保卫细胞中出现。
此结构是（）A. 细胞壁B. 细胞膜C. 液泡D. 叶绿体【答案】D【解析】【分析】植物细胞和动物细胞的相同点和不同点：【详解】洋葱表皮细胞基本结构：细胞膜、细胞质、细胞核、细胞壁、液泡、线粒体；人口腔上皮细胞的基本结构：细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体；蚕豆叶上的保卫细胞基本结构：细胞膜、细胞质、细胞核、细胞壁、液泡、叶绿体、线粒体。
因此，某同学利用显微镜观察洋葱表皮细胞、蚕豆叶上的保卫细胞、人口腔上皮细胞时，发现某结构仅在蚕豆叶保卫细胞中出现。
此结构是叶绿体。
故选D。
【点睛】解答此类题目的关键是理解掌握动植物细胞的异同点。
3. 再生障碍性贫血可通过移植健康人的骨髓进行治疗，原因是健康人骨髓中的造血干细胞能通过如下图所示过程产生正常血细胞。
这一过程称为（）A. 细胞分裂B. 细胞分化C. 细胞生长D. 细胞癌变【答案】B【解析】【分析】由我们所学的知识可以知道：细胞由一个变成2个，称为细胞的分裂；细胞在分裂的过程中出现了一些形态、结构上的变化，形成组织，为细胞的分化，据此答题。
2024年枣庄事业单位真题
2024年枣庄市事业单位工作人员招聘考试试题（满分100分时间120分钟）【说明】1.遵守考场纪律，杜绝违纪行为，确保考试公正；2.请严格按照规定在试卷上填写自己的姓名、准考证编号；3.监考人员宣布考试开始后方可答题；4.监考人员宣布考试结束时，请将试题、答题纸和草稿纸放在桌上，待监考人员收取并清点完毕后方可离开考场。
第一部分常识判断1.2023年4月15日，世界最大跨度悬索桥——江苏（）关键控制性工程，南航道桥南主塔桩基施工完成，标志着这座拥有六个“世界之最”、六项“世界首创”的大桥索塔施工进入新阶段。
A.南京长江大桥B.润杨长江公路大桥C.苏通长江公路大桥D.张靖皋长江大桥【答案】：D2.2023年6月1日，（）正式实行，该条例是全国首部涵盖网络安全、数据安全、个人信息保护全领域专门的地方性网络安全立法。
A.《河南省网络安全条例》B.《山西省网络安全条例》C.《吉林省网络安全条例》D.《贵州省网络安全条例》【答案】：A3.截至目前，我国累计建成开通5G基站超230万个，2023年将启动（）建设，全面推进6G 技术研发。
1/ 21A.“宽带远疆”B.“宽带入户”C.“信号边疆”D.“宽带边疆”【答案】：D4.甲大学毕业有3个岗位选择，在某企业工作每月4000元，在银行工作每月5000元，在事务所工作每月6000元，若甲选择了事务所工作，则该选择的机会成本是（）。
A.4000元B.9000元C.6000元D.5000元【答案】：D5.《××镇人民政府转发××县人民政府关于加强夏粮入库管理工作的通知》，该标题（）。
A.错误，标题缺少本身的文种“通知”B.错误，应该使用通知类中的批转性通知C.正确，下级机关转发上级机关文件，应该使用通知类中的转发性通知D.错误，“××县人民政府关于加强夏粮入库管理工作的通知”应当加书名号【答案】：C6.公文标题中不能使用的标点符号是（）A.引号B.逗号C.破折号D.顿号【答案】：B7.食品与食具共同组成完美的形象而给人带来美感。
2023年江苏南京中考生物押题预测卷
2023年江苏南京中考生物押题预测卷生物·全解全析1．吃话梅时分泌许多唾液体现了生物具有应激性。
( )【答案】正确【详解】生物的共同特征有：①生物的生活需要营养；②生物能进行呼吸；③生物能排出身体内产生的废物；④生物能对外界刺激作出反应；⑤生物能生长和繁殖；⑥生物都有遗传和变异的特性；⑦除病毒以外，生物都是由细胞构成的。
我们吃话梅时，会分泌许多唾液，这体现了生物能对外界刺激作出反应的特征，即应激性。
故题干叙述正确。
2．"人间四月芳菲尽，山寺桃花始盛开"，是由于温度差异引起的现象。
( )【答案】对【分析】环境中影响生物生活的环境因素分为非生物因素和生物因素。
非生物因素包括光、温度、水、空气、土壤等。
【详解】"人间四月芳菲尽，山寺桃花始盛开"，表明环境影响生物的生长开花等，海拔每升高1千米气温下降60C左右，因此山上的温度比山下低，山上的桃花比山下的开的晚，才有了“人间四月芳菲尽，山寺桃花始盛开”的自然现象，造成这一差异的环境因素是温度。
因此题干的说法是正确的。
【点睛】考查环境对生物的影响。
3．在细胞分裂的不同时期，形态结构变化最明显的是细胞核。
( )【答案】错误【分析】细胞分裂就是一个细胞分成两个细胞的过程，细胞分裂使细胞数目增多。
【详解】在细胞分裂过程中，细胞核中的染色体的变化最明显：在细胞分裂时，首先染色体会进行复制加倍，随着分裂的进行，染色体分成形态和数目完全相同的两份，分别进入两个新细胞中。
因此，新细胞与原细胞的染色体形态和数目相同。
题干说法错误。
【点睛】解答此类题目的关键是理解掌握细胞分裂过程中染色体的变化。
4．绿色植物只进行光合作用，不进行呼吸作用。
( )【答案】错误【详解】光合作用必须在光下才能进行，呼吸作用有光无光都能进行。
所以白天有光，植物能进行光合作用、呼吸作用，而在夜晚无光，植物不能进行光合作用，能进行呼吸作用。
故题干叙述错误。
江苏省苏锡常镇四市2024年高三教学情况调研(一)生物
苏锡常镇四市．．．．．．2024．．．．年高三教学状况调研（一）．．．．．．．．．．．．生物试题．．．．第．I ．卷（选择题．．．．． 55．．分）．．一、单项选择题：本部分包括．．．．．．．．．．．．．20．．题，每题．．．．2．分，共计．．．．40．．分。
每题只有一个选项最符合题意。
．．．．．．．．．．．．．．．．1.．．下列关于生物科学探讨方法运用的叙述中，错误的是．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A.．．沃森和克里克用模型建构的方法发觉了．．．．．．．．．．．．．．．．．DNA ．．．的双螺旋结构．．．．．．B.．．摩尔根用类比推理的方法证明基因位于染色体上．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C.．．鲁宾和卡门用同位素标记法发觉光合作用释放的氧气来自于水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．D.．．孟德尔用假说演绎法得出了基因的分别和自由组合定律．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2.．．某爱好小组采纳．．．．．．．两种途径处理鸡蛋清溶液，过程如下图所示。
有关叙述正确的是．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A.．．①、②所依据的原理不同，过程②破坏了蛋白质的空间结构和肽键．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．B.．．③、④所依据的原理不同，过程③破坏了蛋白质的空间结构和肽键．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C.．．在溶解后产生的溶液中分别加入双缩脲试剂，都会变成紫色．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．D.．．过程②产生的蛋白块也可用③的方法进行溶解．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3.．．下列有关细胞分化苍老、凋亡及坏死的叙述中，错误的是．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A.．．细胞分化意味着不同细胞内蛋白质的种类和含量有所不同．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．B.．．细胞苍老会出现线粒体削减、部分酶活性降低的现象．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C.．．被病原体侵染的细胞在免疫系统的作用下死亡属于细胞坏．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．死．D.．．细胞苍老与动物个体的苍老一般不完全同步．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4.．．将紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞侵入低浓度的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．KNO ．．．3．溶液中，显微镜视察发觉细胞吸水膨胀。
化工项目试生产方案
江苏凯晨化工有限公司3000t/a2-巯基-6-氯苯并恶唑、500t/a (E)-2-[2-(6-氯嘧啶-4-基氧基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯及农药制剂建设项目试生产（使用）方案备案资料江苏凯晨化工有限公司二〇一六年六月二十日编制人员一览表承诺书江苏凯晨化工有限公司3000t/a2-巯基-6-氯苯并恶唑和500t/a(E)-2-[2-(6-氯嘧啶-4-基氧基)苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯及3500吨/年悬浮剂、400吨/年乳油、2800吨/年水分散粒剂农药制剂项目试生产（使用）备案提交的施工单位资质证书、安全设施的设计、施工、监理单位认可表、安全设施和特种设备的检测检验情况、专家组对安全技术规程、安全操作规程和试生产方案进行安全论证意见、参加试生产人员的培训情况及特殊工种持证情况等申请材料均为真实有效资料。
特此承诺!江苏凯晨化工有限公司 2016年6月20日目录第一部分试生产（使用）方案1.1 建设单位概况江苏凯晨化工有限公司是以生产农药原药、农药（医药）中间体及农药制剂为主，集研发、生产、销售为一体的生产经营企业。
公司位于淮安盐化新材料产业园区李湾路8号，李湾路北侧，电厂路西侧，占地约120亩，注册资本4000万元。
江苏凯晨化工有限公司由淮安市天晨化工厂、南京联科化学有限公司和江阴联海生物化学有限公司合资组建，由天晨化工控股的股份制公司，公司实行董事会领导下的总经理负责制。
淮安市天晨化工厂是一家2003年成立的民营化工企业，位于清浦区清安村，主要从事农药、医药中间体生产，现有职工110余人，其中工程技术人员30余人，2009年实现销售收入6000多万元。
公司自建厂以来，坚持高起点、高标准的管理理念，先后引进多名高级管理人才来提升企业的生产管理水平。
公示各项管理工作已走在清浦区私营化工生产企业的前列，并连续四年获得清浦区安全生产先进企业和2008年安全质量标准化示范企业等荣誉称号。
南京联科化学有限公司为南京市高科技企业，公司主要从事新型农药中间体，特别是含氟农药中间体的研发生产工作。
2014年5月8日甲氧虫螨腈课件解读
注意事项
• 当气温高、田间蒸发量大时，应选在上午10点之前，
下午4点以后用药。 • 使用的时候，一定要二次稀释。
• 喷雾均匀，喷头从下往上喷
• 若虫龄较大，适当的多喷水，并加大用药量。
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温馨提示 • 在使用任何农药时请注意安全防护 • 夏季高温/孕妇注意避免直接接触农药 • 任何时候不要购买低劣、假冒产品
目前国内新型杀虫剂的市场情况
当前国内主要新型成分杀虫剂 专利已到期国内登记情况：虱螨脲
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当前国内主要新型成分杀虫剂 专利已到期国内登记情况：甲氧虫酰肼
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产品特点-与主要产品的综合特性比较
产品 作用机制 内吸性 作用速度 持效期 抗性风险 抗性现状 发展趋势 高龄幼虫防效 适用时间 耐雨水冲刷 本品 透叶传导强 ★★★★ ★★★★ ★ ★ ★ ★★★ 优秀 阿维菌素 无 ★★ ★★ ★★★★ ★★★★ ★★★★ ★ 甲维盐 透叶传导强 ★★★ ★★ ★★★ ★★ ★★★★ ★ 优秀 多杀霉素 无 ★★ ★★ ★★ ★★ ★★★ ★★ 一般 ★★ ★★★ ★★★ ★★★★ 氟虫腈 具内吸性 ★★★★ 茚虫威 一般 ★★★★ ★★ ★★★ ★★ ★★★ ★★★ 幼虫 较好 虫酰肼 胃毒 较差 ★ ★★★ ★ ★ ★ ★★ 幼虫 触杀、胃毒 触杀、胃毒 胃毒( 触杀) 触杀、胃毒 触杀、胃毒 触杀、胃毒
精品解析：2021届江苏省南京市、盐城市高三二模生物试题(解析版)
应选D。
5.以下有关“探索DNA是遗传物质的实验〞的表达，正确的选项是〔 〕
A.肺炎双球菌体内转化实验中，R型菌转化为S型菌是基因突变的结果
应选C。
9.以下图是人体生命活动的调节模式图，其中甲～丁表示不同的分泌细胞，①~④表示不同的靶细胞。以下表达错误的选项是〔〕
A.图中分泌细胞中最可能是下丘脑细胞的为丁细胞
B.假设③接收的信息分子可促进肝糖原水解，那么丙可能为胰岛A细胞
C.假设乙细胞分泌的是性激素，那么它的受体位于靶细胞②的细胞膜上
D.假设甲细胞分泌的激素含碘元素，那么①②③④都有可能是其靶细胞
D、核膜是双层膜，包含四层磷脂分子层，心房颤抖的致病机制是核孔复合体的运输障碍，所以它的成因与核膜内外的信息交流异常有关，D正确。
应选C。
3.以下图表示葡萄糖在细胞内氧化分解过程的示意图，①②③表示过程，X、Y表示物质。以下表达错误的选项是〔〕
A. ①过程发生在细胞质基质，X可为丙酮酸
B ②过程可能没有ATP产生
D.Ⅰ3个体可能同时携带有甲乙两种遗传病的致病基因
பைடு நூலகம்【答案】C
【解析】
【分析】
分析遗传系谱图：Ⅱ5和Ⅱ6都正常，但他们有一个患病甲病的女儿，即“无中生有为隐性，隐性看女病，女病男正非伴性〞，说明甲病为常染色体隐性遗传病；又因为其中一种为红绿色盲遗传病，那么乙病为红绿色盲，即伴X染色体隐性遗传病。
【详解】A、由以上分析可知，甲病为常染色体隐性遗传病，乙病为红绿色盲，A正确；
2023届江苏省南京市六校联合体高三8月联合调研考试生物
六校联合体2023届高三8月联合调研试题高三生物学本试卷共100分，考试时间75分钟一、单项选择题：共14题，每题2分，共28分。
每题只有一个选项最符合题意。
1.下列有关真核细胞结构和功能的叙述，不正确的是A.溶酶体内合成的水解酶能够分解衰老、损伤的细胞器2.如图所示，载体蛋白1和载体蛋白2依赖于细胞膜两侧的Na＋浓度差完成相应物质的逆浓度梯度运输。
下列叙述正确的是H12O6吸收方式属于协助扩散6C.图中钠钾泵只具有转运物质的功能，不具有催化功能D.图中上面是胞外，下面是胞内，胞外pH低于胞内pH“螺旋桨状”三聚体，能直接响应细胞膜上的机械力刺激并介导阳离子进入细胞。
如图为Piezo的结构模式图及可能的作用机理基本示意图。
下列相关叙述错误的是A．触觉受体Piezo在触觉发生中属于感受器B．Piezo蛋白是一种跨膜蛋白，一定含有元素C、H、O、NC．Piezo蛋白在核糖体上合成，不需要内质网和高尔基体的加工D．机械力刺激导致Piezo蛋白构象改变、中央孔打开，离子内流4.下列关于生物科学研究方法和相关实验的叙述中，错误的是A.差速离心法：证明DNA半保留复制方式的实验B.同位素标记法：分泌蛋白合成和分泌的过程C.模型构建法：研究酵母菌种群数量变化规律实验D.对比实验法：探究酶的高效性实验5.高中生物实验中用到了不同体积分数的酒精，下列说法正确的是A.微生物的实验室培养实验中，用50%酒精给实验者的双手消毒B.观察花生细胞中的脂肪颗粒，需要用70%的酒精洗去浮色C.DNA粗提取实验中，用95%冷酒精进一步提纯DNA，DNA溶解于95%冷酒精D.绿叶中色素的提取和分离实验中，可用无水乙醇作为提取液真核细胞DNA复制的电镜照片，其中泡状结构为复制泡，是DNA上正在复制的部分。
滚环复制为某些环状DNA分子的一种复制方式，新合成的链可沿环状模板链滚动而延伸，其过程如图2所示。
下列相关叙述不正确的是图1 图2A.每个复制泡中含有2条DNA母链和2条子链B.每个复制泡中一条子链是完全连续的，另一条子链是不连续的′-OH端开始以该链为引物向前延伸7.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。
CRISPR
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(４):１０３６￣１０４２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ赵为民ꎬ戴超辉ꎬ陈㊀哲ꎬ等.ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(４):１０３６￣１０４２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０４.０１３ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因赵为民１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀戴超辉１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀陈㊀哲１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀涂㊀枫１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀李㊀辉１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀付言峰１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀李碧侠１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀任守文１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀程金花１ꎬ２ꎬ３(１.江苏省农业科学院畜牧研究所ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.江苏省农业种质资源保护与利用平台ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ３.农业农村部种养结合重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣０８￣１９基金项目:江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[ＪＢＧＳ(２０２１)０９９]ꎻ扬州市重点研发项目(现代农业)(ＹＺ２０２１０３７)ꎻ国家生猪产业技术体系项目(ＣＡＲＳ￣ＰＩＧ￣３５)ꎻ江苏省农业重大新品种创制项目(ＰＺＣＺ２０１７３３)作者简介:赵为民(１９８３－)ꎬ男ꎬ湖北钟祥人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事猪抗病育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｏ＿ｗｅｉｍｉｎ１９８３＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍ通讯作者:程金花ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｈｃｈｅｎｇ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀本研究利用ＲＴ￣ＰＣＲ检测ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因表达在细胞中的亚定位ꎬ采用５ᶄＲＡＣＥ获得ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的转录起始位点ꎻ利用ＣＲＩＳＰＯＲ软件对－３００~０ｂｐ区域的ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子序列设计ｓｇＲＮＡ并构建到ｐｘ３３０载体ꎬ通过转染细胞与Ｔ７Ｅ１酶切验证ｓｇＲＮＡ效率ꎻ利用酶切和亚克隆方法将ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ片段替换ｐｘ３３０载体的Ｃａｓ９序列ꎬ形成重组ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎻ将验证有效的ｓｇＲＮＡ构建到ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎬ形成ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎮ添加不同质量浓度的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理细胞ꎬ以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度ꎮ转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体并用ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄ后进行ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达检测ꎬ同时对ｓｇＲＮＡ在ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子上的结合位点进行Ｓａｎｇｅｒ测序ꎬ以进一步验证上述结合位点是否发生切割ꎮ结果显示ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１主要表达于细胞核ꎬ而在细胞质中几乎不表达ꎮ５ᶄＲＡＣＥ获得了Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１５ᶄ端大约２７０ｂｐ的序列ꎮｑＰＣＲ检测结果显示ꎬ与对照组相比ꎬｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２能够显著抑制Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达(Ｐ<０ ０５)ꎮＳａｎｇｅｒ测序结果表明ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２所在的位点并没有发生碱基缺失和插入ꎮ研究结果为后续进一步研究ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在先天性免疫反应中的功能奠定了基础ꎮ关键词:㊀ＣＲＩＳＰＲꎻｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎻＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因ꎻ猪ꎻ基因沉默中图分类号:㊀Ｓ８５２.２８㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０４￣１０３６￣０７ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｐｉｇＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｂｙＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｓｙｓｔｅｍＺＨＡＯＷｅｉ￣ｍｉｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＤＡＩＣｈａｏ￣ｈｕｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＺｈｅ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＴＵＦｅｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＨｕｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＦＵＹａｎ￣ｆｅｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＢｉ￣ｘｉａ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＲＥＮＳｈｏｕ￣ｗｅｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＧＪｉｎ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ３(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＪｉａｎｇｓｕＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎＰｌａｔｆｏｒｍꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐａｎｄＬｉｖｅｓｔｏｃｋＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｓｕｂ￣ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲ.ＡｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｉｔｅｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｗａｓｏｂ￣ｔａｉｎｅｄｂｙ５ᶄＲＡＣＥ.ＴｈｅＣＲＩＳＰＯＲｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅ￣ｓｉｇｎｔｈｅｓｇＲＮＡｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｗｉｔｈｉｎ－３００~０ｂｐｒｅｇｉｏｎ.ＴｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｓｇＲＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｐｘ３３０ꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓｇＲＮＡｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓａｎｄＴ７Ｅ１ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ.Ｃａｓ９ｆｒａｇ￣ｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｘ３３０ｖｅｃｔｏｒｗａｓｒｅｐｌａｃｅｄｂｙｔｈｅｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣６３０１ＢＳＤｆｒａｇｍｅｎｔｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇｔｏｆｏｒｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒ.ＩｔｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｇＲＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒｔｏｆｏｒｍｔｈｅｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒ.ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ.Ａｎｄｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｍｉｎｉ￣ｍｕｍｌｅｔｈａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓ.ＡｆｔｅｒｓｅｖｅｎｄａｙｓｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｅｌｌｓｗｉｔｈＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ.ＭｅａｎｗｈｉｌｅꎬｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｏｆｓｇＲＮＡｏｎｔｈｅＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｆｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｙｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅａｂｏｖｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｗａｓｃｌｅａｖｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｗａｓｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓꎬｂｕｔｈａｒｄｌｙｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ.Ｔｈｅ５ᶄＲＡＣＥｏｂｔａｉｎｅｄａｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２７０ｂｐａｔｔｈｅ５ᶄｅｎｄｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１.ＴｈｅｑＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１(Ｐ<０.０５).ＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓａｔｔｈｅｓｉｔｅｓｗｈｅｒｅｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＣＲＩＳＰＲꎻｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎻＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅꎻｐｉｇꎻｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ㊀㊀长链非编码ＲＮＡ(Ｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡꎬＬｎ￣ｃＲＮＡ)是一类本身不编码蛋白㊁转录本长度超过２００ｂｐ的ＲＮＡꎮ研究结果表明ＬｎｃＲＮＡ参与了Ｘ染色体失活㊁胚胎发育㊁基因印记㊁癌症㊁免疫等各种细胞生命活动[１￣５]ꎮ近年来大量畜禽相关的ＬｎｃＲＮＡ被鉴定出来ꎬ这些ＬｎｃＲＮＡ紧密参与了畜禽肌肉发育㊁免疫调控㊁繁殖等重要性状[６￣９]ꎬ注释和解析这些ＬｎｃＲＮＡ的功能对进一步挖掘调控畜禽重要经济性状的功能元件具有深远意义ꎮ然而大多数ＬｎｃＲＮＡ定位于细胞核ꎬ而ＲＮＡｉ的工作系统主要在细胞质中发挥作用ꎬ对定位于细胞核的ＬｎｃＲＮＡ作用非常有限[１０￣１２]ꎬ这限制了ＬｎｃＲＮＡ的功能解析ꎮＣＲＩＳＰＲｉ系统通过核酸酶活性失活的Ｃａｓ９(ｄＣａｓ９)和ｓｇＲＮＡ的复合物结合到某个基因的转录起始位点(ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅꎬＴＳＳ)附近ꎬ物理性阻碍ＲＮＡ聚合酶的通过ꎬ从而导致基因沉默[１３]ꎮ通过ｄＣａｓ９融合基因抑制结构域如ＫＲＡＢ(Ｋｒüｐｐｅｌ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｏｘ)ꎬ形成ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ复合结构ꎬ可进一步提高转录抑制的效率[１４￣１６]ꎮＬｉｕ等[１７]利用ＣＲＩＳＰＲｉ系统鉴定了数百个与细胞生长相关的Ｌｎ￣ｃＲＮＡꎬＫｌａｎｎ等[１８]利用ＣＲＩＳＰＲｉ系统鉴定了大量与基因表达调控相关的功能元件ꎮＣＲＩＳＰＲｉ系统在抑制基因表达上也呈现出较强的特异性[１９￣２０]ꎬ是研究ＬｎｃＲＮＡ功能的新一代工具ꎮＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１是在研究肌细胞分化时发现的一个长链非编码ＲＮＡ[２１]ꎬ其作为核心组分主要参与细胞亚结构旁斑(Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ)的形成ꎬ在细胞分化ꎬ癌症发生和病毒感染等生物学过程中发挥着重要作用[２１￣２３]ꎮ本课题组前期研究结果表明猪Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因在脂蛋白刺激下表达显著上调ꎬ表明其在Ｔｏｌｌ样受体２(ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＴＬＲ２)介导的先天性免疫反应中可能起到调控作用[２４]ꎮ本研究利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统来抑制Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达ꎬ为后续进一步研究其在先天性免疫反应中的功能奠定基础ꎮ１㊀材料和方法１.１㊀细胞、菌株与质粒Ｔｒａｎｓ５ａ感受态菌株购于北京擎科生物科技有限公司ꎬＬｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体由华中农业大学赵长志惠赠ꎬ猪ＰＫ１５细胞㊁ｐｘ３３０载体由本实验室保存ꎮ１.２㊀试剂ＲＮＡ提取试剂盒购于南京诺唯赞医疗科技有限公司ꎻＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＮＡｍａｒｋｅｒ购于北京擎科生物科技有限公司ꎻ内切酶ＢｂｓＩ㊁Ｔ７Ｅ１酶购于ＮＥＢ公司ꎻＰＣＲ酶㊁Ｔ载体㊁末端转移酶ＴｄＴ㊁Ｔ４连接酶㊁ｑＰＣＲ试剂㊁反转录试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司ꎻ无内霉毒素质粒试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司ꎻＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳＨＣｌ(灭瘟素Ｓ)购于南京碧云天生物技术有限公司ꎻＤＮＡ纯化回收试剂盒购于ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈＺｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ＿安诺伦(北京)生物科技有限公司公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁青链霉素购于武汉博士德生物工程有限公司ꎻ胎牛血清购于ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ(ＢＩ)公司ꎻｏｐｔｉ￣ＭＥＭ和ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司ꎮ１.３㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的亚细胞表达分布待细胞密度长至８０％左右ꎬ胰酶消化细胞ꎬ用预冷７３０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因ＰＢＳ清洗两遍后加入ＢｕｆｆｅｒＡ(１０ｍｍｏｌ/Ｌｔｒｉｓ￣ｃｌꎬ１０ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ０ ５％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ￣６３０)ꎬ冰上放置５ｍｉｎꎬ离心后上清液用于细胞质ＲＮＡ的提取ꎮ用ＢｕｆｆｅｒＡ洗涤沉淀２次ꎬ沉淀用于细胞核ＲＮＡ的提取ꎮ１.４㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的５ᶄ末端快速扩增(５ᶄＲＡＣＥ)㊀㊀基于前期测序获得部分序列结果[２４]ꎬＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的５ᶄ末端快速扩增过程如下:利用ｏｌｉ￣ｇｏｄＴ反转录ｃＤＮＡ第一链ꎬ然后再利用ＴｄＴ酶进行５ᶄ末端ｄＣ￣ｔａｉｌｉｎｇꎬ回收纯化后ꎬ用引物５Ｐ(５ᶄ￣ＡＡＧ￣ＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ￣３ᶄ)和５ᶄ末端的特异性引物５ᶄＧＳＰ(５ᶄ￣ＣＴＧＣＣＴＣ￣ＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧ￣３ᶄ)扩增其５ᶄ末端ꎮＰＣＲ扩增条件:９５ħ５ｍｉｎꎬ９５ħ３０ｓꎬ６５ħ(－０.５ħ)４５ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ１５个循环ꎻ９５ħ１ｍｉｎꎬ６０ħ４５ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ２０个循环ꎻ７２ħ３ｍｉｎꎮ扩增的ＰＣＲ产物经过ＤＮＡ纯化回收后与Ｔ载体连接ꎬ然后转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证ꎮ１.５㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子区域的ｓｇＲＮＡ设计㊀㊀针对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子区(－３００~０ｂｐ)利用ＣＲＩＳＰＯＲ(ｈｔｔｐ://ｃｒｉｓｐｏｒ.ｔｅｆｏｒ.ｎｅｔ/)在线设计２对ｓｇＲＮＡꎮ设计原则为选取ｃｆｄＳｐｅｃＳｃｏｒｅ>８０ꎬＤｏｅｎｃｈᶄ１６￣Ｓｃｏｒｅ>５０的ｓｇＲＮＡꎮ１.６㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ质粒构建依据ｓｇＲＮＡ的序列合成反向互补的单链寡核苷酸ｓｇＦ和ｓｇＲꎬ并在ｓｇＦ的５ᶄ端添加ＣＡＣＣＧꎬ在ｓｇＲ的５ᶄ端添加ＡＡＡＣꎮ９５ħ变性５ｍｉｎꎬ室温冷却ꎬ使ｓｇＦ和ｓｇＲ退火互补ꎮＢｂｓⅠ酶切ｐｘ３３０载体ꎬ回收纯化后与退火的寡核苷酸连接ꎬ转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证与无内霉毒素质粒提取ꎮ１.７㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体构建通过酶切ｐｘ３３０载体ꎬ将Ｃａｓ９序列替换为多克隆位点ꎬ然后再将ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ插入到该多克隆位点ꎮ具体方法如下:首先以ｐｘ３３０载体为模板ꎬ通过引物Ｆ:５ᶄ￣ＴＴＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣ￣ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡ￣３ᶄ和Ｒ:５ᶄ￣ＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴ￣３ᶄ进行ＰＣＲ扩增ꎮＰＣＲ产物包含引入了多个酶切位点(引物Ｆ下划线部分)的ｂＧＨｐｏｌｙ(Ａ)片段ꎮ然后对ＰＣＲ产物和ｐｘ３３０载体分别进行ＡｇｅⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切并进行连接ꎬ转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证与质粒提取ꎮ此重组后的载体为ｐｘ３３０￣ＭＣＳꎮ将筛选好的ｓｇＲＮＡ先构建到ｐｘ３３０￣ＭＣＳꎬ为ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳꎮ然后对ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳ和Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ进行ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎬ将Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体中的ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ连接到ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳ中ꎬ形成重组载体ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎮ１.８㊀ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度摸索猪ＰＫ１５细胞铺板１２孔板ꎬ２４ｈ后待细胞密度达到８０％左右ꎬ分别添加０μｇ/ｍｌ㊁１μｇ/ｍｌ㊁３μｇ/ｍｌ㊁４μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎬ每个质量浓度处理３次重复ꎬ每２ｄ换１次ꎬ在第７ｄ时观察细胞的死亡情况ꎬ使细胞致死的最小剂量为后续的药筛质量浓度ꎮ１.９㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的沉默猪ＰＫ１５细胞在转染前１ｄ铺１２孔板ꎬ转染时密度大约７０％ꎮ对照组转染ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎬ实验组分别转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ１￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ和ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ２￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ质粒ꎬ４８ｈ后ꎬ利用ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄ后进行ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达检测ꎮ１.１０㊀定量ＰＣＲ１μｇＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎬ使用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５进行ｑＰＣＲ扩增ꎮ对照组与试验组各３个生物学重复ꎬ每个样品重复３次ꎮ采用三步法扩增ꎬ程序简要如下:预变性９５ħ２ｍｉｎꎬ９５ħ１５ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ４０个循环ꎮ数据均以平均值ʃ标准差表示ꎮ使用单因素方差分析各组之间的差异显著性ꎮ引物序列见表１ꎮ表１㊀引物序列信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ基因㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增长度(ｂｐ)ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１Ｆ:ＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＧ６０１６５Ｒ:ＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＨＰＲＴＦ:ＣＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡ６０１９１Ｒ:ＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣ２㊀结果与分析２.１㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达的亚细胞定位利用低渗溶液将细胞总ＲＮＡ分为细胞质和细８３０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期胞核ＲＮＡꎬＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达于细胞核ꎬ在细胞质中几乎不表达(图１)ꎮＨＰＲＴ作为细胞内参基因ꎬ其在细胞核内转录后会向细胞质中运输ꎬ其ｍＲＮＡ在细胞质中的表达量多于细胞核ꎮ图１结果显示ＨＰＲＴ在细胞质的表达量高于细胞核ꎬ符合其表达定位ꎮ图１㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在细胞质与细胞核中的表达Ｆｉｇ.１㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓ２.２㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１转录起始位点为了确定ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的转录起始位点ꎬ通过５ᶄＲＡＣＥ对其５ᶄ端序列进行了克隆ꎬ图２结果显示得到大约２７０ｂｐ的条带ꎬ与预期相符ꎮ图２㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的５ᶄＲＡＣＥ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀５ᶄＲＡＣＥａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１２.３㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区的ｓｇＲＮＡ设计与效率验证㊀㊀通过ＣＲＩＳＰＯＲ在线设计程序ꎬ对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区(－３００~０ｂｐ)设计了２对ｓｇＲＮＡꎬ分别为ｓｇＲＮＡ１:５ᶄ￣ＣＣＧＡＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡ￣３ᶄꎬＰＡＭ为ＧＧＧꎬ位置约－２００ｂｐꎬＤｏｅｎｃｈ１６￣Ｓｃｏｒｅ参数为６３ꎻｓｇＲＮＡ２:５ᶄ￣ＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴ￣ＧＡＣＧ￣３ᶄꎬＰＡＭ为ＣＧＧꎬ位置约－１５０ｂｐꎬＤｏｅｎｃｈ１６￣Ｓｃｏｒｅ参数为６３ꎮ２.４㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体的酶切验证图３显示构建的ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ经过ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后ꎬ得到约４２００ｂｐ的ｐｘ３３０骨架和５０００ｂｐ的ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ片段ꎬ与预期相符ꎮＭ:ＤＮＡ相对分子质量标准样品ꎻ１:ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ１￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎻ２:ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ２￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎮ图３㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ质粒的酶切鉴定Ｆｉｇ.３㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｐｌａｓｍｉｄｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ２.５㊀ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度的确定图４结果显示ꎬ在加ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ培养７ｄ后ꎬ１μｇ/ｍｌ质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理的细胞只有部分细胞死亡(图４Ｂ)ꎬ而３μｇ/ｍｌ与４μｇ/ｍｌ质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理的的细胞几乎全部死亡(图４Ｃ㊁图４Ｄ)ꎬ因此在后续的筛选中ꎬＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度为３μｇ/ｍｌꎮ图４Ａ为阴性对照组ꎬ细胞生长正常ꎮ２.６㊀ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达㊀㊀细胞转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ(试验组)与ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ(对照组)３６ｈ后ꎬ添加Ｂｌａｓｔｉ￣ｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄꎬ对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达进行ｑＰＣＲ检测ꎮ结果(图５)显示ꎬ与对照组相比ꎬｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２分别使ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达下降了７３％和５５％ꎬ达到显著水平(Ｐ<０ ０５)ꎮ９３０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因Ａ:阴性对照组ꎻＢ:１μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎻＣ:３μｇ/ｍｌ的Ｂｌａｓｔｉｃｉ￣ｄｉｎＳꎻＤ:４μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎮ图４㊀不同质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ对细胞的致死效果Ｆｉｇ.４㊀ＴｈｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢｌａｓｔｉｃｉ￣ｄｉｎＳｏｎｃｅｌｌｓ∗表示与对照组相比差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ图５㊀ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的沉默效果Ｆｉｇ.５㊀ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｏｎＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅ２.７㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区的切割验证为了进一步验证ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统中的ｓｇＲＮＡ是否会切割其结合位点ꎬ利用Ｓａｎｇｅｒ测序对ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２的结合位点进行分析ꎮ结果(图６)显示试验组中ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２的结合位点和对照组一致ꎬ其序列没有发生碱基缺失或者插入ꎮ３㊀讨论近年来随着重测序以及功能基因组学的发展ꎬ猪相关的ＬｎｃＲＮＡ与增强子等被大量鉴定出来[６ꎬ２５]ꎮＣＲＩＳＰＲｉ与ＲＮＡｉ和ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９敲除相比ꎬ在研究细胞核内相关的ＬｎｃＲＮＡ或表达增强子(Ｅｎｈａｎｃｅｒ￣ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡｓꎬｅＲＮＡｓ)上有着较大优势[１２ꎬ１５]ꎬ并且也可以进行高通量的筛选研究ꎬ为解析猪功能基因组以及挖掘重要调控元件奠定基础ꎮＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在最初发现时定位于小鼠肌细胞核内ꎬ作为核心组分主要参与细胞亚结构旁斑(Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ)的形成[２１]ꎮ本试验发现猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１几乎只表达于细胞核ꎬ表明ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达定位在物种间相对保守ꎮ由于Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体较大(约１４ｋｂ)ꎬ如果再联合转染ｓｇＲＮＡ表达载体ꎬ会导致转染效率低ꎬ从而会影响基因沉默效果ꎮ本研究通过酶切与亚克隆构建了ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ这种 Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ 载体ꎬ将ｓｇＲＮＡ和ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ表达元件都整合到一个载体ꎬ大幅度缩减了载体ꎬ提高了表达效率[２６￣２７]ꎬ从而进一步提升沉默效果ꎮ位于ＴＳＳ不同位置的ｓｇＲＮＡ对ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ的沉默效果具有决定性作用[１５ꎬ２８]ꎮ因此本研究首先利用５ᶄＲＡＣＥ确定了ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的ＴＳＳꎮ由于大多数编码ＬｎｃＲＮＡ基因ꎬ其表达水平相对于编码蛋白基因较低[２９￣３１]ꎬ确定这些重要而表达水平较低的ＬｎｃＲＮＡ的ＴＳＳ并不容易ꎬ这也是利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默ＬｎｃＲＮＡ一个限制因素ꎮＴＳＳ附近启动子区对基因表达水平有重要影响ꎬ其区域内碱基的删除或插入会影响其基因的表达[３２￣３４]ꎮ尽管ｄＣａｓ９呈现失活的状态ꎬ并不会切割ｓｇＲＮＡ的结合位点[１３]ꎬ为了进一步验证ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达下调不是由于ｓｇＲＮＡ切割ＴＳＳ附近启动子区造成的ꎬ本研究利用Ｓａｎｇｅｒ测序对试验组ｓｇＲＮＡ的结合位点进行序列分析ꎬ结果显示其结合位点并没有发生删除或者插入ꎬ表明ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达下调是通过ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统来实现ꎮ本研究获得了ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的ＴＳＳ位点ꎬ在其附近启动子区设计并验证了２对有效ｓｇＲＮＡꎬ通过构建 Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ 载体ꎬ利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统有效沉默了猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达ꎮ参考文献:[１]㊀ＬＯＤＡＡꎬＨＥＡＲＤＥ.ＸｉｓｔＲＮＡｉｎａｃｔｉｏｎ:ｐａｓｔꎬｐｒｅｓｅｎｔꎬａｎｄｆｕ￣ｔｕｒｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔꎬ２０１９ꎬ１５(９):ｅ１００８３３３. [２]㊀ＫＵＡＮＧＬＤꎬＬＥＩＭꎬＬＩＣＹꎬｅｔａｌ.Ｗｈｏｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓａｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｅｍｂｒｙｏｍｏｒｐｈｏ￣ｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｒａｂｂｉｔｓ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２０ꎬ１１２(３):２２０３￣２２１２.０４０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图６㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区ｓｇＲＮＡ结合位点的Ｓａｎｇｅｒ测序峰图Ｆｉｇ.６㊀ＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｅａｋｍａｐｏｆｓｇＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｐｉｇＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１[３]㊀ＭＡＣＤＯＮＡＬＤＷＡꎬＭＡＮＮＭＲＷ.ＬｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌｉｔｙｉｎｉｍｐｒｉｎｔｅｄｄｏｍａｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔꎬ２０２０ꎬ１６(８):ｅ１００８９３０.[４]㊀ＬＩＵＢꎬＳＵＮＬꎬＬＩＵＱꎬｅｔａｌ.ＡｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＮＦ￣κＢｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｂｌｏｃｋｓＩκＢｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ２７(３):３７０￣３８１.[５]㊀ＸＵＨꎬＪＩＡＮＧＹꎬＸＵＸꎬｅｔａｌ.ＩｎｄｕｃｉｂｌｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡｓｒｏｓ１ｐｒｏｍｏｔｅｓＩＦＮ￣γ￣ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｓｂｙｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｓｔａｔ１ｍＲＮＡ[Ｊ].ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１９ꎬ２０(１２):１６２１￣１６３０.[６]㊀ＪＩＮＬꎬＴＡＮＧＱꎬＨＵＳꎬｅｔａｌ.ＡｐｉｇＢｏｄｙＭａｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｒｅ￣ｖｅａｌｓｄｉｖｅｒｓｅｔｉｓｓｕｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):３７１５.[７]㊀ＧＡＯＪꎬＰＡＮＹꎬＸＵＹꎬｅｔａｌ.Ｕｎｖｅｉｌｉｎｇｔｈｅｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｐｒｏｆｉｌｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ￣ｉｎ￣ｆｅｃｔｅｄｐｏｒｃｉｎｅａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ２２(１):１７７.[８]㊀ＬＩＵＪꎬＺＨＯＵＹꎬＨＵＸꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｐｒｏｆｉｌｅｏｆＬｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｄｕｒｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ２０２１ꎬ１２:６６０３７０.[９]㊀ＤＵＺＱꎬＥＩＳＬＥＹＣＪꎬＯＮＴＥＲＵＳＫꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｐｅ￣ｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｐｉｇｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓｕｓｉｎｇＲＮＡ￣ｓｅｑ[Ｊ].ＡｎｉｍＧｅｎｅｔꎬ２０１４ꎬ４５(２):１９８￣２０４.[１０]ＤＥＲＲＩＥＮＴꎬＪＯＨＮＳＯＮＲꎬＢＵＳＳＯＴＴＩＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＧＥＮＣＯＤＥｖ７ｃａｔａｌｏｇｏｆｈｕｍａｎｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ:ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｒｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２０１２ꎬ２２(９):１７７５￣１７８９.[１１]ＦＡＴＩＣＡＡꎬＢＯＺＺＯＮＩＩ.Ｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ:ｎｅｗｐｌａｙｅｒｓｉｎｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔꎬ２０１４ꎬ１５(１):７￣２１.[１２]ＢＯＥＴＴＣＨＥＲＭꎬＭＣＭＡＮＵＳＭＴ.Ｃｈｏｏｓｉｎｇｔｈｅｒｉｇｈｔｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｊｏｂ:ＲＮＡｉꎬＴＡＬＥＮꎬｏｒＣＲＩＳＰＲ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ５８(４):５７５￣５８５.[１３]ＱＩＬＳꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬｅｔａｌ.ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５２(５):１１７３￣１１８３.[１４]ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＭＯＲＳＵＴＬꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅ￣ｄｉａｔｅｄｍｏｄｕｌａｒＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｅｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５４(２):４４２￣４５１.[１５]ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＨＯＲＬＢＥＣＫＭＡꎬＡＤＡＭＳＯＮＢꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１４ꎬ１５９(３):６４７￣６６１.[１６]ＡＬＥＲＡＳＯＯＬＮꎬＳＥＧＡＬＤꎬＬＥＥＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔＫＲＡＢｄｏｍａｉｎｆｏｒＣＲＩＳＰＲｉａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＮａｔＭｅｔｈ￣ｏｄｓꎬ２０２０ꎬ１７(１１):１０９３￣１０９６.[１７]ＬＩＵＳＪꎬＨＯＲＬＢＥＣＫＭＡꎬＣＨＯＳＷꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲｉ￣ｂａｓｅｄｇｅ￣ｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｌｏｃｉｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ３５５(６３２０):７１１１.[１８]ＫＬＡＮＮＴＳꎬＢＬＡＣＫＪＢꎬＣＨＥＬＬＡＰＰＡＮＭꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｅｎａｂｌｅｓｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].ＮａｔＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１７ꎬ３５(６):５６１￣５６８.[１９]ＴＨＡＫＯＲＥＰＩꎬＤＩＰＰＯＬＩＴＯＡＭꎬＳＯＮＧＬꎬｅｔａｌ.ＨｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｂｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓｆｏｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｄｉｓｔａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１５ꎬ１２(１２):１１４３￣１１４９.[２０]ＭＡＮＤＥＧＡＲＭＡꎬＨＵＥＢＳＣＨＮꎬＦＲＯＬＯＶＥＢꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ１４０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｎｄｕｃｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｉＰＳＣｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２０１６ꎬ１８(４):５４１￣５５３. [２１]ＳＵＮＷＯＯＨꎬＤＩＮＧＥＲＭＥꎬＷＩＬＵＳＺＪＥꎬｅｔａｌ.Ｍｅｎｅｐｓｉｌｏｎ/ｂｅｔａｎｕｃｌｅａｒ￣ｒｅｔａｉｎｅｄｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓａｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｐｏｎｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２００９ꎬ１９(３):３４７￣３５９.[２２]ＩＭＡＭＵＲＡＫꎬＩＭＡＭＡＣＨＩＮꎬＡＫＩＺＵＫＩＧꎬｅｔａｌ.Ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄ￣ｉｎｇＲＮＡＮＥＡＴ１￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＳＦＰＱｒｅｌｏｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｔｏｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｍｅｄｉａｔｅｓＩＬ８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｐｏｎｉｍｍｕｎｅｓｔｉｍｕｌｉ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ５３(３):３９３￣４０６.[２３]ＬＩＫꎬＹＡＯＴꎬＺＨＡＮＧＹꎬｅｔａｌ.ＮＥＡＴ１ａｓａｃｏｍｐｅｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅ￣ｎｏｕｓＲＮＡｉｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃａｎｃｅｒｓ:ｒｏｌｅꎬｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ[Ｊ].ＩｎｔＪＢｉｏｌＳｃｉꎬ２０２１ꎬ１７(１３):３４２８￣３４４０.[２４]赵为民ꎬ方晓敏ꎬ涂㊀枫ꎬ等.猪单核源性巨噬细胞受ＦＳＬ￣１刺激后ｌｎｃＲＮＡｓ的鉴定与特征分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１９ꎬ３５(２):３４６￣３５６.[２５]ＺＨＡＯＹꎬＨＯＵＹꎬＸＵＹꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｉｓ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｐｉｇｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):２２１７.[２６]ＳＡＫＵＭＡＴꎬＮＩＳＨＩＫＡＷＡＡꎬＫＵＭＥＳꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ２０１４ꎬ４:５４００.[２７]ＣＥＢＯＬＡＩ.Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９Ｖｅｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌꎬ２０２１ꎬ２３５１:３２１￣３３４. [２８]ＲＡＤＺＩＳＨＥＵＳＫＡＹＡＡꎬＳＨＬＹＵＥＶＡＤꎬＭＵＬＬＥＲＩꎬｅｔａｌ.Ｏｐｔｉ￣ｍｉｚｉｎｇｓｇＲＮＡｐｏｓｉｔｉｏｎｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓꎬ２０１６ꎬ４４(１８):ｅ１４１.[２９]ＬＡＭＭＴꎬＬＩＷꎬＲＯＳＥＮＦＥＬＤＭＧꎬｅｔａｌ.ＥｎｈａｎｃｅｒＲＮＡｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｍｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉꎬ２０１４ꎬ３９(４):１７０￣１８２.[３０]ＣＨＥＮＨꎬＤＵＧꎬＳＯＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｆｒｏｍｅｎ￣ｈａｎｃｅｒｓ:ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｅｎｈａｎｃｅｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１５(３):２０１￣２０７.[３１]ＮＯＪＩＭＡＴꎬＰＲＯＵＤＦＯＯＴＮＪ.ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＬｎｃＲＮＡｂｉｏｇｅｎｅ￣ｓｉｓａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｎａｓｃｅｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０２２ꎬ２３(６):３８９￣４０６.[３２]ＡＯＹＡＧＩＮꎬＷＡＳＳＡＲＭＡＮＤＡ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｄｒｏｓｏｐｈｉｌａＴＡＦ(Ⅱ)６０[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２００１ꎬ２１(２０):６８０８￣６８１９.[３３]ＤＡＮＩＮＯＹＭꎬＥＶＥＮＤꎬＩＤＥＳＥＳＤꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ:ａｔｔｈｅｈｅａｒｔｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａꎬ２０１５ꎬ１８４９(８):１１１６￣１１３１.[３４]ＢＵＴＬＥＲＪＥꎬＫＡＤＯＮＡＧＡＪＴ.ＴｈｅＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅⅡｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ:ａｋｅｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｅｓＤｅｖꎬ２００２ꎬ１６(２０):２５８３￣２５９２.(责任编辑:成纾寒)２４０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期。
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准评 审 。来 自湖南 省 石化 行 管 办 、湖 南 省 质监 局 、
填 补 了省 内空 白。 专 家建 议 企 业 早 日按标 准 生 产
投 产 ，为 “ 三农 ” 服务 做 出积极 贡 献 。
湖南 省 农 药 检 定 所 、 湖南 省 农 药 工 业 协会 的 专 家
需 求 ，也 是 我 省 生 物农 药 产 业 和 生 物 防 治 技 术 发 展 的 一 个 平 台 。 为 此 ，江 苏 省 科 技 厅 的 支 持 下 ， 南 京 农 业 大 学 、江 苏省 农 业 科 学 研 究 院 、江 苏 省
才 培 养 等 方 面 的 不 同 优 势 ，积 极 探 索 率 先 落 实 国 家 和 省 自主 创 新 政 策 ，承 担 国家 和 省 重 大 技 术 创
种 ，获 得发 明 专利 １ 。 项
二 塞
垫 窭窭 幛 睁一 事 季 苎 坐畦 一事 审 声 事
学 研 相 结 合 的技 术 创 新 体 系 ．推 进 我 省 产 业 技 术 创 新 战 略联 盟 的构 建 和 发 展 。 以科 学 发 展 观 为 指
为 了 推 动生 物 农 药 产业 在 我 省 更 好 、更 快 的 发 展 ，加 快 建 立 以企 业 为 主 体 、市 场 为 导 向 、产
药 产 业 技 术 创 新 战 略 联 盟 ” 筹 备 工 作 进 入 实 质 性
阶 段 。“ 苏 省 生 物 农 药 产 业 技 术 创 新 战 略 联 盟 ” 江 的 成 立 旨在 围绕 产 业 技 术 持 续 创 新 链 ．发 挥 各 联 盟 成 员 在 科 研 、开 发 、产 业 化 、市 场 经 营 以 及 人
２ ８
农 药研 究 与应用 ＡＧ ０ ＨＥ Ｃ Ｌ Ｅ Ｅ Ｒ Ｈ ＆ Ａ Ｐ Ｉ Ａ Ｉ Ｎ Ｒ Ｃ ＭＩ Ａ Ｓ Ｒ Ｓ Ａ Ｃ Ｐ ＬＣ Ｔ Ｏ
第 １卷 ５
导 ，构 建 一 个 江苏 省 “ 物农 药 产 业 技 术 创 新 战 生
略联盟” ，是建 设 资 源节 约 性 和 环境 有 好 型 社会 的
寿 螺 效 果 良好 ，在 推 荐 使 用 计 量 下 水 稻 安
全 ．不 伤 禾苗 。
区 ，危 害 面积 达 ６ ０ 万 亩 田地 。祥 隆化 工 已投 资 ４多 ４５ ０ 元 建 成 年 产 ３ 螺 枯 威 的生 产 装 置 。产 业 ０ 万 万 化 达产 后 可满 足 国内灭 杀福 寿 螺 的用 药需 求 。
代 技 术及 其 安全 性 研究 日前 通过 专家 验 收 。 据 介 绍 。该 项 研 究 以 松 树 油 和 棕 榈 油 、助 溶 剂 、活 性 剂 为材 料 ，配 制 甲维 盐 乳 油 ，以植 物 油
农 药 后蔬 菜 的生 长 、农 药 残 留及 药 害 情 况 。研 究 所 已研 制 出以植 物 油替 代 二 甲苯 为 溶 剂 的助 溶 剂３
司组 织 实施 的 《 ０ １ ％螺 枯 威颗 粒 剂》 １ ％螺枯 威 、《 Ｏ
可湿 性 粉剂 》 两个 生 物农 药制 剂 标 准 在 长 沙 通 过 由湖 南 省 石油 化学 标 准技 术 委 员 会 组 织 的 省 级 标
益 ，对 促 进 湖 南 农 药 工业 的产 业 调 整 、产 品 创 新
｝逢 ’
Ｉ 力
三 话
替代 二 甲苯 。项 目组 研 究 了植 物 油 替 代 二 甲苯 对
农 药 产 品稳 定 性 、杀 虫 活 性 的 影 响 ． 以及 使 用 该
由福 建 省农 药 检 定 所 和 福 建 省 农 业 科 学 院植
物 保 护 研 究 所 共 同承 担 的农 药 中二 甲苯 植 物 油 替
抗 寒 、抗 病 虫 、抗 盐 碱 等 能 力 。可 有 效 调 控 植 物
的根／ 生 长 ，对提 高 农 作物 的品质 、产 量具 有 重 冠 要作用。
Ｓ 诱 抗 素 原 药 规模 化 生 产装 置 ，标 志着 我 国新 型 一 生 物 农药 产 业化 取 得重 大 突破 。 Ｓ 诱 抗 素 是平 衡 植 物 内源 激 素 和有 关 生 长 活 一 性 物 质 代 谢 的关 键 因子 ，具 有 促 进 植 物 平 衡 吸 收 水 、肥 和 协 调 体 内代 谢 和 增 强 植 物 抗 旱 、抗 热 、
Ｓ 诱 抗 素先 后 被 国家 知 识 产 权 局 列 入 全 国首 一 批 １个 国家 专 利 战 略 实 施 推 进 工 程 项 目和 四川 省 ０ 重 点 支 持 战 略 产 业 项 目 ，具 有 广 阔 的 市 场 前 景 ．
将 在 我 国形 成 一个 新型 生 物农 药产 业 。
一
致 认 为 ：两个 生 物农 药产 品标 准 指 标 制 定 科 学
８ ２日．四川 龙 蟒福 生 科 技公 司眉 山生 物产 月２
业 基 地 竣 工 投 产 。其 自主 开 发 的 年 产 ２ 吨 新 型 生 ０ 物 农 药 Ｓ 诱 抗 素 成 功 实 现 产业 化 。 这是 全 球 首 套 一
目前 。福 寿 螺 已侵 入 我 国１ 个 省 （ ） 自治 ３ 市
》 置
．． 三竺 三
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合 理 、分 析 方 法 先 进 可 行 。产 品 按 标 准 生 产 投 产 后 ，可 取 得 良好 的 经 济 效 益 、环 保 效 益 、社 会 效
２ １ 年７ ２ ０ １ 月 ９日，由岳 阳迪普 化 工 技 术有 限公
新 任 务 的 组 织模 式 和 运 行 机 制 ，建 立 产 学 研 合 作
农 药 检 定 所 等 高 校 科 研 院所 联 合 全 省 重 点 农 药 企 业 等 单 位 筹 备 组 建 江 苏省 “ 物 农 药 产 业 技 术 创 生
新 战 略联 盟 ” 。筹 备会 于 ８ １ 月 日在 南 京 召 开 。参 会 代 表 就 江 苏生 物 农 药发 展 现 状 、 特 点 和 未 来 发 展